单环刺螠纤溶酶Ⅲ基因克隆及原核表达

单环刺螠(Urechis unicinctus)纤溶酶(UFE)是由本实验室分离纯化得到的一组有抗凝和纤溶活性及较好生物安全性的纤溶酶。本研究为获得重组表达的UFE,根据该纤溶酶Ⅲ的(UFEⅢ)N端测序结果,设计简并引物,扩增出该蛋白的部分基因编码序列,利用5′-RACE PCR获得(UFEⅢ)的cDNA全长序列863bp,其中开放阅读框编码261个氨基酸。通过生物信息学分析其为丝氨酸蛋白酶家族成员,并与之前实验室提取的UFEⅢ进行同源性分析,推测其为一组同工酶。以PMD18-T-UFE为模板,扩增单环刺螠纤溶酶的成熟肽片段,构建重组表达载体pET32a-UFE和pET28a-UFE,转入Rosetta2(DE3)菌中诱导表达,UFEⅢ分别以可溶蛋白和包涵体的形式得到了表达。     

单环刺螠纤溶酶Ⅱ的基因克隆

单环刺螠纤溶酶(UFE)是由本实验室分离纯化出的1组包括4个分子量组分的纤溶酶,各个组分均有提高受试机体继发性纤溶活性的能力,并具有显著的抗凝活性和纤溶活性以及较好的生物安全性。根据该纤溶酶Ⅱ的N-末端氨基酸序列设计简并引物,通过3-’RACE PCR获得该组分蛋白质的部分编码序列,进一步通过5-’RACE PCR获得单环刺螠纤溶酶基因全长cDNA编码序列906 bp,其中开放阅读框795 bp。该基因全长cDNA BLASTx比对结果表明,其编码产物与丝氨酸蛋白酶家族成员具有较高的同源性,通过PROSITE的ScanProsite软件分析得出,该蛋白质含有1个trypsindomain(第32-264位),在NCBI的CDD数据库中分析结果显示该酶是1种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。     

单环刺螠纤溶酶Ⅱ的基因克隆

单环刺螠纤溶酶( UFE)是由本实验室分离纯化出的l组包括4个分子量组分的纤溶酶,各个组分均有提高受试机体继发性纤溶活性的能力,并具有显著的抗凝活件和纤溶活性以及较好的生物安全性.根据该纤溶酶Ⅱ的N-末端氨基酸序列设计简并引物,通过3'-RACE PCR获得该组分蛋白质的部分编码序列,进一步通过5’-RACE PCR获得单环刺螠纤溶酶基因全长cDNA编码序列906 bp,其中开放阅读框795 bp.该基因全长cDNA BLASTx比对结果表明,其编码产物与丝氨酸蛋白酶家族成员具有较高的同源性,通过PROSITE的ScanProsite软件分析得出,该蛋白质含有1个trypsin domain(第32-264位),在NCBI的CDD数据库中分析结果显示该酶是1种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶.     

单环刺螠GATAB2的基因克隆及表达分析

GATA家族是经典的转录因子家族,因其能特异性的与核苷酸序列T/A(GATA)A/G结合而得名.前期研究在单环刺螠(Urechis unicinctus)中筛选到GATA家族成员GATA B2与硫代谢关键酶硫醌氧化还原酶(Sulfide quinone oxidoreductase,sqr)启动子高转录活性区相互作用....     

单环刺螠纤溶酶的分离纯化及其性质的初步研究

从单环刺中制得单一组分的纤溶活性纤溶酶,并对其性质进行初步研究.单环刺体组织液经离心,超滤,离子交换层析,凝胶过滤等方法进行分离纯化,制得单一洗脱峰酶组分,经Native-PAGE电泳分析,SDS-PAGE电泳分析和飞行质谱分析,鉴定了酶制品纯度和相对分子量,进行了体外溶血栓试验.所得纯品UFEIa水解酪蛋白的比活力为442.0 U/mg,纯化倍数为12.1倍,回收率为27.0%.UFEIa为单一组分,相对分子量约23 800 Da.体外溶血栓实验表明此纤溶活性蛋白酶与蚓激酶相比具有很好的溶血栓活性.     

单环刺螠纤溶酶UFEⅠ药效作用和免疫原性的初步研究

为评价单环刺螠纤溶酶(UFEⅠ)的抗凝血和抗血栓形成作用,并对其免疫原性进行初步研究.文中通过小鼠血液凝固时间实验和大鼠颈动脉血栓形成模型研究UFE Ⅰ抗凝血和抗血栓作用.用纯UFE Ⅰ为抗原免疫小鼠,间接ELISA法测定特异性抗体的动态变化及效价.结果UFE Ⅰ能明显延长小鼠凝血时间,有效抑制大鼠体内的血栓形成,并显著降低大鼠纤维蛋白原含量(FIB),延长活化部分凝血活酶时间(APTT).免疫原性的研究结果为UFE Ⅰ末次免疫小鼠后,产生微量特异性抗体,且抗体水平呈现先升后降的动态变化;方阵法确定了ELISA的优化条件,测定UFE Ⅰ免疫后产生的抗体效价为1∶1 280.本文研究显示,单环刺螠纤溶酶UFEⅠ具有显著的抗凝血和抗血栓形成作用,在小鼠体内产生一过性抗体,但对动物机体不造成负面影响.