人工养殖半滑舌鳎卵巢发育及其产卵类型研究

研究了人工养殖半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)卵巢发育组织学的季节变化及其与性成熟系数(gonadosomatic index,简称GSI)和肝质量指数(hepatosomatic index,简称HSI)的关系。结果表明,半滑舌鳎成熟鱼卵巢发育经历Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期、Ⅵ期,再到重复发育Ⅱ期;人工养殖条件下,3~5月份大部分鱼卵巢处于Ⅱ期,从6月份开始,其卵母细胞内开始沉积卵黄颗粒,9~11月份,卵母细胞内卵黄颗粒充盈整个胞质,基本达到生长成熟,排卵后至翌年2月份,卵巢进入了退化吸收Ⅵ期或重复发育Ⅱ期;繁殖期GSI达到最高峰;产卵后或重复发育Ⅱ期,GSI显著下降,此时HSI显著升高至全年最高峰;半滑舌鳎在1 a中只有1个繁殖期,进行分批产卵。     

半滑舌鳎肾脏组织结构与细胞种类研究

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是中国重要的海水养殖鱼类品种,目前对于其肾脏结构与细胞种类的研究较少。本研究以半滑舌鳎肾脏为研究对象,通过切片技术、免疫组织化学与显微镜观察,描述半滑舌鳎肾脏结构与细胞分布情况。结果显示,半滑舌鳎的肾脏可以分为头肾与体肾两部分;头肾较小,具有独立的结构,位于肾脏前部,靠近脑,形态上呈分叉状;头肾由淋巴髓样细胞构成,无肾小球等分泌结构,免疫细胞丰富,包括淋巴细胞、单核细胞、颗粒细胞,是半滑舌鳎免疫细胞的主要生发部位之一,是免疫系统的重要组成;半滑舌鳎的体肾与头肾后部分叉处相连,呈纺锤状,紧贴腹腔背部,向后延伸;体肾主要由肾单位组成,有丰富的肾小囊、近曲小管、远曲小管和集合管结构,表明其具有排泄功能。     

10 个半滑舌鳎家系 MHC IIB 基因多态性初步研究

为检测10个半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)家系MHCⅡB(Cyse-DAB)基因的多态性水平、MHCⅡ类B位点数目以及平衡选择的作用,作者利用多聚酶链式反应(PCR)和直接测序的方法对10个半滑舌鳎家系MHCⅡB基因位点遗传变异和平衡选择进行了研究。用特异性引物和PCR扩增的半滑舌鳎MHCⅡB基因片段大约397 bp,包含一部分第一外显子,全部第一内含子和全部第二外显子。10个半滑舌鳎家系中,每家系选取5个体,每个体5个克隆序列分析发现60个不同序列,代表60个等位基因,其中有28个是新发现的,已提交到Gen Bank。同源分析表明60个等位基因相似性为89.36%。共50个个体中,有6个存在5个不同等位基因,表明在半滑舌鳎至少存在3个座位。有9个家系的MHCⅡB序列多肽结合区(PBR)的非同义替换(dN)显著高于同义替换(dS)。     

Genetic variability of half-smooth tongue sole Cynoglossus semilaevis populations using microsatellite markers

Ten highly variable microsatellite loci were performed in order to evaluate the genetic variability of wild and hatchery samples of half-smooth tongue sole Cynoglossus semilaevis. A group of 200 genotypes belonging to four wild samples, Laizhou (LZ), Weihai (WH), Qingdao (QD), Rizhao (RZ) and one hatchery sample, Mingbo (MB), were screened. All of the ten microsatellite loci screened in this study showed marked polymorphism. A total of 70 different alleles were observed over all loci. The number of alleles per locus ranged from 4.2 to 10.6. The average of expected and observed heterozygosity ranged from 0.67 to 0.82, and from 0.77 to 0.87, respectively. A total of 10, 16, 10, 11 and 5 unique alleles each were found in LZ, WH, QD, RZ and MB populations. The effective number of alleles varied from 2.87 for HSTS_7 to 6.83 for HSTS-h. The number of average genotypes ranged from 6.0 for HSTS_a to 15.4 for HSTS_h. As compared with the wild populations, the hatchery population, MB, showed significant genetic changes such as fewer alleles per locus (P <0.05), a smaller number of low frequency alleles (P <0.05), a small number of unique alleles and a small number of genotypes (P <0.05), all indicative of a reduction in genetic diversity.     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)Patched 1基因的克隆和表达分析

Hedgehog(Hh)信号通路在脊椎动物和非脊椎动物发育过程中细胞信号传导方面发挥重要的作用。Patched 1 (Ptc1)基因是Hh的受体,通过和Hh配体结合调节Hh信号通路。本研究克隆和鉴定了半滑舌鳎的Ptc1基因(csptc1),该基因cDNA全长为5212 nt,编码蛋白包括1543个氨基酸残基,序列比对和进化分析显示该蛋白在进化过程中较为保守。荧光定量显示该基因在脑,肝脏,心脏,鳃,肠,脾脏、肾脏和性腺组织中普遍表达,在精巢中的表达水平显著高于卵巢。精巢中的原位杂交信号主要位于该基因主要在初级精母细胞,次级精母细胞和支持细胞中,而在卵母细胞中的信号较弱。Csptc1基因在卵巢中的甲基化水平高于在雄鱼和伪雄鱼精巢中。这一研究结果可能说明csptc1基因参与了 Desert Hedgehog (DHH)基因维持雄鱼和伪雄鱼的生殖细胞系以及精子发生等生物学过程。     

适宜浓度的维生素E促进半滑舌鳎生长激素基因的表达

本实验旨在探究维生素E对半滑舌鳎垂体组织中生长激素基因表达的影响。作者在每千克等氮等能的基础饲料中分别添加0、400和1 600mg的DL-α-生育酚乙酸酯(维生素E)投喂半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)成鱼(464±2.6) g,进行为期8周的养殖实验;另外,在L-15培养基中添加0、18和54μmol/L的维生素E,对半滑舌鳎成鱼(464±2.6) g的垂体细胞进行为期3 d的体外原代培养实验。分别取垂体组织和原代细胞,通过荧光实时定量PCR分析其gh mRNA的相对表达量。实验结果表明:垂体组织中gh mRNA的相对表达量随着饲料中维生素E含量的增加而呈现先升高后下降的变化趋势,在400 mg/kg组时显著高于其他各组(P0.05);随着细胞培养液中维生素E浓度的升高, gh mRNA的相对表达量显著增加(P0.05)。由此可见,适宜浓度的维生素E能够促进半滑舌鳎垂体组织中生长激素基因的表达。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)幼鱼生长性状和底色的表型和遗传参数估计

半滑舌鳎是重要的经济鱼类,已经被广泛推广养殖,致力于养殖方面的研究开展了很多工作,但是对半滑舌鳎生长性状进行准确遗传评估的研究还未见报道。为了对生长性状进行准确的遗传参数估计,本次研究以80个半滑舌鳎家系为研究对象,对半滑舌鳎早期生长性状（包括个体全长、体宽和体质量）进行分析。另外还将鱼体底面纯白与否（命名为底面颜色）作为一个性状进行研究。结果表明,四个性状都属于中等遗传力（全长为0.210、体宽为0.259、体质量为0.268、底面颜色为0.362）。三个生长性状之间具有很高的遗传相关性（0.913-0.959）,表明如果三个性状进行间接选择的话,将会取得较好效果。底面颜色性状与三个生长性状均为正遗传相关,相关系数在0.241-0.353之间,由此可知,对底面颜色进行选择时,可以加强生长性状的选择效果。通过家系育种值排序,初步筛选出了生长性状优良遗传背景丰富的16个全同胞家系,将作为亲鱼繁殖后代。本研究为半滑舌鳎优良品种的成功培育提供了重要基础资料。     

盐度和体质量对半滑舌鳎标准代谢率的影响

采用流水式呼吸仪测定了不同体质量的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)在盐度为16.43～33.62条件下的标准代谢率.结果表明:各个盐度下的标准代谢率与体质量呈正相关,而单位体质量标准代谢率与体质量呈负相关;标准代谢率与体质量之间的关系可用幂函数Rs=aM<'b>表示.不同盐度下,标准代谢率的组间...     

实时荧光定量PCR分析中不同铁浓度处理下玛氏骨条藻内参基因的筛选

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)是定量分析基因表达的常用方法,选择合适的内参基因对准确分析目的基因表达水平至关重要。本研究以不同铁浓度培养条件下的玛氏骨条藻为材料,定量分析Cytb、EF-1α、HPRT、UBC、GAPDH、β-actin以及β-tubulin 7个内参基因的表达情况,并利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件对这些内参基因的稳定性进行综合评价。结果表明,Cytb和EF-1α的表达稳定性较好,EF-1α+Cytb组合的稳定性最佳,是玛氏骨条藻基因表达研究的理想内参基因,而其他基因的表达稳定性较差,不适合作为内参基因。本研究为玛氏骨条藻基因表达研究过程中内参基因的选择提供了方法学上的依据。     

盐度突变对半滑舌鳎血浆渗透压和鳃丝Na+/K+-ATP酶活性的影响

研究了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)由盐度30突变至0、1O、20、35和40盐度后血浆渗透压和鳃丝Na+/K+-ATP酶活性的变化.结果表明,盐度对半滑舌鳎血液渗透压和鳃丝Na+/K+-ATP酶活性均有显著影响(P＜0.05).盐度突变后,各处理组的血液渗透压和鳃丝Na+/K+-ATP酶活性...     

半滑舌鳎骨形态发生蛋白2基因的克隆、表达分析及启动子活性分析

骨形态发生蛋白2（BMP2）在脊椎动物的骨形成、尤其是诱导成骨方面具有至关重要的作用。本研究克隆了半滑舌鳎（Cynoglossussemilaevis）BMP2基因的cDNA序列,分析其在半滑舌鳎成鱼的组织表达差异及其在早期发育阶段的定位和表达变化趋势,并检测了其启动子活性。研究结果表明,半滑舌鳎BMP2基因cDNA全长为2048bp,编码422个氨基酸。BMP2mRNA在半滑舌鳎成鱼的14个组织中具有广泛的分布,并在脊髓中表达量最高。此外,BMP2基因在早期胚胎发育阶段（原肠期）具有极高水平的表达,其表达量约为其他发育阶段表达量的10倍。整体原位杂交检测结果表明,BMP2mRNA在1日龄仔鱼主要在冠状幼鳍、心和肝表达,在脊索有微量表达;随后,3日龄仔鱼的BMP2mRNA主要表达于脊索。通过对BMP2基因5''上游调控区片段进行启动子活性分析,发现了-179～+109片段可能包含启动子活性增强原件,生物信息学预测该片段包含的锌指转录因子等可能参与了BMP2的转录调控。     

日本囊对虾Cathepsin L基因的鉴定及其在幼体发育中的表达研究

本研究从日本囊对虾（Marsupenaeus japonica）中获得半胱氨酸蛋白酶家族中的cathepsin L基因,命名为Mj-Cathepsin L。Mj-Cathepsin L基因cDNA序列全长1191bp,其开放阅读框编码的Cathepsin L蛋白前体包含327个氨基酸,由信号肽,蛋白前体和成熟蛋白三部分组成。同源序列比对发现日本囊对虾Cathepsin L蛋白与其他已知物种的cahtepsin L蛋白具有较高的同源性。对Mj-Cathepsin L基因在不同组织以及早期幼体幼体发育阶段的研究发现,Mj-Cathepsin L主要在肝胰腺中大量表达,且在幼体发育不同阶段,其表达水平受发育阶段调控,且Mj-Cathepsin L基因显示出与其五个蜕皮时期相关的表达变化,说明Mj-Cathepsin L有可能在日本囊对虾个体发育过程中扮演不同的重要作用。并通过Western Blot方法在日本囊对虾肝胰腺,胃和肠中检测到Cathepsin L酶原和成熟Cathepsin L两种蛋白存在形式。     

Development and validation of a TaqManTM fluorescent quantitative real-time PCR assay for the rapid detection of Edwardsiella tarda

Edwardsiella tarda is one of the most important emerging pathogens in the global aquaculture industries. As such, an accurate diagnosis and quantitative analytical methods are urgently needed for this bacterium. In this study, primers and a TaqMan probe specific to the conservative sequences of the 16S rRNA gene of E. tarda were designed. The concentration of primers and TaqMan probe were optimized to 200 nmol/L and 120 nmol/L, respectively. The detection sensitivity of the FQ-PCR assay was determined to be as low as five copies of the target sequence per reaction using the pGEM-16S rDNA recombinant plasmid as a template, which was 100 times more sensitive than conventional PCR. A standard curve by plotting the threshold cycle values （y） against the common logarithmic copies （log₁0 n_c as x; n_c is copy number） of pGEM-16S rDNA was generated. The results of intra-and inter-assay variability tests demonstrate that the established FQ-PCR method was highly reproducible. The assay was specific for E. tarda as it showed that there was no cross-reactivity to eight additional bacterial pathogen strains in aquaculture. Thus, the FQ-PCR assay has the potential for diagnostic purposes and for other applications, especially for the rapid detection and quantification of low-grade E. tarda infections.     

刺参真核翻译起始因子基因(eif2s1)的cDNA 克隆及表达分析

夏眠是刺参(Apostichopusjaponicas)应对夏季高温低氧等不良环境的重要生存策略,而抑制高耗能的蛋白合成则是夏眠期机体有效降低能耗的重要环节。真核翻译起始因子eIF2是启动蛋白翻译的关键因子,在蛋白合成调控中发挥了重要作用。本研究克隆分析了刺参翻译起始因子eIF2α亚基(eif2s1基因)全长cDNA序列及结构特征,并测定了其在夏眠期间的时空表达模式。结果表明:刺参eif2s1基因序列较保守,与紫海胆该基因同源性最高。同时,刺参eif2s1基因在深度夏眠期组织中出现了不同程度的表达抑制,可能参与了刺参夏眠蛋白抑制调控。     

刺参虾青素基因的克隆及不同体色个体间表达差异的分析

仿刺参(Apostichopus japonicus Selenka)的体色变化很大,多数背腹均为黄褐色,极少数呈白化特征,背腹均为纯白色。经人工繁育实验发现,白化仿刺参的子代仍多具白化特征。本文研究了虾青素基因与刺参白化特征的相关性。在克隆虾青素基因cDNA全长的基础上,比较了普通仿刺参和白化仿刺参在不同发育时期虾青素基因表达量的差异。结果表明,该基因的cDNA含有2058个核苷酸,编码560个氨基酸。经实时定量PCR分析,白化成参体壁中虾青素基因表达量显著低于普通成参;而在仿刺参色素沉积的早期,白化稚参体壁中虾青素基因表达量从受精后第39天开始显著低于普通稚参。可见,仿刺参体壁中虾青素基因的低表达与刺参白化特征的发生密切相关。     

企鹅珍珠贝Creb2基因的克隆及表达分析

CREB(cAMP response element binding protein)是一种真核生物中广泛存在的调控因子。为了探讨企鹅珍珠贝(Pteria penguin)Creb基因的序列和表达特征,为进一步阐述Creb的生理功能提供科学依据,本研究利用RACE-PCR技术克隆到企鹅珍珠贝一个Creb基因的全长序列,分析其理化性质和进化地位;利用荧光定量PCR分析Creb基因在各组织中的表达特征。结果表明,该企鹅珍珠贝Creb基因的c DNA全长为1484 bp,其中开放阅读框(ORF)为1071 bp,编码356个氨基酸,5′非编码区为218 bp,3′非编码区为195 bp,C端包含一个碱性亮氨酸拉链结构(basic region leucin zipper,b ZIP)。预测其分子质量为39.49 k D,等电点为4.43。序列比对显示该企鹅珍珠贝Creb基因与欧洲平牡蛎(Ostrea edulis)和太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)的Creb2同源性(identity)最高,分别为46.3%和46.1%,故命名为pp Creb2;系统进化树分析结果与传统形态学分类结果相吻合。荧光定量PCR分析显示,pp Creb2在企鹅珍珠贝的各个组织中组成性表达,其中在足中表达量最高,鳃中其次。