口蹄疫病毒VP1植物表达载体的构建

P1 T重组质粒上含有口蹄疫病毒 (FMDV)GD10分离株的p1cDNA片段 ,以此为模板 ,用PCR方法扩增其中的VP1基因 ,获得大小约 6 40bp的片段。该片段用BglⅡ和BstEⅡ酶切消化后克隆至表达载体 pCAMBIA130 5 .2 ,转化EcoliTOP10感受态细胞。重组质粒经PCR、酶切及序列分析 ,证实VP1基因处于CaMV35S启动子控制 ,且读码框正确     

尼罗罗非鱼补体3基因片段的原核表达及条件优化

【目的】补体3(Complement3,C3)在罗非鱼的抗病感染中有重要作用,研究C3基因判断原核表达及表达条件。【方法】根据NCBI中已公布罗非鱼补体C3的基因序列,选取C3基因片段,设计一对带有酶切位点的特异性引物,经连接、转化等后,使用限制性核酸内切酶EcoRI和XhoI对克隆成功的C3基因片段以及原核表达载体pGEX-4T进行双酶切,构建重组质粒pGEX-4T-C3,导入大肠杆菌进行原核表达,并优化表达条件,并对纯化目的蛋白进行Western Blot鉴定。【结果】C3基因片段的重组质粒pGEX-4T-C3构建成功。罗非鱼C3基因片段编码区长度为1 341 bp。获得的目的蛋白分子质量为75 ku,与预期结果相符。最佳诱导时间、浓度以及温度分别为4 h、0.2 mmol/L以及37℃;目的蛋白主要以包涵体的形似存在。重组蛋白可以与GST-Tag单克隆抗体特异性结合,说明成功获得罗非鱼C3片段的重组蛋白。     

大口黑鲈肌肉生长抑制素前肽真核表达载体的构建及其在肌肉组织中的表达

将大口黑鲈(Micropterus salmoide)肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)前肽(MSTN-Pro)的cDNA定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)/mycHisB中,双酶切检测和测序鉴定证实,插入pcDNA3.1(-)/mycHisB载体中的片段为目的基因的核苷酸序列,MSTN基因前肽cDNA为正向插入,且重组质粒无错配或插入移位等突变。采用肌肉注射法将重组表达质粒注入大口黑鲈背部肌肉组织,在注射后第2天经RT-PCR检测到MSTN前肽基因mRNA的表达,第6天经免疫组化学检测到MSTN前肽蛋白的表达,第8天蛋白表达强度增强,对照组始终未检测到MSTN前肽基因的表达。     

尼罗罗非鱼Galectin-3基因的原核表达与条件优化

【目的】对Galectin-3蛋白进行纯化,优化诱导相关表达条件,为大量获取罗非鱼Galectin-3蛋白提供方案。【方法】根据NCBI上已公布的罗非鱼(Oreochromismossambicus)Galectin-3基因序列,设计多对带Eco RI和Xhol酶切位点的引物,筛选出良性扩增引物,对罗非鱼cDNA经进行聚合酶链式反应(PCR)扩增、限制性快切酶双酶切、T4连接酶连接等步骤,构建罗非鱼Galectin-3基因的原核表达质粒pGEX-4T-Galectin-3,将重组质粒导入大肠杆菌BL21中,进行Galectin-3重组蛋白的表达。并比较不同的诱导温度、诱导时间、IPTG浓度条件下的表达效果,对Galectin-3蛋白表达最优条件进行筛选。【结果】构建了罗非鱼Galectin-3原核表达质粒,进行Galectin-3重组蛋白后发现37℃下,0.4 mmol/L浓度的IPTG诱导5 h即可诱导Galectin-3重组蛋白高效表达。免疫印迹结果显示,经蛋白纯化柱纯化后的pGEX-4T-Galectin-3重组蛋白可与GST-Tag单克隆抗体发生特异性反应,进而表明表达的重组蛋白是罗非鱼的Galectin-3蛋白。【结论】本研究成功构建了罗非鱼Galectin-3基因的原核表达载体,并确定了Galectin-3融合蛋白最适的表达条件:37℃下,0.4 mmol/L浓度的IPTG诱导5 h。     

星洲银罗非鱼线粒体DNA的RFLP研究

用EcoRⅤ、MboⅡ、NaeⅠ、PvuⅡ、StyⅠ、KpnⅠ、SacⅠ、HindⅢ、DraⅠ、HpaⅡ等10种限制性核酸内切酶对星洲银罗非鱼线粒体DNA(mtDNA)进行酶切分析,其中StyⅠ、SacⅠ和DraⅠ表现出多态性,HpaⅡ酶切后产生零碎片段,EcoRⅤ、NaeⅠ、PvuⅡ、KpnⅠ只有一个切点,HindⅢ有两个切点,MboⅡ有5个切点但有小片段丢失。在星洲银罗非鱼中共发现4种单倍型,单倍型间平均遗传距离为0.008 0,其mtDNA多态度为0.002 4,遗传多样性较丰富。     

草鱼NEDD4结合蛋白基因1原核表达条件的优化及纯化

通过PCR方法克隆草鱼(Ctenopharyngodon idellus)NEDD4结合蛋白基因1(简称CiN4BP1)的开放阅读框(ORF)序列,将扩增产物与pET-32a(+)表达载体相连接,构建原核表达载体pET-N4BP1,对重组质粒进行酶切和测序鉴定,然后将其导入大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,检测该蛋白表达情况。SDS-PAGE分析表明,在温度为37℃,IPTG浓度为0.06 mmol/L,诱导时间为4 h时,N4BP1重组融合蛋白的表达量最高,蛋白分子质量为40.2 ku,与软件预测值大小相符,该蛋白主要以包涵体形式表达。利用His Trap HP亲和柱纯化目的蛋白;Western blot分析表明,N4BP1融合蛋白能与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性反应,说明该表达的蛋白为目的蛋白。     

一株海水氨氧化细菌的系统发育分析

应用PCR技术扩增16S rRNA基因和amoA(ammonia monooxygenase subunit A)的基因片段,并测定其序列,对一株源于海水养殖水体的高效氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria,AOB)进行了系统发育分析。结果表明,经PCR扩增得到了1 098 bp的16S rRNA基因片段和491 bp的amoA基因片段,将其序列用NCBI-Blast软件在GenBank数据库中进行同源性检索后发现,该菌株的16S rRNA基因序列和amoA基因序列分别与亚硝化单胞菌Nitrosomonas sp.NS20的相对应基因片段相似性分别为98.4%和96.7%。在此基础上构建了系统发育树,表明用该菌株的16S rRNA基因片段和amoA基因片段构建的系统发育树均与亚硝化单胞菌属类聚在一起,结合该菌株形态和生理生化特性,鉴定该株氨氧化细菌属亚硝化单胞菌。     

实时荧光定量PCR检测鳜IgM mRNA标准品质粒的构建

利用SYBR Green I荧光定量PCR技术,建立鳜IgM-DNA定量标准品的制备方法。从浸泡免疫后的鳜头肾中提取总RNA逆转录合成cDNA,对目的片段进行PCR扩增、电泳纯化、T-A克隆及测序鉴定。将所得预期质粒梯度稀释后构建标准曲线并进行融解曲线分析。结果表明,当标准品的浓度在3.29×102～3.29×108拷贝/μL时,模板浓度与循环阈值(Ct)间的线性关系良好,相关系数r2达到0.999;融解曲线分析显示具特异的单个峰,表明扩增产物特异性非常好。此法制备的重组质粒标准品可用于对鳜IgM基因的转录水平进行测定。     

融合蛋白IL6-OmpW的质粒构建及表达纯化

以重组质粒pMD18-T/IL6和pMD18-T/OmpW为模板,分别扩增红笛鲷IL-6基因和哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因,运用PCR重叠延伸剪切技术,将IL-6和OmpW基因融合,将融合基因定向克隆到原核表达载体pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白高效表达,融合蛋白分子质量约为66.6 ku。优化后表达条件为温度37℃,IPTG浓度0.2 mmol·L-1,诱导时间5 h。用HisTrap HP亲和柱纯化重组蛋白,最佳咪唑洗脱浓度为400 mmol·L-1,纯化蛋白的质量浓度为480μg·mL-1。Western-blot分析显示,该融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异反应,表明目的蛋白得以正确表达。     

一株H_5N_1亚型禽流感病毒株NA基因的克隆与序列分析

用RT-PCR方法从1个H5N1亚型禽流感病毒分离株A/Chicken/Guangdong/DH/1997扩增NA基因cDNA片段,将其克隆至pMD18-T载体,获得重组质粒pMD-NA,并对其核苷酸序列进行测定和分析。结果表明,该毒株的NA基因长度为1350bp,编码449个氨基酸,与其它H5N1亚型AIV分离株的核苷酸序列同源性为97.0%～99.4%,氨基酸序列同源性为97.7%～99.1%,提示禽流感病毒NA基因保守性较高。NA基因氨基酸序列的聚类分析表明该毒株与来自香港的A/Pheasant/HK/FY155/01和A/Ch/HK/FY150/01两个分离株处于同一进化枝,亲缘关系较近。     

草鱼呼肠孤病毒vp5基因诱饵重组载体的构建、转化与自激活作用检测

根据草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)的vp5基因设计特异性引物,并扩增其开放阅读框序列(open reading frame,ORF),然后连接至pGBKT7载体上构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-vp5,转化至酵母菌Y2HGold,并进行PCR鉴定以及自激活性和毒性检测。PCR、酶切以及测序表明,pGBKT7-vp5重组诱饵载体构建成功。自激活性和毒性检测显示,阳性重组菌株pGBKT7-vp5/Y2HGold和阴性对照菌株pGBKT7/Y2HGold在SD/-Trp平板上出现大小相一致的乳白色菌落,且在SD/-Trp/X-α-Gel、SD/-Trp/AbA+/X-α-Gel平板上生长出蓝色菌落,而在SD/-Trp/-Ade/-His无菌落出现。表明重组菌株pGBKT7-vp5/Y2HGold表达的融合蛋白激活了报告基因AUR1-C和MEL1,没有激活报告基因ADE2和HIS3并且对宿主菌无毒性。该重组诱饵载体可用于酵母双杂交系统进一步筛选cDNA文库中与其相互作用的蛋白。     

草鱼呼肠孤病毒096 vp4基因生物信息学分析及其在肾细胞中的表达

克隆得一株新分离病毒草鱼呼肠孤病毒(GCRV)096的长为1 981 bp的vp4基因,分析该基因的生物信息及其编码蛋白的特性。生物信息学分析表明,同一基因型GCRV分离株vp4基因间的差异不大,但不同基因型GCRV分离株vp4基因间却存在很大的差异。GCRV 096 VP4蛋白含有多个功能位点、2个跨膜结构域及多个潜在的抗原决定簇。构建p EGFP-N3-VP4真核表达质粒,并转染至草鱼肾(Ctenopharyngodon idellus kidney,CIK)细胞中,经荧光显微镜观察和Western blot鉴定,表明GCRV 096 VP4融合蛋白在CIK细胞中得以成功表达。     

草鱼呼肠孤病毒096 vp7基因生物信息学分析及其酵母表达载体的构建

草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)是草鱼出血病的病原。从患病草鱼体内分离到一株草鱼呼肠孤病毒GCRV 096,经反转录PCR,克隆得GCRV 096长度为855 bp的vp7基因,并分析该基因编码蛋白的特性。结果表明,同一基因型分离株VP7蛋白间的差异不大,但不同基因型分离株VP7蛋白间存在很大的差异。对GCRV 096 VP7蛋白生物信息学分析表明,信号肽位点位于20氨基酸处,且VP7含有4个潜在的抗原决定簇。构建GCRV 096 vp7基因的酵母表达载体p GBKT7-S10,并成功转化至酵母中。     

草鱼呼肠孤病毒096vp7基因生物信息学分析及其酵母表达载体的构建

草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus, GCRV）是草鱼出血病的病原.从患病草鱼体内分离到一株草鱼呼肠孤病毒GCRV 096,经反转录PCR,克隆得GCRV 096 长度为855 bp 的vp7 基因,并分析该基因编码蛋白的特性.结果表明,同一基因型分离株VP7 蛋白间的差异不大,但不同基因型分离株VP7 蛋白间存在很大的差异.对GCRV 096 VP7 蛋白生物信息学分析表明,信号肽位点位于20 氨基酸处,且VP7 含有4个潜在的抗原决定簇.构建GCRV 096 vp7 基因的酵母表达载体pGBKT7-S10,并成功转化至酵母中.     

无乳链球菌sodA基因的克隆、序列分析及原核表达载体构建

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)是引起我国南方罗非鱼链球菌病的主要病原之一,SodA是无乳链球菌重要的毒力因子之一。根据链球菌sod A基因保守区设计引物,采用PCR扩增sod A基因部分序列,反向PCR和巢式PCR扩增其侧翼序列,成功获得无乳链球菌sod A基因。无乳链球菌sod A基因序列全长为699 bp,含开放阅读框609 bp,可编码202个氨基酸,演绎的SodA蛋白主要由α螺旋和不规则卷曲构成。BLAST分析表明,该蛋白氨基酸序列与犬链球菌(S.canis)及副乳房链球菌(S.parauberis)相应蛋白的氨基酸序列相似性分别高达80%和79%。将sodA基因克隆至原核表达载体pET28a上成功构建了重组质粒p ET28a-sod A,导入Escherichia coli BL21(DE3),诱导表达的重组蛋白质分子质量约为24 ku,主要以包涵体形式存在于表达菌中。     

哈维氏弧菌GST核酸疫苗制备及其对斜带石斑鱼的免疫保护作用

通过同源引物从致病性哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)ZJ0603基因组中克隆GST的开放阅读框(ORF),构建真核表达质粒pcDNA-GST。大量抽提重组质粒后,于背鳍基部肌肉注射重组质粒免疫斜带石斑鱼(Epinephelus coioides),分析重组质粒的免疫效果。通过核酸水平检测重组质粒在鱼体肝、肌肉、头肾和脾脏组织的分布;用ELISA法检测鱼体血清的抗体水平,用Western-blot检测目的蛋白的表达情况。结果表明:该序列全长615 bp;免疫7 d后,鱼体中均有质粒分布;斜带石斑鱼血清中产生抗GST的高效抗体(1∶4 096);相应的目的蛋白也在鱼体中成功表达。攻毒后,疫苗免疫保护率达80%,表明GST可作为防治哈维氏弧菌病有效候选抗原。     

抗草甘磷转基因大豆多重PCR检测及假阳性问题探讨

以大豆病基因类似物(RGA)基因为对照,用RR大豆中的外源CaMV35S启动子、CP4-EPSPS引物,应用多重PCR方法,从RR大豆中扩增出预期大小的DNA片段。结果表明:将扩增产物回收后测序,经同源性分析扩增产物为CaMV35S启动子和CP4-EPSPS的一部分序列;多重PCR检测的灵敏度为0.08%;PCR检测过程中产生假阳性的原因是污染和非特异性扩增。     

抗草甘磷转基因大豆多重POR检测及假阳性问题探讨

以大豆病基因类似物(ROA)基因为对照,用RR大豆中的外源CaMV35S启动子、CP4-EPSPS引物,应用多重PCR方法,从RR大豆中扩增出预期大小的DNA片段.结果表明:将扩增产物回收后测序,经同源性分析扩增产物为CaMV35S启动子和CP4-EPSPS的一部分序列;多重PCR检测的灵敏度为0.08%;PCR检测过程中产生假阳性的原因是污染和非特异性扩增.     

马氏珠母贝近交与杂交家系的DNA甲基化多态性比较

采用甲基化敏感多态性扩增技术(MSAP)检测马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)近交(F1)与杂交(Z1)家系闭壳肌的DNA甲基化修饰水平,对部分甲基化修饰片段进行回收、测序和注释分析。结果表明:使用20对引物进行选扩增PCR,最终F1和Z1分别获得(632.20±22.58)和(588.60±25.09)条条带,差异显著(P0.05);F1和Z1之间的组织甲基化水平分别为(9.93±1.60)%和(8.04±1.25)%,差异显著(P0.05)。对回收片段进行注释,F1家系共获得9条甲基化修饰片段,其中8条为功能蛋白,分别为E3泛素连接酶、逆转录病毒多聚蛋白、神经肽受体、交叉结点核酸内切酶、磷酸糖器、苯丙氨酸解氨酶、隐花色素蛋白、脆性位点相关蛋白;Z1家系共获得5条甲基化修饰片段且均为功能蛋白,分别为脆性位点相关蛋白、神经元乙酰胆碱受体α亚基、无调性的同源蛋白、麦芽糖酶、甲基胞嘧啶双加氧酶。初步阐明马氏珠母贝近交家系F1与杂交家系Z1间的DNA甲基化修饰水平和部分具甲基化修饰位点。     

草鱼呼肠孤病毒GCRV 096 VP7蛋白的表达及免疫原性

【目的】研究草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus, GCRV)096 vp7基因的原核和真核表达及其编码蛋白的免疫原性。【方法】应用RT-PCR技术获得GCRV 096 vp7基因,构建GCRV 096 vp7基因原核表达载体pET-VP7,用原核表达的GCRV 096 VP7蛋白免疫草鱼(Ctenopharyngodon idellus)15 d后,用GCRV 096和GCRV GD108分离株对其攻毒,检测GCRV 096 VP7的免疫原性。构建GCRV 096 vp7基因真核表达载体p EGFP-N3-VP7,分析其在草鱼CIK细胞中的表达。【结果与结论】GCRV 096 vp7基因的开放阅读框ORF (GenBank登录号为JN206665)为831 bp,编码276个氨基酸。成功构建GCRV 096 vp7基因原核表达载体pET-VP7,并在大肠杆菌BL21中诱导表达成功;最优表达条件是0.2 mm/L IPTG、28℃下表达5 h,通过HisTrap HP柱纯化融合蛋白,Western blot分析结果表明,所表达的蛋白为目的蛋白。经免疫及GCRV攻毒后,GCRV 096(Ⅰ型)免疫组vp7基因的表达水平降低(P 0.05),而GCRV GD108(Ⅱ型)免疫组vp7基因的表达无显著差异,表明GCRV 096 VP7蛋白对GCRV096具有良好的免疫效果,但对GCRVGD108无明显的免疫效果。成功构建GCRV096vp7基因真核表达载体pEGFP-N3-VP7,Western blot分析结果表明,GCRV 096 VP7蛋白在草鱼肾(CIK)细胞中成功表达。