坛紫菜别藻蓝蛋白α,β亚基基因的克隆和序列分析

以野生坛紫菜色素体DNA为模板, 通过PCR扩增获得编码坛紫菜别藻蓝蛋白α亚基和β亚基的序列及两者之间的间隔序列,该序列全长为1 055 bp,其中编码α和β亚基的序列均为486 bp,间隔序列为83 bp.该序列与GenBank收录的其他4种红藻相关序列的同源性在75.6%~87.4%,与2种蓝藻的同源性分别为66.9%,68.5%,其中编码区同源性更高.     

坛紫菜微卫星DNA序列的筛选

自坛紫菜(Porphyrahaitanensis)丝状体中提取的DNA,经Sau3AI限制性内切酶消化后,将300~900bp之间的DNA片段回收,并连接到经BamHI酶切并去磷酸化的pUC18载体上,最后转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中,构建坛紫菜小片段DNA质粒文库。选用pUC18质粒的通用引物进行PCR反应,对文库进一步筛选并检测插入片段的大小,在384个阳性克隆中,有278个含有大小合适的插入片段。经测序及序列分析,在103个克隆中获得172个微卫星序列,其中完美型107个,占62.2%,非完美型53个,占30.8%。(GC)n与(CG)n在坛紫菜DNA中非常丰富,分别占25%及17%,但重复频率相对较低。     

坛紫菜藻红蛋白α,β亚基基因的克隆和序列分析

藻胆蛋白(Phycobiliprotein,PBP)是原核藻类和真核藻类进行光合作用的捕光色素蛋白,占藻体干重的2%左右,主要分为3类:藻红蛋白(phycoer-ythrin,PE)、藻蓝蛋白(phycocyanin,PC)和别藻蓝蛋白(allophycocyanin,APC)[1].藻胆蛋白一般由α亚基和β亚基组成,部分藻胆蛋白中还存在γ亚基.一般由α和β亚基形成稳定的单体(αβ),再由单体聚合为多聚体(αβ)_n.从蓝藻和红藻中分离的藻胆蛋白为三聚体(αβ)₃或六聚体(αβ)₆[2].     

坛紫菜ISSR反应体系的建立与优化

为了利用ISSR分子标记技术对坛紫菜(Porphyra haitanensis)种质资源进行遗传分析及种质鉴定,获得清晰稳定、重复性好、多态性高的扩增结果,对影响ISSR-PCR扩增的多个因素,包括DNA模板含量、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶含量、引物浓度、dNTP浓度以及复性温度进行了全面比较和优化,建立了坛紫菜种质资源ISSR-PCR扩增的最佳反应体系:25μL的反应体系中含2.5μL 10×PCR缓冲液,5 ng模板DNA,2.5 mmol/L Mg2+,1.5 UTaqDNA聚合酶,200 nmol/L引物,200μmol/L dNTP。最佳PCR扩增程序:94℃预变性7 min;每个循环94℃变性1 min,48℃复性45 s,72℃延伸2 min,共进行35个循环;循环结束后72℃再延伸7 min。     

干露和冷藏对坛紫菜及杂藻存活与生长的影响

将人工养殖的坛紫菜叶状体及与其有生长竞争关系的5种大型杂藻——肠浒苔、条浒苔、孔石莼、真江蓠、水云以及卵形藻等进行干露和冷藏实验.结果表明,坛紫菜叶状体干露至含水率10%~15%后直接培养,其成活率在99%以上,增重率与未经干露组的相比无显著差异;大型杂藻干露后含水率低于25%时则全部死亡;坛紫菜叶状体含水率为10%~15%时,在低温-20℃冷藏30d后进行培养,成活率达99%~100%,当含水率低于10%时,其成活率低于30%;坛紫菜叶状体含水率高于或低于10%~15%时进行低温冷藏,均会影响其成活率及冷藏后培养时的藻体增重率;与坛紫菜叶状体冷藏相同天数的大型杂藻,其死亡率达到100%;干露和冷藏可以有效地杀死与坛紫菜叶状体有竞争关系的杂藻,并且可以应用于生产以提高坛紫菜产量.     

野生型与红色型坛紫菜杂交嵌合体及选育的研究

以坛紫菜Porphyra haitanensis的红色型为父本,野生型为母本进行杂交,获得了不同色泽嵌合和不同嵌合方式的突变体;从中挑选出4株典型的嵌合体进行单株培养,并通过体细胞酶解,获得完整的单色突变体,然后对这些藻体进行生长发育和经济性状的比较,其结果如下:(1)杂交嵌合体的类型:红色和绿色嵌合、红色和褐黄色嵌合、翠绿色和野生色嵌合、红色和橘黄色嵌合;(2)嵌合的方式:斑点状嵌合、条状嵌合、线状嵌合、"V"字型嵌合和片状嵌合等;(3)各单色突变体的生长差异显著,红色突变体的藻体长度和鲜重增长较快,3~4 cm的幼苗在实验室培养11~15 d,日增长量为8.5~9.6 cm/d,日增重(鲜重)为0.120~0.128 g/d,明显高于其他突变体,具有较好的杂交优势和生产应用前景;(4)在高温26~31℃培养各单色突变体,耐高温能力较强的是红色突变体和绿色突变体,两者在29℃时培养10 d和30℃时培养6~7 d时,叶片出现点状腐烂,但整株藻体仍完整;褐绿色突变体和传统栽培对照组的藻体对高温的耐受能力较差,在26℃培养6 d以上就完全腐烂.以上研究结果可为坛紫菜杂交嵌合体生物学研究以及杂交优势品系的选育提供科学参考.     

坛紫菜(Porphyra haitanensis)化学成分的研究

利用硅胶色谱、Sephadex LH-20凝胶色谱、HPLC等技术,从坛紫菜(Porphyra haitanensis)乙醇提取物首次分离纯化得到了7个化合物,通过质谱(MS)及核磁共振波谱(1H NMR、13C NMR)等现代波谱技术鉴定为：1,8-二羟基-9,10-蒽醌(1)、邻苯二甲酸二正丁酯(2)、邻苯二甲酸二异丁酯(3)、β-谷甾醇(4)、鲨肝醇(5)、(E)-N-2(1,3-二羟基-4-十八烯基)-十六酰胺(6)、胆甾醇(7)。其中,化合物1对金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)的最低抑菌浓度(MIC)为80μg/mL。     

坛紫菜孢子体和配子体世代之间的SSH分析

坛紫菜(Porphyra haitanensis)是我国特有的栽培品种,主要养殖于福建、浙江和广东等地,其产量约占全国紫菜产量的75%。坛紫菜的生活史包括二倍孢子体和单倍配子体两个异型世代,两者在藻体形态、细胞结构、生化组成、生理特性等方面存在显著差异[1]。对坛紫菜不同世代基因的表达差异的研究,不仅有助于了解不同世代生理生化特性,并对重要经济性状的基础遗传学研究提供分子依据。     

坛紫菜耐高温品系选育及经济性状的初步研究

将人工杂交选育的坛紫菜新品系Z-26,Z-61,Z-81,Z-17的子3代(F₃)与野生型对照组进行遗传性状的比较,旨在筛选耐高温品系。实验结果表明:(1)在高温29℃下培养40 d,人工选育的4个新品系丝状体均能正常生长发育,其中Z-26丝状体生长较快,Z-61在29℃下较易成熟,95%的营养藻丝发育成孢子囊枝,Z-17只有30%形成孢子囊枝;(2)Z-26和Z-61品系的叶状体在30℃下培养10 d,虽然藻体变白,但没有死亡,此时将其移至21℃下恢复培养3~4 d,藻体逐渐恢复为原有的色泽;(3)Z-81和Z-17的叶状体在29℃下培养7~10 d,虽然藻体发白但尚未死亡,移至21℃下培养基本可恢复正常,但在30℃下培养10 d,藻体腐烂不可恢复;(4)野生型对照组不耐高温,藻体在27℃下培养5 d就腐烂死亡,人工选育的4个品系耐受高温的幅度比野生型对照组高1~3℃;(5)4个品系叶状体在26~28℃温度下培养10 d后,其主要的藻胆蛋白和叶绿素a的含量与21℃培养下的含量差异不显著,说明短时间的高温培养并不影响其品质。     

坛紫菜生活史的研究现状及存在的问题

坛紫菜（Porphyra haitanensis）属暖温性海藻,是中国东南沿海的重要栽培物种,2011年度栽培面积达30余万亩。其生活史过程比较复杂,既有雌雄异体,也有雌雄同体;既存在无性生殖,也存在有性生殖;其能否产生单孢子也常常引起争议。为此,本文总结了坛紫菜的生殖及生活史的研究现状和存在的问题,旨在为坛紫菜的遗传育种提供一定的理论参考。     

坛紫菜叶状体营养细胞与生殖细胞叶绿素荧光特性比较

利用叶绿素荧光技术对坛紫菜(Porphyra haitanensis)叶状体营养细胞和生殖细胞的光能利用特性进行了比较。结果表明:坛紫菜叶状体营养细胞和雌性生殖细胞的实际量子效率(ΔF/Fm′)差异不明显,但显著高于雄性生殖细胞;快速光曲线测定表明雌、雄藻体营养细胞的最大相对电子传递速率(rETRmax)相近,但显著高于雄性生殖细胞;不同生殖细胞半饱和光强(Ik)无显著差异;在生长光强下,营养细胞和雌性生殖细胞rETR、光化学猝灭(qP)和非光化学猝灭(NPQ)差异不明显,而雄性生殖细胞rETR、qP等荧光参数均显著低于营养细胞和雌性生殖细胞。本文表明坛紫菜叶状体营养细胞和雌性生殖细胞具有较高的光能利用能力,能够将吸收的光能多数用于电子传递,而雄性生殖细胞对光能的利用能力较低。     

利用ISSR 分子标记技术分析浙江沿海4 株坛紫菜的遗传多样性

利用 ISSR 分子标记技术对采自浙江省南麂岛和渔山列岛的4株不同形状野生坛紫菜(Porphyra haitanensis)进行了遗传多样性分析.从33条引物中筛选出11条可扩增出清晰条带的引物,在4株坛紫菜中共扩增出62条 DNA 带,其中多态性条带比例达88.71%.遗传距离分析表明4株坛紫菜之间的遗传距离范围是0.3226~0.6129,聚类分析结果表明渔山列岛坛紫菜遗传距离最近,而南麂岛的两株坛紫菜则距离相对较远.该研究说明浙江附近岛屿的野生坛紫菜遗传多样性丰富     

坛紫菜品系间杂交子代杂种优势的ISSR分析

以野生型坛紫菜(♀)和经过人工诱变选育获得的红色型(♂)坛紫菜进行杂交获得丝状体和叶状体,从中挑选5株具有一定生长优势和其它经济性状的藻体分别进行体细胞克隆和丝状体培育,获得5个性状稳定的子代品系(品系A,B,C,D,E)。然后应用ISSR标记技术对杂交亲本及这5个子代品系的杂种优势进行研究,从67个引物中筛选出了21条能扩增出清晰、稳定条带的引物,共得到366个扩增位点,其中347个位点具有多态性,多态位点百分率达94.8%,扩增的条带大小在400~4 000 bp之间。通过对扩增带谱的统计分析,发现5个坛紫菜杂种子代品系同父本和母本的遗传相似性平均值分别为0.519 1和0.555 1,都明显低于两亲本间的遗传相似性0.6120;并且5个杂种子代的有效等位基因数1.550 1,期望杂合度0.320 0,Shannon多样性指数0.472 0都要明显高于两亲本的有效等位基因数1.390 7,期望杂合度0.195 4和Shannon多样性指数0.270 8。由此表明杂交使得坛紫菜的遗传多样性水平明显提高,产生了显著的杂种优势。从扩增带谱的统计结果,还可看出5个杂种子代同两亲本的遗传距离不是对等的,全部都稍偏向母本,聚类分析结果也同样证明了这一点,说明细胞质基因在坛紫菜遗传性状的表达中也发挥了重要作用。文章最后对ISSR技术在杂种优势预测中的应用也进行了讨论。     

坛紫菜磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆与序列分析

采用同源克隆的方法和RACE技术,从坛紫菜cDNA中获得了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的序列,该段序列含2538个核苷酸包含一个终止密码子TAG和191 bp的3'端非编码区(UTR),可编码846个氨基酸.该段序列中无跨膜结构和信号肽序列,推导的氨基酸序列中C末端第813位氨基酸是丙氨酸(A),表明是一个C<,...     

紫菜中类菌孢素氨基酸纯化工艺的优化及其抗紫外辐射作用研究

为了筛选纯化紫菜类菌孢素氨基酸(mycosporine-like amino acid,MAAs)的离子交换树脂,优化纯化工艺,并研究纯化后MAAs体外抗紫外辐射活性,本研究通过静态动力学吸附及解析实验,筛选纯化树脂;结合动态动力学吸附及解析单因素实验建立响应面法对SA-2型阳离子树脂纯化MAAs的二次多项式模型,对MAAs的纯化工艺进行优化;通过建立大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的复合紫外线(UVA+UVB)损伤模型,分析纯化后MAAs样品的体外抗辐射活性。结果表明:静态动力学吸附及解析实验筛选出SA-2型阳离子树脂为纯化MAAs的最佳树脂,吸附率和解析率分别为86.01%和56.63%;吸附的最佳工艺条件为:上样液质量浓度3 g/L、上样流速1 m L/min、上样液pH为6、洗脱液体积分数为3%、洗脱流速为1.5 m L/min、洗脱液pH为6;在此条件下吸附率为79.21%,洗脱率为64.02%;纯化后的MAAs样品能有效抑制紫外辐射而造成的损伤,将菌种失活速度分别降低了39.10%和40.58%,表现出显著的抗紫外辐射活性。     

坛紫菜碳酸酐酶基因的克隆、表达及酶活性分析

以坛紫菜丝状体为材料,采用RACE方法获得坛紫菜碳酸酐酶(CA)基因的全长cDNA。该cDNA全长1 081 bp,具有一个825 bp的开放阅读框,可编码274个氨基酸。序列同源性分析显示该cDNA序列推导的氨基酸序列与其他物种的碳酸酐酶具有较高的一致性,其中与条斑紫菜的一致性达到96%。氨基酸序列分析表明该蛋白为β-CA,含有两个CA活性位点,无跨膜结构,可能存在一个信号肽将其定位到叶绿体中,与藻类和细菌聚类。原核诱导表达得到一个72 kDa左右的融合蛋白,酶活测定结果显示此蛋白具有碳酸酐酶活性。该实验对进一步深入研究坛紫菜CA的功能及坛紫菜碳代谢、光合作用等生理过程具有重要的参考价值。     

条斑紫菜壳孢子超微结构研究

应用戊二醛、锇酸固定,环氧树脂包埋,醋酸双氧铀-柠檬酸铅制作切片,以透射电镜观察条斑紫菜(Porphyra yezoensis)壳孢子的超微结构,结果表明:壳孢子外包被一层薄的细胞壁,中央为一个由同心片层结构的类囊体膜构成的轴生星状色素体,色素体中有一个无淀粉鞘包被的蛋白核,类囊体膜上附有嗜锇性的质体小球.壳孢子细胞核位于色素体的一侧,呈不规则的长圆形,核仁偏于核的一侧.在胞质中分布有线粒体、红藻淀粉、液泡等细胞器.与放散前的成熟壳孢子囊枝细胞超微结构比较,成熟壳孢子超微结构的变化主要有细胞壁变薄,色素体结构松散甚至退化,蛋白核分裂,液泡数量增多而红藻淀粉数量减少等,这些变化反映了成熟壳孢子基本细胞特征,同时反映了在壳孢子生长发育过程中温度下降、光照时间缩短和光照强度减弱等环境因素的变化.     

紫菜(Porphyra遗传差异的ISSR分析

采用ISSR标记技术对来自不同产地的6个坛紫菜(Porphyra haitanensis)无性系和两个条斑紫菜(P.yezoensis)无性系进行了遗传差异的分析。结果表明,7条ISSR引物在8个紫菜系中共扩增出59条片段,全部表现出多态性。根据Nei等的相似性系数得出8个紫菜系间的遗传距离在0.274—0.746之间。用UPGMA方法作出的系统树中各紫菜基本上是按照产地进行聚类,从而推测紫菜的遗传差异可能与地域分布相关。本文结果也证明了ISSR与RAPD、AFLP等标记技术一样适用于紫菜的遗传多样性分析。     

条斑紫菜高纯度总DNA及其质粒状DNA的提取

提取条斑紫菜高纯度总DNA及其质粒状DNA的新方法。先用海螺酶处理紫菜叶状体制备细胞,然后用SDS-蛋白酶K裂解细胞提取总DNA,再用玻璃粉浆(glassmilk)对其纯化,经纯化后的总DNA能被EcoRI,Dral与HaeⅢ等限制酶完全酶切,并在酶切图谱上形成明显的DNA带型。当用异硫氰酸胍一十二烷基肌氨酸钠裂解紫菜细胞时,在总DNA提取物中直接发现有一条质粒状DNA带(2.3Kb),即建立了一种极简便的质粒状DNA提取方法。     

Genetic variation of Porphyra yezoensis by using AFLP1

Genetic variation of 11 lines of Porphyra yezoensis from the coastline of Kagoshima ofJapan, Qingdao, Nantong, Putuo and Nanji Islands of China were studied by using amplified fragment length polymorphism (AFLP).778 bands were obtained with AFLP analysis of 16 primer combinations, among which 15 were unique, about 98.07% were polymorphic. The AFLP data showed that the closest genetic distance was 0.180 between two Kagoshima samples, and the farthest one was 0.397 between Kagoshima No.1 and Nantong No.9 line. The genetic distance showed that the variation was within the inner species scope. Neighbor-joining cluster and UPGMA cluster indicated that samples from Kagoshima and Qingdao were with high similarity and either with the samples of Nantong, Putuo and Nanji Islands. P. yezoensis in China shared high genetic diversity, and the genetic distance showed positive correlation with the geographic distance.