大菱鲆与耐高温性状相关的微卫星示记筛选

采用微卫星分子标记(SSR)技术分析大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)耐高温相关特性,为耐高温大菱鲆的分子辅助育种提供合适的分子标记.将大菱鲆经过高温实验处理,区分为耐高温组与高温敏感组,用于实验分析.采用Salah.M法抽提大菱鲆肌肉组织的DNA,根据已知的30个大菱鲆微卫星位点的侧翼保守序列设...     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)生长性状相关的微卫星标记筛选

采用分群分离分析法,以同一批受精卵孵化的同池养殖大菱鲆生长性状发生分离的群体为材料,进行微卫星DNA遗传分析,以揭示影响大菱鲆生长发育速度方面的遗传信息。30个多态性微卫星位点对生长高值组(F组)和生长低值组(S组)各10个样本建立的DNA混合池进行扩增时,在两池间出现了7个差异片段。通过对两组大菱鲆个体PCR扩增出的差异条带进行统计,分析微卫星位点与大菱鲆生长性状的相关性。结果表明,有1个微卫星位点(SmaC10)在355bp的等位基因片段与大菱鲆生长性状存在一定的负相关性;有4个微卫星位点(SmaC02、SmaC06、SmaC09、B11-I12/6/3)分别在258bp、182bp、226bp、175bp的等位基因片段与大菱鲆生长性状存在正相关性,其中位点Smac09在226bp的等位基因片段与生长性状的正相关性极显著,相关系数达到0.354。位点SmaC09所扩增出的等位基因片段可作为具有良好生长特性人工选育群体的分子标记,指导大菱鲆的辅助育种。     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)抗鳗弧菌(Vibrio anguillarum)性状的微卫星分子标记研究

采用微卫星分子标记技术分析验证了133对微卫星分子标记,以期为大菱鲆(Scophthalmus maximus)育种提供合适的抗鳗弧菌分子标记。实验鱼经鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染,分为非抗病组与抗病组。对两组鱼PCR扩增出的差异条带进行个体统计,再进行微卫星位点与抗鳗弧菌的相关性分析,并分析对比了两组鱼的遗传多样性。结果表明,微卫星位点Sma-USC108、Sma-USC141的等位基因片段分别在215bp和200bp与抗鳗弧菌性状的正相关性极显著,相关系数分别达到0.363和0.407(P0.01);微卫星位点FF0911、Sma-USC62、Sma-USC279的等位基因片段分别在189bp、163bp和236bp与抗鳗弧菌性状的负相关性极显著,相关系数分别达到–0.377、–0.364和–0.363(P0.01)。经过二次验证,最终确定Sma-USC141和FF0911两个微卫星位点可指导大菱鲆抗鳗弧菌的辅助育种。两组大菱鲆的群体遗传多样性分析对比表明:抗病群体与非抗病群体的遗传变异水平较低,两个群体的遗传多样性水平相当。     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)微卫星序列的开发与分析

采用FIASCO (Fast Isolation by AFLP of Sequences Containing repeats)法和标记初步筛选法, 进行了大菱鲆(Scophthalmus maximus)微卫星标记开发的研究, 分析了大菱鲆基因组中微卫星DNA序列的特征, 并进行了拟作图标记的初步筛选。结果表明, FIASCO法的富集效率为78.56%, 二次筛选出655个阳性克隆, 测序后经分析有469条含有微卫星位点的单一序列, 共得到597个微卫星位点。其中完美型占51.76%, 非完美型占34.67%, 复合型占13.57%; 核心序列的重复次数在3—96次之间, 平均重复数为13.39次; 重复单元类别最多的是(CA/GT)n, 占77.6%。利用Primer Premier 5.0共设计413对引物, 其中有360对能够得到稳定表达的产物; 再经标记初筛试验得知, 183对引物(50.8%)的PCR产物有多态性, 其中110个微卫星位点(30.6%)符合遗传连锁图谱作图标准。     

暗纹东方鲀生长性状相关微卫星标记筛选

为了筛选与暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)生长相关的分子标记,作者采用SSR结合BSA技术对同龄孵化群体的同池养殖暗纹东方鲀生长差异性状标记进行筛选。利用85对微卫星引物对暗纹东方鲀生长快、慢各30尾个体构建的两个基因池进行分析,共筛选到14个差异位点。然后分析这14个差异微卫星位点在这60个暗纹东方鲀个体中的基因型差异,结果表明:位点TOP03、TOG01、fms15、fms75与生长性状呈现极显著负相关关系(P0.01),fms89与生长性状呈现极显著正相关关系(P0.01)。用另外30个个体(生长快慢各15个)进行验证实验后,结果只有位点fms15、fms75与生长性状显著相关,相关系数分别为–0.411和–0.384。这两个微卫星位点对于暗纹东方鲀生长性状有显著效应,为开展暗纹东方鲀的分子标记辅助育种提供了有价值的参考标记。     

微卫星标记在大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)家系系谱印证中的应用研究

用8个微卫星标记对大菱鲆7个人工选育家系进行了系谱鉴别和遗传多样性研究。8个微卫星位点的平均多态信息含量为0.6721,平均杂合度为0.7206。8个微卫星位点在7个家系分析中,共检测到40个等位基因,每个位点的等位基因数在38个之间,每个位点平均有5个等位基因。根据已知亲本及子代基因型,成功的推断出了7个家系中缺失亲本的基因型。在双亲未知的情况下8个微卫星位点累积排除概率是97.07%,已知单亲时累积排除概率达99.63%。用UPG-MA法对7个家系的137个子代个体进行了聚类分析,90.5%同一家系的子代个体能完全聚类到一起,分类结果与系谱来源基本一致。微卫星标记可以为大菱鲆混养家系进行亲权鉴定和系谱构建提供技术支持。     

大菱鲆微卫星标记在亲本后代中的分离分析

为对大菱鲆(Scophthalmus maximus)的养殖群体进行微卫星分析研究,作者用70个微卫星位点在大菱鲆亲本后代中的基因型分离方式进行检测与分析。结果显示,70个位点共产生了12种分离方式(♀×♂)。70个微卫星位点中45个位点符合孟德尔遗传定律(P≥0.05),有25个位点偏离了孟德尔遗传定律(P0.05)。平均等位基因数目为2.2,平均有效等位基因数为1.885。平均期望杂合度和观测杂合度分别为0.55和0.537。多态信息含量为0.182~0.699,平均值为0.361。研究证明这些标记大部分可以用于大菱鲆进一步的图谱构建,QTL定位和分子标记辅助育种研究。同时对群体的分析表明,该大菱鲆养殖群体遗传多样性水平较高,可用于进一步的良种繁育。     

基于Gibbs抽样的贝叶斯方法估计大菱鲆生长和耐高温性状的遗传参数

为了开展大菱鲆耐高温选育工作,对其进行耐高温性状及其相关生长性状的遗传评估是非常必要的。以来源于英国、法国、丹麦和挪威4个国家的不同群体构建大菱鲆选育家系,利用F₁的20个和F₂的22个耐高温选育家系进行耐高温实验,统计耐高温评估指标（UTT）和相应的实验鱼体重（每个家系选取40-50尾实验鱼）。基于Gibbs抽样的贝叶斯方法,采用包含母性效应和不包含母性效应的两种动物模型,对大菱鲆耐高温（UTT）和生长性状的遗传力以及这两个性状间的遗传相关和表型相关进行分析。结果表明,基于不包含母性效应的动物模型估计的体重和耐高温性状的遗传力以及这两个性状之间的表型相关和遗传相关分别为0.239±0.141,0.111±0.080,0.075±0.026和-0.019±0.011。基于包含母性效应的动物模型估计的这4个值分别为0.203±0.115,0.055±0.026,0.047±0.034和-0.024±0.028,体重和耐高温性状的母性效应分别为0.050±0.017和0.013±0.004。母性效应对这两个性状的遗传评估有一定的影响。本文的研究结论为制订合理的大菱鲆耐高温育种规划提供了理论依据。     

大菱鲆亲子鉴定的微卫星多重PCR技术建立及应用

用8个微卫星标记组合建立了2个微卫星多重PCR体系,对大菱鲆7个人工选育家系进行了系谱认证、亲子鉴定和遗传多样性研究。2个多重PCR体系中8个微卫星位点共检测到等位基因49个,每个位点等位基因数为3~8个。根据已知亲本及子代基因型,成功推断出了3个缺失亲本的基因型。在双亲未知的情况下2个多重PCR的8个微卫星位点累积排除概率是96.58%,已知1个亲本时累积排除率为99.71%,亲子鉴定准确率为96.42%。采用70个个体进行双盲验证,利用UPGMA法对7个家系的70个体进行了聚类分析,同一家系95.71%的个体聚类分析结果与系谱来源一致。Cervus 2.0软件亲子鉴定结果表明亲子鉴定准确率为92.86%。2个多重PCR体系的建立为大菱鲆不同家系混养后的亲子鉴定、系谱分析和分子辅助家系管理提供了技术手段。     

大菱鲆亲子鉴定的微卫星多重PCR技术建立及应用

用8个微卫星标记组合建立了2个微卫星多重PCR体系,对大菱鲆7个人工选育家系进行了系谱认证、亲子鉴定和遗传多样性研究.2个多重PCR体系中8个微卫星位点共检测到等位基因49个,每个位点等佗基因数为3～8个.根据已知亲本及子代基因型,成功推断出了3个缺失亲本的基因型.在双亲未知的情况下2个多重PCR的8个微卫星位点累积排除概率是96.58%,已知1个亲本时累积排除率为99.71%,亲子鉴定准确率为96.42%.采用70个个体进行双盲验证,利用UPGMA法对7个家系的70个体进行了聚类分析,同一家系95.71%的个体聚类分析结果与系谱来源一致.Cervus 2.0软件亲子鉴定结果表明亲子鉴定准确率为92.86%.2个多重PCR体系的建立为大菱鲆不同家系混养后的亲子鉴定、系谱分析和分子辅助家系管理提供了技术手段.     

大菱鲆钙激活型钾离子通道基因TSKCa的克隆和序列分析

钙激活型钾离子通道蛋白(KCa)是位于细胞膜表面调节细胞功能的一类膜蛋白.通过设计特异性引物,以我国海水养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)血液cDNA为模板,利用RT-PCR 技术克隆获得了一条基因片段.生物信息学分析证实该片段来自钙激活型钾离子通道基因SKCa (小电导钙激活型钾通道)家族.设计巢式PCR引物,通过5′RACE和3′RACE分别克隆得到了该基因的5′端序列和3′端序列.使用生物学软件拼接3段序列得到了大菱鲆钙激活型钾离子通道TSKCa基因的全长序列.TSKCa基因cDNA全长为1 698 bp,其中开放阅读框长度为1 632 bp,编码的TSKCa蛋白有544个氨基酸.比对TSKCa蛋白与GenBank中已有的SKCa蛋白序列,证实其序列同源性很高.使用网络DAS和srsbin服务器对TSKCa蛋白进行跨膜结构预测和疏水性分析,并结合已有的研究结果推测TSKCa蛋白的结构由S1～S6六个跨膜结构域和一个孔道区(P区)组成.     

大菱鲆幼鱼蛋白质消化特征及其对水环境的影响

采用单因素随机区组设计,选择平均初重34.5±5.5g的大菱鲆幼鱼225尾,平均分为5组(A~E),每组3重复。分别饲喂蛋白质水平45%,48%,50%,52%和54%的5种膨化颗粒饲料,研究大菱鲆幼鱼的蛋白质消化特征及其对水环境的影响。结果表明:随着饲料蛋白质水平的提高,幼鱼的生长性能提高,饲料系数相应降低;蛋白质消化率先升后降,在50%蛋白组取得最大;蛋白质摄入量、消化量以及粪氮排出量明显增加;养殖水环境中氨氮和亚硝氮的浓度也不断提高。特别是在50%蛋白质水平以上时,幼鱼生长性能提高幅度缓慢,而粪氮排出量和水环境中氨氮含量显著提高(p<0.05)。试验表明,大菱鲆幼鱼环保饲料中蛋白质的适宜水平为50%。     

大菱鲆病原鳗利斯顿氏菌的药物敏感性测定与分析

对从大菱鲆(Turbot, Scophthalmus maximus L.)细菌性败血感染症的病(死)鱼中分离到并经鉴定的病原鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)进行了对常用抗菌类药物及弧菌抑制剂 O / 129 的敏感性测定.结果表明,供试的 20 株鳗利斯顿氏菌均对所测定的 37 种抗菌类药物中的头孢噻肟等 18 种药物高度敏感、对青霉素 G 等 6 种药物耐药、对头孢唑啉等 10 种药物耐药性菌株间有差异;2 株(S010610-3 和 S010610-4)对弧菌抑制剂 O / 129 具抗性,余 18 株均表现敏感.     

大菱鲆血清免疫球蛋白IgM的纯化及应用研究

用硫酸铵分级盐析法纯化大菱鲆血清免疫球蛋白IgM,所得产物用Sepharose-4B和DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析进一步纯化,以纯化的大菱鲆IgM免疫新西兰大白兔,获得兔抗大菱鲆IgM抗血清.SDS-PAGE电泳显示大菱鲆IgM重链为76 kD,轻链为27 kD;纯化的大菱鲆IgM重链与特异性抗血清具有较好的反应,而轻链与抗血清反应不明显;以制备的兔抗大菱鲆IgM抗血清为二抗建立了大菱鲆血清特异性抗体的间接ELISA检测方法,用该方法检测了鳗弧菌灭活疫苗免疫后大菱鲆产生特异性抗的变化规律,大菱鲆在免疫后第1周就产生了特异性抗体,在3周时达到峰值,该特异性抗体可维持13周以上.     

大菱鲆Hepcidin基因的克隆和真核表达载体的构建

Hepcidin是鱼类的一种重要的抗菌肽.通过比较GenBank中不同Hepcidin基因的同源相似性,设计出特异性的引物,以我国海水养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus L)肝脏为模板利用RT-PCR 技术克隆获得了一条基因.使用生物信息学手段对该基因序列进行了比对和分析,证实这条基因为Hepcidin1 precursor基因,属于Hepcidin基因家族.通过设计引物在Hepcidin基因的5′和3′端分别引入EcoR I和NotⅠ酶切位点.经过双酶切后获得具有EcoR I和Not I酶切位点的Hepcidin成熟肽片段,并与同样使用该酶线性化的表达载体pPIC3.5K连接.构建了表达载体pPIC3.5K/Hepc1,并将其导入到酵母基因组中,完成了真核表达载体的构建,为Hepcidin的真核表达作了基础性的准备工作.     

饲料中过量添加晶体蛋氨酸和蛋氨酸羟基类似物对大菱鲆生长、饲料利用和抗氧化反应的影响

以初始体质量为(5.49±0.01)g的大菱鲆幼鱼为实验对象,探讨饲料中过量添加晶体蛋氨酸或蛋氨酸羟基类似物对大菱鲆生长、饲料利用和抗氧化反应的影响.以白鱼粉和豆粕为主要蛋白源,饲料中同时添加0.25％ DL-蛋氨酸和0.3％蛋氨酸羟基类似物钙盐(MHA)作为对照,在此基础上分别添加0.5％ DL-蛋氨酸、1.25％ DL-蛋氨酸、0.59％MHA、1.49％ MHA、1.25％ DL-蛋氨酸+0.85％柠檬酸钙,配制出6种实验饲料,使饲料中蛋氨酸和蛋氨酸羟基类似物(HMTBA)含量分别是1.35％、1.83％、2.50％、1.45％、1.37％、2.51％和0.22％、0.22％、0.22％、0.63％、1.38％、0.29％.养殖试验在室内流水系统中进行,持续10周,每个处理设5个重复,每个重复放养大菱鲆幼鱼30尾.结果显示,过量添加DL-蛋氨酸和HMTBA对大菱鲆幼鱼生长无显著影响(P＞0.05).过量添加DL-蛋氨酸和HMTBA对大菱鲆体组分、肥满度(CF)、脏体比(VSI)和肝体比(HSI)均无显著影响(P＞0.05),但柠檬酸钙添加组(处理6)体蛋白含量与基础饲料组相比显著降低(P＜0.05).对大菱鲆肝脏过氧化氢酶( CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和肝脏硫代巴比妥酸反应产物量(TBARS)进行测定,各处理组间均无显著性差异(P＞0.05).结果显示,在该实验条件下,过量添加晶体蛋氨酸(1.31～1.73倍)和HMTBA(1.32～1.75倍)对大菱鲆幼鱼的生长、饲料利用和抗氧化反应没有显著影响.     

大菱鲆的营养研究进展

介绍了国外近年来大菱Ping的仔稚鱼期生物饵料、植物蛋白、脂类以及维生素对其生长及成活率影响的研究现状，以期为我国大菱Ping鱼的科学养殖提供参考。     

牛蒡寡糖对大菱鲆生长和免疫机能的影响

将自主研发的牛蒡寡糖作为添加剂添加到大菱鲆的基础饲料中,探讨其对大菱鲆(Scophthalmus maxi-mus)的生长和免疫机能的影响。经过60 d不同剂量(1.0%,2.0%,4.0%,6.0%)的饲喂试验,分别从每组随机抽取鱼体,测定其生长指标和血清中ACP,AKP,LSZ,SOD和PO等多种免疫相关酶的活力以及血液中白细胞的吞噬活性。结果表明,牛蒡寡糖作为一种非特异性免疫调节剂对大菱鲆表现出优良的促生长作用,还能显著提高大菱鲆的免疫相关酶活力和白细胞的吞噬活性,从而提高大菱鲆的非特异性免疫力,其适宜添加量为4.0%。牛蒡寡糖可以开发成为水产动物的促生长剂和免疫增强剂。     

不同倍性大菱鲆胚胎发育的比较研究

对真鲷(Pagrosomus major)冷冻精液诱导的大菱鲆(Scophthalmus maximus)单倍体、雌核发育二倍体和杂交二倍体,以及同源精子诱导的大菱鲆三倍体和普通二倍体的胚胎发育时序和形态进行了比较研究。结果表明,在水温(14.5±0.5)℃、pH=7.8～8.2和盐度29.7的孵化条件下,整个胚胎发育阶段,三倍体和雌核发育二倍体胚胎发育速度一直较普通二倍体为慢,三倍体稍快于雌核发育二倍体;单倍体囊胚期前胚胎发育速度最快,囊胚期后发育速度逐渐变慢,至原肠期滞留时间最长;尾芽期前杂交二倍体的胚胎发育速度一直比普通二倍体快,至心跳期胚胎发育开始停止,胚胎死亡,不能正常孵出;除杂交二倍体外的各实验组至孵化出膜所需时间和孵化率分别为:普通二倍体109 h 15min和(83.4±3.02)%,三倍体109 h30 min和(44.6±2.40)%,雌核发育二倍体112 h 15 min和(42.4±3.54)%,单倍体124 h 40 min和(4.5±1.91)%。各组胚胎发育形态上的差别主要表现为杂交二倍体胚胎畸形,胚体细长,多数器官分化不全;单倍体表现出典型的单倍体综合症;雌核发育二倍体、三倍体胚胎与普通二倍体相比,形态上没有明显差别,但初孵仔鱼畸形率显著增高。     

大菱鲆鳍细胞系的建立

建立大菱鲆(Scophthalus maximus)鳍细胞系,文中采用胰蛋白酶、透明质酸酶和Ⅱ型胶原酶消化法启动大菱鲆鳍组织的原代培养,并通过培养液配方和培养条件的优化成功进行大菱鲆鳍细胞的继代培养。研究结果显示,在pH=7.0~7.4、温度20~24℃的培养条件下,培养于含有表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、羧甲基壳多糖、N-乙酰葡萄糖盐酸盐的Leibovitz-15培养液(20%胎牛血清)中的大菱鲆鳍细胞,其生长分裂状况最好,细胞形态为成纤维细胞样。经继代培养后,细胞生长分裂依然十分旺盛,第60代大菱鲆鳍细胞系的群体倍增时间为62.4 h,虽然出现了染色体的非整倍性,但其特征性染色体仍为44条。该细胞系细胞经液氮冻存后仍保持有原有形态和较高存活率。现已成功建立了连续性大菱鲆鳍细胞系,目前已传至第65代。该细胞系的建立对于查清病毒对大菱鲆细胞的感染途径与感染机理等具有重要的理论意义,对于病毒疫苗研制具有重要应用价值。