注射氟苯尼考对红笛鲷免疫指标的影响

以0、5、10、20 mg.kg-1的氟苯尼考腹腔注射红笛鲷,研究氟苯尼考在国家规定的使用范围内对红笛鲷血清部分免疫指标的影响。结果显示:5 mg.kg-1组氟苯尼考对所测的各项指标无影响或影响不显著;10 mg.kg-1组中氟苯尼考对红笛鲷血清SOD活力、AKP活力有显著性提高(P<0.05),对溶菌酶的含量、IgM的含量无显著性影响;20 mg.kg-1组中红笛鲷血清碱性磷酸酶AKP、超氧化物歧化酶SOD活力、溶菌酶、抗体IgM均受到显著性抑制(P<0.05),但影响持续时间不同,这表明高浓度氟苯尼考显著抑制红笛鲷各项免疫指标,从而影响到鱼体自身的免疫功能。     

恩诺沙星在红笛鲷体内的药代动力学

在水温26±2℃、盐度28条件下,恩诺沙星(enrofloxacin,EF)按5 mg/kg的剂量腹腔注射和口灌红笛鲷(Lutjanus sanguineus),用反相高效液相色谱法研究恩诺沙星在红笛鲷体内的药代动力学和组织分布。结果显示:注射和口灌后红笛鲷血浆的药时数据均符合一级吸收二室模型;血药达峰时间(tp)分别为0.75和1.5 h,血药质量浓度峰值(cmax)分别为5.22和3.94μg/mL,药时曲线下面积(AUC)分别36.98和17.24 mg/(L.h),消除半衰期(t1/2β)分别为13.28和9.18 h;恩诺沙星在组织中分布较广,注射和灌服给药肌肉、肝脏和肾脏的cmax分别为3.53和3.40μg/g、4.08和3.98μg/g、11.23和5.40μg/g,tp分别为1.5和2.0 h、1.0和2.0 h、0.75和1.5 h,AUC分别33.17和23.12 mg/(L.h)、39.36和18.20 mg/(L.h)、98.97和56.69 mg/(L.h);EF在红笛鲷体内消除速度较慢,注射和灌服给药肌肉、肝脏和肾脏的t1/2β分别为22.08和83.32 h、41.52和94.47 h、20.94和21.81 h。表明恩诺沙星注射给药在红笛鲷体内的吸收和消除均快于口灌给药。     

红鳍笛鲷和紫红笛鲷种类和群体的矢耳石地标点法识别

【目的】探讨矢耳石地标法在笛鲷种内及种间中的判别作用。【方法】利用2017年购自广西北海、海南文昌、广东阳江的87尾红鳍笛鲷(Lutjanus erythropterus)和76尾紫红笛鲷(Lutjanus argentimaculatus)成鱼的矢耳石样本,基于地标点法分析耳石的形态差异,运用判别分析检验耳石形态差异在2种笛鲷的种间和同种不同群体间的判别功效。【结果】位于听沟前中部交叉点的两个地标点10、11贡献较大,解释了耳石形态变异的64.88%～65.85%,表明两种笛鲷耳石形态的种间差异和种内群体差异主要集中于听沟前中部。基于耳石形态的地标点方法对2种笛鲷的种间判别成功率为97.4%和100.0%;红鳍笛鲷和紫红笛鲷的种内不同群体判别成功率分别为85.7%、83.3%、80.0%和94.1%、78.1%、81.5%。【结论】矢耳石地标点法可作为2种笛鲷种间和种内判别的有效工具。     

红笛鲷弧菌病血清流行病学研究方法的建立

以红笛鲷Lutjanus sanguineus弧菌病的主要病原菌——溶藻弧菌Vibrio alginolyticus为抗原制备兔抗血清,以辣根过氧化酶标记的羊抗兔血清为酶标二抗,建立了酶联免疫吸附试验检测技术。通过棋盘滴定法测定,得出溶藻弧菌菌悬液的最佳工作浓度为5×108mL-1,兔抗溶藻弧菌血清的最佳稀释度为1∶16000,酶标羊抗兔抗体的最佳稀释度为1∶2000。应用本实验建立的间接双抗体夹心法对红笛鲷进行现场检测,患病红笛鲷特异性抗体的检出率为70%,外观健康红笛鲷的检出率为20%。结果表明,本实验所建立的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测法可以用于红笛鲷弧菌病的血清流行病学研究,而且可以检测出隐性感染状态下的红笛鲷。     

红笛鲷免疫器官发育组织学观察

【目的】研究红笛鲷（Lutjanus sanguineus）免疫器官发育,为其健康养殖和疾病预防提供理论基础。【方法】从红笛鲷卵出膜开始取样,至出膜62 d,通过石蜡连续切片,H-E染色,进行红笛鲷3个主要免疫器官胸腺、头肾、脾脏发育的组织学研究。【结果与结论】红笛鲷出膜1 d时出现前肾,3 d肾管之间可见造血干细胞;出膜18 d,胸腺和头肾间出现细胞桥,头肾淋巴化;出膜62 d,肾小球仍存在于头肾中,表明头肾既是淋巴器官也是泌尿器官。红笛鲷出膜8 d时出现脾脏原基和红细胞发育;出膜22 d时观察到淋巴细胞;出膜24 d时淋巴细胞显著变多。胸腺是最后一个出现的器官,红笛鲷出膜12 d时出现胸腺原基;15 d时发现胸腺淋巴化。     

红笛鲷CD40和去除信号肽CD40的原核表达

根据红笛鲷(Lutjanus sanguineus)CD40基因cDNA全长序列设计2对特异性引物,利用RT-PCR技术从红笛鲷头肾组织中扩增出CD40 ORF序列和去信号肽序列,分别与原核表达载体pET-32a(+)相连,构建原核重组表达质粒,命名为pET32-CD40和pET32-△CD40,并分别转化至大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导后,分别于54 ku和53 ku处有清晰的目的蛋白条带。融合蛋白的表达效率最佳的表达条件,pET32-CD40是诱导温度37℃,起始D(600nm)为0.4,IPTG浓度为0.08 mmol/L,诱导5 h;pET32-△CD40是诱导温度37℃,起始D(600nm)为0.6,IPTG浓度为0.10 mmol/L,诱导6 h。在各自优化的表达条件下,pET32-△CD40融合蛋白表达量较pET32-CD40融合蛋白高。RNAstructure软件分析发现,CD40的mRNA 5′端序列形成复杂且较为稳定的二级结构,不利于翻译的起始,表明信号肽序列的存在可能对CD40基因在原核细胞中的表达有一定的影响。     

红鳍笛鲷皮肤色素细胞组成、分布及类胡萝卜素含量分析

【目的】揭示红鳍笛鲷（Lutjanus erythropterus）红体色的分布特征及影响机制。【方法】利用色差仪分别测定背部、腹部和尾部皮肤的体色值,用形态学观察、石蜡切片、冰冻切片和透射电镜切片等方法分析色素细胞组成、分布和数量特征,并使用紫外分光光度法和液相色谱-质谱/质谱法研究类胡萝卜素和体色特征的关系。【结果与结论】红鳍笛鲷体表的红色素细胞显著多于黑色素细胞（P <0.001）,且从背部向腹部逐渐减少,红体色受到黑色素细胞分布的影响;皮肤和视网膜是类胡萝卜素的主要沉积部位,皮肤中类胡萝卜素以脂肪酸结合的形式存在,其中红色类胡萝卜素主要有虾青素、角黄素和β-柠乌素等3种,虾青素和角黄素含量与红色素细胞数量呈正相关。建议在饲料中补充虾青素和角黄素以提升红色。     

红鳍笛鲷(Lutjanus erythopterus)精巢发育的组织学研究

为掌握红鳍笛鲷的繁殖特性,通过石蜡切片、苏木精-伊红染色对红笛鲷精巢的发育进行组织学研究。结果表明,红鳍笛鲷的精巢属于叶状精巢,精子发生过程与其他脊椎动物一样,包括精原细胞、初级精母细胞、次级精母细、精子细胞和精子形成。精巢的生长发育过程的组织学结构共分为5期:3~4月龄精巢为第Ⅰ期精巢,精原细胞无定向分散在结缔组织之间;5~6月龄精巢为第Ⅱ期精巢,精原细胞成束分布,形成曲细精管的雏形;6~9月龄精巢为第Ⅲ期精巢,曲细精管出现管腔,曲细精管的管壁由精原细胞和大量初级精母细胞和次级精母细胞及少数精子细胞构成;10月龄精巢为第Ⅳ期精巢,曲细精管内除了精原细胞和初级精母细胞外、还形成了次级精母细胞和精子细胞,同时,管腔中出现极少量的精子;16月龄精巢为第Ⅴ期精巢,外观呈椭圆形的圆柱状,曲细精管的管腔和壶腹中充满成熟的精子。     

红笛鲷IRAK-1基因克隆及哈维弧菌感染后的组织表达

用同源克隆和RACE的方法克隆红笛鲷(Lutjanus sanguineus)白细胞介素1受体相关激酶1(Interleukin-1receptor-associated kinase 1,IRAK-1)基因的cDNA全序列,并用荧光定量PCR分析其在健康鱼及哈维弧菌感染后红笛鲷的组织表达。结果表明,该序列全长3 207 bp(登录号KF728204),包含5′非编码区(UTR)202 bp,3′UTR752 bp,开放阅读框(ORF)2 253 bp,编码750个氨基酸。根据推导的氨基酸序列预测其蛋白分子质量为82.6 ku,理论等电点为6.59。IRAK-1包含1个N端死亡结构域、proST结构域、中央激酶结构域和C末端结构域。荧光定量PCR分析显示,红笛鲷IRKA-1基因在肝脏和皮肤的表达量最高,其次是心脏、鳃、肌肉和胸腺,其余组织的表达量较低。哈维弧菌侵染红笛鲷后,各组织中IRAK-1基因mRNA表达量均呈上调趋势,肝组织中变化最显著。     

红笛鲷NCCRP-1基因原核表达条件的优化及纯化

通过克隆编码红笛鲷(Lutjanus sanguineus)非特异性毒性细胞受体蛋白-1(nonspecific cytotoxic cell receptor protein-1,NCCRP-1)成熟肽基因序列,然后与载体连接构建pET21a-NCCRP融合蛋白表达载体,将其转入大肠杆菌BL21进行诱导表达并优化条件。SDS-PAGE分析表明,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.8 mmol/L、37℃条件下培养3 h后表达量最大,分子大小与预期值相符,融合蛋白主要以包涵体形式高效表达,通过HisTrap HP柱子使其得到进一步纯化;Western blot分析表明,该融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性结合,说明获得该表达产物。     

红笛鲷脾脏、头肾和胸腺中IgM~+细胞与ANAE~+ T细胞的分布

采用ANAE组化方法(α-醋酸萘酯酶染色法)和ABC免疫组化方法(亲合素-生物素-过氧化物酶复合物法)分析了1龄红笛鲷成鱼的胸腺、头肾和脾脏中IgM+细胞(具有免疫球蛋白分子IgM的细胞)、ANAE+ T细胞的分布。结果表明,三个淋巴器官皆有IgM+细胞、ANAE+ T细胞;胸腺皮质区IgM+细胞数量最多,其次是头肾、胸腺髓质区、脾脏;ANAE+ T细胞以脾脏中数量居多,其次是头肾、胸腺髓质区、胸腺皮质区;ANAE+ T细胞在三个器官中多呈均匀分布,而IgM+细胞在血管、胸腺小体、黑色素巨嗜细胞中心等的外周呈密集分布。实验结果进一步证明了胸腺中的T细胞多为不成熟的T细胞,此外,还含有大量的IgM+细胞;而脾脏、头肾内的ANAE+ T细胞多于胸腺,推测胸腺成熟的T淋巴细胞迁移到头肾和脾脏。     

红笛鲷tdt基因融合蛋白原核表达条件的优化及纯化

克隆编码红笛鲷(Lutjanus sanguineus)末端脱氧核糖核酸转移酶TdT蛋白(Terminal deoxynucleotidyl transferases)成熟肽基因序列,并与pET-32a(+)载体连接,构建原核表达载体pET-32a-TdT,再将其转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。运用传统方法优化诱导条件,以提高重组融合蛋白的表达效率。SDS-PAGE分析表明,37℃、0.7 mmol/L IPTG条件下诱导4 h后,TdT融合蛋白的表达量最大,分子质量大小与预测值相符,该蛋白主要以包涵体形式存在。利用HisTrap HP亲和层析柱使TdT蛋白得到进一步纯化,最佳咪唑洗脱浓度为300 mmol/L,Western blot分析显示,该融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性的结合,表明表达蛋白为目的蛋白。     

红笛鲷重组激活基因rag1原核表达条件的优化及纯化

克隆编码红笛鲷(Lutjanus sanguineus)RAG1蛋白(recombination activating protein1)活性核心区的基因序列,并与pET-28a(+)载体连接,构建原核表达载体pET-28a-RAG1,将其转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,利用IPTG进行诱导表达。为提高融合蛋白的表达效率,运用传统的实验方法对诱导条件进行优化。SDS-PAGE分析表明,在37℃条件下,利用0.1 mmol/L IPTG诱导8 h后,RAG1重组融合蛋白的表达量最大,相对分子质量与预测值相符,该蛋白主要以包涵体形式高效表达,利用His Trap HP亲和柱使其得到进一步纯化;Western blot分析显示,该融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性结合,说明表达蛋白为目的蛋白。     

红笛鲷IRAK-4基因cDNA全长的克隆及组织表达分析

白细胞介素-1受体相关激酶4(interleukin-1 receptor-associated kinase 4,IRAK-4)是一种参与机体先天性免疫和适应性免疫反应过程中的关键分子。采用RT-PCR和c DNA末端快速扩增(RACE-PCR)的方法从红笛鲷(Lutjanus sanguineus)头肾中克隆IRAK-4基因的c DNA全序列(登录号:KF279357)。该序列全长2 015 bp,包含5′非编码区(5′UTR)205 bp,3′非编码区(3′UTR)421 bp,开放阅读框(ORF)1 389 bp,编码462个氨基酸。根据推导的氨基酸序列预测其蛋白分子质量为52.0 ku,理论等电点为5.19。氨基酸序列比对结果显示,红笛鲷IRKA-4基因氨基酸序列与其他物种的同源性为54.2%~85.7%。系统进化分析结果显示,红笛鲷与斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)聚为一支,两者有较近的亲缘关系。用荧光定量PCR分析红笛鲷基因的组织表达差异,红笛鲷IRKA-4基因在各组织中均有不同程度的表达,其中在皮肤、肝脏和胃中表达量最高,其次是胸腺、鳃、心脏、肠、肌肉和脾脏,在头肾、后肾和脑的表达量最低。     

紫红笛鲷随机扩增多态性DNA及遗传多样性分析

采用RAPD技术分析了湛江近海紫红笛鲷 (LutjanusargentimaculatusForsk l)的遗传多样性。从 12 0个随机引物中筛选出了 14个引物。 14个引物共检测到 173个位点 ,其中多态位点比例 (P)为 6 8.79%,遗传距离 (D)为 0 .2 2 2 8,遗传多样性指数 (H)为 0 .190 4。结果表明 ,目前湛江近海的紫红笛鲷自然群体的遗传多样性仍然维持在良好水平 ,捕捞尚未对其造成明显影响。