泥蚶(Tegillarca granosa)精氨酸激酶的基因克隆与表达

利用PCR扩增技术,从泥蚶的cDNA文库中克隆出了精氨酸激酶(arginine kinase)基因,并进行了原核表达.精氨酸激酶是调节能量代谢的重要酶类,在无脊椎动物体内能量平衡过程中起重要作用.结果表明,泥蚶的精氨酸激酶全长1601bp,包括5'非翻译区(5'-UTR)序列332bp,3'非翻译区(3'-UTR)序列...     

泥蚶(Tegillarca granosa)主要经济性状遗传参数的估算

采用巢式设计和人工控制授精方法构建了19个半同胞和41个全同胞泥蚶家系,研究了泥蚶各发育阶段生长性状遗传力及性状间遗传相关和表型相关。结果表明,泥蚶家系间各个阶段生长性状均存在一定变异,总体表现生长早期家系间变异较大,发育至后期家系间变异明显降低。在遗传力参数上,表现为体尺性状遗传力大于体重性状,如11月龄壳长、壳高、壳宽遗传力分别为0.298、0.313和0.257,而湿重遗传力仅为0.138;在体尺性状中,则表现为壳长、壳高的遗传力高于壳宽,如4月龄壳长、壳高遗传力分别达到0.378和0.357,而壳宽为0.312。各性状之间表型相关和遗传相关分析表明,不同发育阶段各性状表型相关系数都达到了极显著水平,而在遗传相关上,早期稚贝遗传相关系数均达极显著水平,发育至后期遗传相关系数变小。     

泥蚶(Tegillarca granosa)GT微卫星位点的筛选和性质鉴定

采用磁珠富集法,利用生物素标记的(GT)15寡核苷酸探针从泥蚶基因组DNASau3A1酶切的500—1000bp片段中筛选GT/CA微卫星位点。洗脱的杂交片段克隆到PMD18-T载体上构建富集微卫星基因组文库后,通过PCR筛选检测出阳性克隆进行测序。在139条序列中有115条序列包含有重复次数不少于5次的微卫星位点,阳性序列比例达到82.7%。其中perfect类型微卫星最大的重复次数为35次。在112条非冗余序列中,共有100条(88.5%)微卫星重复序列两端有侧翼序列能够进行引物设计。     

中国沿海不同地区泥蚶(Tegillarca granosa)的遗传多样性分析

以采自海南海口、广西防城港、广西北海、广东湛江、福建漳州、山东荣成、山东威海7个地理群体62个泥蚶个体为材料,获取592bp线粒体COI基因片段序列,并进行遗传多样性及分化分析。多态性遗传参数统计显示:62个个体共检测出103个多态性位点,定义了26个单倍型;总群体单倍型多样性指数为0.834,核苷酸多样性指数为0.01665,平均核苷酸差异数为9.85772。7个群体均显示出较丰富的遗传多样性,群体内遗传距离及群体内遗传多样性参数显示中国沿海泥蚶遗传多样性由北向南呈升高趋势,而群体内遗传分化系数也呈现升高的趋势。基于26个单倍型COI序列构建的NJ树和UPGMA树以及基于群体间遗传距离构建的UPGMA树显示,荣成群体和威海群体亲缘关系较近,聚成一小支,而后与漳州群体相聚,然而南方类群并没有聚为独立的一支。     

长牡蛎二倍体和三倍体生殖腺发育的组织学观察

对长牡蛎二倍体和三倍体生殖腺涂片检查结果表明,三倍体生殖腺发育较二倍体差,三倍体成熟卵母细胞和细胞核的体积分别是二倍体的１．６４和１．４４倍。组织切片检查结果,二倍体生殖腺发育正常,三倍体生殖腺发育受阻,大部分停留在增殖期的休止期,一部分虽发育至生长期和成熟期,但与同一发育期一二倍体比较,生殖腺发育差。三倍体雌性生殖腺发育较雌性好,三倍体雌雄性比为２．６２：１,在所取的样品中到３个雌雄同体个体。     

泥蚶(Tegillarca granosa)生长因子受体结合蛋白2(GRB2)基因的克隆与表达分析

通过已构建的泥蚶(Tegillarca granosa)转录组文库, 利用SMART RACE技术扩增得到泥蚶Tg-GRB2基因的全长cDNA序列, 并对其生物信息学、组织表达及发育阶段表达特征进行了分析。结果表明, 泥蚶Tg-GRB2 cDNA全长1283bp, 开放阅读框为708bp, 编码236个氨基酸; 蛋白结构预测显示, Tg-GRB2蛋白包含SH3-SH2-SH3三个功能域, SH2结构域由两端的α-螺旋和中间反向平行的β-折叠片构成, SH3结构域主要由β-折叠片组成, 具备典型的结构特征; 氨基酸序列比对发现, Tg-GRB2与脊椎动物的同源性为62.1%—63.8%, 而与玻璃海鞘和日本血吸虫同源性较低。qRT-PCR检测结果显示: Tg-GRB2 mRNA在泥蚶血液、斧足、鳃、外套膜、闭壳肌、内脏团6个组织中都有表达, 而在血液中的表达量极显著地高于其它组织; 在泥蚶的不同发育阶段中, Tg-GRB2 mRNA在 2—4细胞胚胎、原肠胚、担轮幼虫、D形幼虫中均有较高的表达量, 而在D形幼虫中表达量最高, 表明Tg-GRB2基因在泥蚶早期发育中发挥重要调节作用。     

绿鳍马面鲀重复发育雄性生殖腺结构与发育组织学观察

采用常规石蜡切片、HE组织染色法研究了性成熟绿鳍马面鲀雄性生殖腺结构和发育组织学。结果表明,性成熟绿鳍马面鲀精巢从外形上明显分为上、下两段,上段为生精部,下段为贮精囊。生精部分为2支,呈黄色、长条状;生精部为典型的小叶型结构;精小叶间有间质(Leydig)细胞。其生精部的发育历程可分为重复发育Ⅲ期、精子形成Ⅳ期、精子成熟Ⅴ期和退化吸收Ⅵ期。贮精囊位于精巢的后方并通过壶腹与生精部相连,贮精囊为椭圆形,白色不分支,其组织结构与贮存精子功能相适应,由许多被结缔组织分开的管状囊腔组成;贮精囊组织学变化与生精部周期性的变化相关,又有相对的独立性,也有周期发育,可分为恢复期、生殖期和退化期。     

泥蚶的性腺发育和生殖周期

根据生殖细胞发育的宏观和组织切片观察以及各期生殖细胞在滤泡中所占的比例，泥蚶的生殖腺发育过程分为增殖期、生长期、成熟期、排放期和休止期五个阶段。按肥满度的变化并结合性腺组织切片确定，泥蚶的性晚发育在青岛海区一年一个周期。繁殖期在７月上旬至８月下旬，繁殖盛期在７月中旬至８月中旬。至少有二次集中排放过程。     

泥蚶(Tegillarca granosa)血细胞转录组序列中免疫相关基因的结构与mRNA表达量分析

贝类血细胞直接参与异物吞噬和包囊作用,还在伤口修复、炎症反应过程中发挥重要作用,是机体免疫防御的承担者。本研究采用RNA-seq测序技术研究了鳗弧菌感染前后泥蚶血细胞的转录组序列,通过序列组装,获得了α-葡萄糖苷酶(GAA)、α-甘露糖苷酶(LAMAN)、芳基硫酸酯酶B(ASB)、天冬酰胺氨基葡萄糖酶(AGA)、整合素β3亚基(ITB3)、热休克蛋白9(HSPA9)和Toll相互作用蛋白(TOLLIP)序列,利用Orffinder获得了其编码蛋白序列,并对蛋白序列进行了理化性质、二级结构、保守结构域和三级结构分析。结果表明:7种蛋白质二级结构均含有α螺旋、β折叠及无规则卷曲,泥蚶和人类ITB3和TOLLIP具有相同的保守结构域, Swiss-model同源建模获得的三级结构与模板同源性均超过35%(TOLLIP除外)。鳗弧菌刺激后,GAA、LAMAN、ASB、AGA和HSPA9的表达量显著增加,ITB3和TOLLIP表达量变化不明显。该研究补充和完善了对泥蚶免疫相关基因的认识,并为进一步开展泥蚶抗病机理研究提供了重要的理论依据。     

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)对镉胁迫下泥蚶(Tegillarca granosa)的抗氧化酶活性和免疫相关基因表达的影响

本文研究一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)对提高泥蚶耐受镉(Cd2+)胁迫的作用,实验分析了不同浓度地衣芽孢杆菌对Cd2+胁迫下泥蚶(Tegillarca granosa)的存活率及组织中Cd残留量的影响;同时比较了地衣芽孢杆菌作用前后,泥蚶体内两类抗氧化酶,超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性,进一步通过Real-time PCR分析了三类免疫相关基因金属硫蛋白(MT)、小热休克蛋白分子(sHSP)和铁蛋白(ferritin)的表达情况。研究结果显示,地衣芽孢杆菌能降低泥蚶组织中Cd残留量,提高其存活率。并能有效促进泥蚶体内SOD和GSH-Px酶活性的增加,同时降低MT、sHSP和ferritin在mRNA水平上的表达。数据表明该地衣芽胞杆菌可通过调节泥蚶的免疫系统,起到降低Cd2+对泥蚶毒害的作用。     

泥蚶初级卵母细胞发育及卵黄发生的超微结构研究

利用透射电镜技术观察了泥蚶(Tegillarca granosa)初级卵母细胞发育期间各细胞器的特征及卵黄粒的形成过程.结果显示:泥蚶初级卵母细胞的发育过程可以分为卵黄合成前期、卵黄合成期及卵黄合成后期三个时期.在卵黄发生过程中,线粒体、高尔基体、粗面内质网、微吞饮泡等都参与了卵黄粒的形成,且线粒体和粗面内质网是形成卵黄粒的主要胞器.卵黄发生的原料以外源性合成为主,外源性营养物质主要来自消化腺.     

泥蚶(Tegillarca granosa)肉质的蛋白组学研究

采用双向电泳技术,对广东阳江和浙江乐清两地的泥蚶肌肉全蛋白进行了研究,并利用质谱和软件对差异蛋白进行了分析.研究结果表明,阳江和乐清两地样品平均检测到的蛋白点数分别为674±25和746±34个,平均匹配率为78.6%.差异表达蛋白质点数为26个,其中3个点仅在阳江泥蚶中表达,5个点仅在乐清泥蚶中表达;6个点在阳江泥蚶中为高表达,12个点在阳江泥蚶中为低表达.选择其中6个具有代表性的蛋白点进行肽指纹图谱分析.结果显示,乐清泥蚶中高表达的4个蛋白确定为肌动蛋白、PRKA激酶锚定蛋白9、烯醇化酶.这些物质与泥蚶的肉质特性有一定关联.乐清地区出产的泥蚶在营养、肉质和鲜美度方面均优于阳江地区的泥蚶.     

仿刺参生殖腺发生与早期分化的组织学观察

采用组织学方法,初步研究了仿刺参(Apostichopus japonicus Selenka)生殖腺的发生及早期分化的过程。结果表明,仿刺参的生殖腺位于背肠系膜处,在体长为0.1 cm的稚参中出现含有约10个原生殖细胞的原始生殖腺;体长0.5cm的稚参,原始生殖腺的中央腔明显,生殖腺初具雏形;体长3 cm的幼参中,生殖腺出现二分枝并且生殖腺上皮出现分层结构,内层为排列较松散的生殖细胞,外层为排列紧密的个体较小的上皮样细胞,此时仿刺参生殖腺的基本结构已经具备;幼参体长4 cm时,生殖腺的部分管壁内层细胞向内发生褶皱,形成以生殖细胞为主的嵴状突起,随着发育的进行,生殖腺管腔内侧的嵴状突起更加密集。     

泥蚶(Tegillarca granosa)遗传连锁图谱的构建

采用AFLP标记技术结合"拟测交"策略,对泥蚶父、母本和109个F1全同胞个体进行了遗传连锁的分析研究,构建了泥蚶的遗传连锁图谱。结果表明,在638个分离标记中,符合1:1孟德尔分离类型位点的母本和父本分离标记分别为235和259个;3:1孟德尔分离类型位点59个。雌性图谱包括21个连锁群,标记间平均间隔为8.12cM,图谱共覆盖1737.8cM,覆盖率为83.1%;雄性图谱包括20个连锁群,标记间平均间隔为5.81cM,图谱共覆盖1388.2cM,覆盖率为84.7%。     

泥蚶苗种的增殖研究

１９９１～１９９２年在青岛市黄岛区薛家岛镇唐岛湾进行了泥蚶苗种增殖试验。研究结果表明，泥蚶天然苗种增殖的主要技术措施有：首先要留足亲贝，保证１．８个／ｍ２亲贝；其次是准确预报泥蚶产卵及幼虫附着期，然后及时采取平畦、挑沟、撒砂等措施人工改造滩涂环境，可使泥蚶附苗率增加达（７～５６）×１０－２。     

条石鲷( Oplegnathus fasciatus) 心脏早期发育的组织学观察

应用石蜡切片技术和显微测量法,对条石鲷心脏的早期发生、分化和形成过程进行了连续观察。结果表明,在水温(24±1.0)℃的条件下,心脏原基在受精后13h30min出现于中部脑的腹面,其外部由卵黄多核层包围,内部则为扁平细胞所填充;受精后20h30min,心脏开始搏动,可见血细胞;初孵仔鱼心脏呈直管状,位于体腔前端;2日龄(daysafterhatching,DAH),心脏分化成静脉窦、心耳(心房)、心室和动脉球四个部分;3日龄,耳室瓣和半月瓣形成;6日龄,窦耳瓣和心小室形成;12日龄,心脏内血细胞的数量急剧增加,血流量显著加大;27日龄,心耳内形成小梁结构,心脏发育完善。     

苯并芘B[a]P对泥蚶组织EROD、GST酶活力和MDA含量的影响

采用实验生态学的方法,通过染毒和清除,研究了不同浓度(0.05、0.5、5和10 μg/L)苯并芘B[a]P胁迫15d和释放15d后,泥蚶(Tegillarca granosa)消化盲囊和鳃丝乙氧基异吩唑脱乙基酶(EROD)、谷胱甘肽转移酶(GST)活力和脂质过氧化物(MDA)含量的变化。结果表明: 在胁迫阶段0.5、5 和10μg/L,B[a]P处理组对泥蚶消化盲囊和鳃丝EROD、GST 酶活力和MDA含量显著影响(P＜0.05), EROD、GST 酶活力分别被诱导和抑制,第5d趋于稳定, MDA含量随时间呈上升趋势, 在第10d基本达到峰值并趋于稳定。在清除阶段, EROD活力和MDA含量逐渐下降, GST活力逐渐升高, 并在5～10d恢复到对照组水平。本研究中, EROD和GST活力的变化能够反映机体解毒代谢的能力, MDA含量的变化反映了机体氧化损伤的程度,表现出了一定的剂量和时间效应。     

条石鲷消化道发育的组织学观察

对人工养殖的条石鲷（Oplegnathus fasciatus）仔、幼稚鱼消化道及消化腺的发育过程进行了系统的组织学观察。研究表明： 初孵仔鱼 （体长1.66～2.20 mm）的消化道完全处于未分化状态。1 日龄仔鱼全长1.83～2.32 mm, 消化道中部开始形成空腔, 为初始的消化道腔。2 日龄仔鱼全长2.61～2...     

军曹鱼(Rachycentron canadum)性腺分化及首周年发育的组织学观察

本研究采用石蜡组织切片和H.E.染色法对军曹鱼原始性腺的形成、分化及精巢和卵巢首周年发育的组织结构变化进行观察。结果显示,军曹鱼原始生殖细胞在7孵化日龄(days post hatching,dph)时迁移到达生殖嵴,随后体细胞出现聚集和分裂,并于15 dph将原始生殖细胞完全包绕形成原始性腺。军曹鱼卵巢分化的时间要早于精巢,34 dph的稚鱼性腺组织尚未分化,但可观察到两种存在明显组织学差异的性腺类型,其中一种类型的性腺出现卵原细胞群,而另一种类型的性腺横切面较狭长,生殖细胞数量明显较少,因此推定为未分化精巢;卵巢的解剖学分化开始于44 dph,其标志为卵巢腔的形成;50 dph时精巢开始细胞学上的分化,此时精原细胞由基底膜包被形成囊泡状的细胞团。在首周年发育期间 (60～360 dph),军曹鱼的精巢发育包含I、II、III、IV、V 5个时期,而卵巢发育只包含I、II、III 3个时期。60 dph时,精巢和卵巢均处于I期;90 dph时,精巢发育至II期,卵巢仍处于I期;120 dph时,超过半数的精巢已发育至 III期,仅少部分卵巢发育至II期;150 dph时,精巢已发育至III期,而大部分卵巢发育至II期;185 dph时,精巢仍为III期,卵巢均已发育至II期;210 dph时,大部分精巢发育至IV期,卵巢仍处于II期;360 dph时,精巢已发育至V期,大部分卵巢发育至III期。上述研究结果可丰富军曹鱼的繁殖生物学研究基础,阐明其早期性腺发育规律,还可为其人工繁殖提供理论依据。     

养殖光唇鱼(Acrossocheilus fasciatus) 卵巢发育的组织学观察

采用解剖及石蜡切片技术,观察研究了养殖光唇鱼(Acrossocheilus fasciatus)卵巢发育的形态及组织学结构特征。结果表明,第一次性周期内,4—5月龄鱼卵巢处Ⅰ期,内以第Ⅰ时相卵细胞为主;6—18月龄鱼卵巢处Ⅱ期,内以第Ⅱ时相卵母细胞为主,单层滤泡膜形成;19—20月龄鱼卵巢处Ⅲ期,内以第Ⅲ时相卵母细胞为主,双层滤泡膜及放射带形成,胞质内出现液泡及卵黄粒;21—22月龄鱼卵巢处Ⅳ期,内以第Ⅳ时相卵母细胞为主,胞质内充满卵黄粒;23—24月龄鱼卵巢处Ⅴ期,内以第Ⅴ时相卵母细胞为主,滤泡膜脱落;25月龄鱼卵巢处Ⅵ期,内以空滤泡和第Ⅱ、第Ⅲ时相卵母细胞为主。6—7月为主要产卵期,9月产后卵巢恢复至Ⅱ期,12月进入Ⅲ期,并以该期越冬,4月卵巢重新往前发育。光唇鱼属短期分批产卵类型鱼类。