雄性半滑舌鳎雄激素受体基因的克隆与表达分析

利用RT-PCR方法从半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)中克隆了雄激素受体(Androgen receptor,AR)基因cDNA的部分序列(434 bp),经BLAST比对与狼鲈(Dicentrarchus labrax)、花溪(Kryptolebias marmoratus)、三斑海猪鱼(Halichoeres trimaculatus)和三刺鱼(Gasterosteus aculeatus)的雄激素受体同源性分别为84%,82%,82%和81%.组织表达分析表明,AR基因在半滑舌鳎的性腺、肝、胃、脾、肾、头肾、肠、鳃、心、脑和肌肉这11种组织中均有表达,表达量有所差异.肾中表达量最丰富,鳃中最少.根据其他硬骨鱼类表达模式,推测半滑舌鳎可能只含有1种AR.     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)生长激素体外重组表达及活性分析

根据半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)生长激素(GH)基因的c DNA全长序列设计引物克隆得到其全长552个碱基成熟肽序列。利用RT-PCR方法将扩增片段克隆到原核表达载体p ET-28a上,实现了GH成熟肽在大肠杆菌BL21(DE3)中的融合表达。融合蛋白分子量为26 k Da,在IPTG诱导4h时目的蛋白表达量最高,占细菌总蛋白的41.5%,主要以包涵体形式存在。Western-blotting分析表明GH融合蛋白可特异性地被6×His抗体识别。诱导表达后的菌液沉淀经纯化和复性后,获得大小为26 k Da的纯化GH融合蛋白。以ELISA方法检测纯化后的GH融合蛋白显示其具有免疫学活性。本研究为认识半滑舌鳎生长轴的调控机制提供了基础资料。     

半滑舌鳎促黄体激素受体基因片段的克隆及组织表达分析

采用巢式RT-PCR法克隆了半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis促黄体激素受体(Luteinizing Hormonene Receptor, LHR)基因部分序列,经过BLAST比对,认为该序列与庸鲽、牙鲆、黑鲷、尼罗罗非鱼、青鳉和红鳍东方鲀的LHR基因同源性分别为97%,94%,85%,83%,82%和80%.该基因片段长度为614 bp,编码204个氨基酸,含有典型的跨膜螺旋结构区域(TM helix),属于糖蛋白激素受体(GHR)家族.组织表达分析表明,LHR基因在半滑舌鳎的卵巢、精巢、肝脏、胃、肠、鳃、心、脾、肾、头肾和脑中均有表达,表达量有所不同,以脾和肾中表达量最丰富.     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)GnRHR基因全长cDNA 的克隆与组织表达分析

采用同源克隆和末端快速扩增(RACE)方法, 克隆了半滑舌鳎中 GnRHR 全长 cDNA。通过基因全长以及推断的氨基酸序列分析, 得知该序列包含一个 7tm-1 保守结构域, 为 G 蛋白偶联受体家族成员。利用 PHYLIP 3.5c 邻位相连法以及 DNAstar 中的 CLUSTAL W 方法对相应的氨基酸序列进行了聚类分析和序列相似度分析。结果表明, 半滑舌鳎 GnRHR 鳉 与鲈鱼、琥珀鱼、虹鳟以及青 等鱼类中的 GnRHR聚为一支, 亲缘关系较近, 且相似度较高, 分别为 90.1%、 89.7%、 79.0%以及 78.3%, 而与高等哺乳动物人、小鼠相似性仅分别为 18.8%和 16.2%, 亲缘关系较远。应用半定量 RT-PCR 技术分析其组织表达, 发现 GnRHR 广泛表达于各个组织, 但表达量差异较大, 在性腺、脑和肾中表达量较高, 其它组织较弱。     

半滑舌鳎稚鱼脂肪分解关键酶基因的克隆及饲料中脂肪水平对其表达的调控

克隆了半滑舌鳎脂肪分解关键酶基因即激素敏感脂肪酶(Hormone-sensitive lipase,HSL)和脂肪甘油三酯脂肪酶(Adipose triglyceride lipase,ATGL)cDNA部分序列,并探讨了饲料中脂肪水平对半滑舌鳎稚鱼HSL及ATGL基因表达的影响。克隆所得到的HSL和ATGL片段长度分别为589bp和581bp,序列和系统进化分析表明半滑舌鳎的HSL和ATGL与大部分鱼类具有较高的同源性。采用不同水平的鱼油配制成5种不同脂肪水平(6.68%、9.84%、13.47%、17.89%和21.88%干物质)的等氮饲料,饲养35日龄半滑舌鳎稚鱼30d,养殖过程中每天饱食投喂5次,养殖实验结束后采用实时荧光定量PCR分别测定各处理稚鱼内脏团的HSL及ATGL mRNA相对表达量。结果表明,高脂饲料组(21.88%)显著促进了半滑舌鳎稚鱼内脏团HSL基因的表达(P0.05),但饲料脂肪水平对于半滑舌鳎稚鱼内脏团的ATGL表达量未产生显著影响(P0.05)。     

半滑舌鳎的一种细胞凋亡抑制因子的克隆、鉴定与分析

克隆半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的1种细胞凋亡抑制因子survivin基因,并对其序列及表达模式进行分析.结果表明,该基因cDNA 序列全长704 bp(GenBank登录号为EU499314),包括86 bp5'非翻译区,444 bp开放阅读框以及含 poly(A)信号的174 bp的3'非翻译区,编码147个氨基酸.氨基酸序列同源性分析表明,半滑舌鳎survivin氨基酸序列与斑马鱼、非洲爪蟾、鸡、小鼠和人survivin氨基酸序列的同源性分别达到了63.3%,49.0%,43.7%,43.6%和41.5%.RT-PCR分析表明,survivin基因在半滑舌鳎成体雌鱼卵巢中大量表达,在雌鱼的肾脏中微量表达,在其它雌鱼的组织中无表达,在雄性的任何组织中均无表达.该基因在受精卵、多细胞和囊胚3个胚胎发育的早期阶段,大量表达,而随着胚胎发育的进程,survivin基因的表达逐渐减少,在孵化前尾芽期胚胎中只有微量表达,在孵化后5 d的仔鱼中,几乎检测不到survivin基因的表达.表明该基因可能参与卵子形成和胚胎的早期发育.     

程序化设计的简并引物克隆半滑舌鳎CYP17基因

采用1种新的简并引物设计方法--CODEHOP法来克隆半滑舌鳎CYP17基因.该法结合NCBI、Blastp、BlockMaker、CODEHOP等生物信息学资源和DNAMAN、Oligo6.0等生物软件,程序性设计半滑舌鳎CYP17基因的CODEHOP引物,从半滑舌鳎卵巢组织中成功克隆了CYP17基因,该基因片段与其它物种的CYP17家族具有较高的同源性,经鉴定,该基因属于整个脊椎动物的CYP17基因群,尤其是鱼类亚群.实验结果表明,程序性设计的简并引物较传统简并引物特异性更高,假阳性率少,更有利于实验成功.     

栉孔扇贝骨形态发生蛋白Ⅰ型受体基因的克隆及表达分析

首次在栉孔扇贝(Chlamys farreri)中克隆了骨形态发生蛋白I型受体(Bone morphogenetic protein type Ⅰ receptor,cfBMPR1)基因cDNA全长序列,该基因开放阅读框长1560bp,编码为519个氨基酸。实时荧光定量反转录PCR(real-time qRT-PCR)分析结果显示,cfBMPR1基因在栉孔扇贝受精卵、4细胞期、囊胚、原肠胚、担轮幼虫期、D型幼虫期和壳顶幼虫期等发育时期均有表达,其中胚胎时期表达量高于幼虫期,提示该基因在扇贝早期发育及幼虫形态形成过程中的重要作用;在成体组织,包括外套膜、鳃、性腺、肾、横纹肌和消化腺中也均检测到了cfBMPR1的表达,其中以性腺和横纹肌中表达量最高,暗示其参与了扇贝包括繁殖和肌肉生长发育等在内的多种生物学过程。研究结果为进一步研究TGF-β信号通路在扇贝生长发育中的功能提供了基础数据。     

半滑舌鳎3个形态性状与体质量的相关及通径分析

为了深入认识半滑舌鳎形态性状与体质量之间的关系,本研究使用831尾12月龄左右半滑舌鳎个体的体质量[BM(g)]和形态性状,包括全长[TL(cm)]、体高[BH(cm)]、体厚[BW(cm)],通过模型拟合筛选获得能够反映雌、雄性个体各个形态性状与体质量关系的最佳模型。建立了以形态性状为自变量、体质量作为因变量的回归方程,并计算了直接、间接通径系数和决定系数。模型拟合结果显示,雌、雄个体全长、体高和体厚与体质量的最优拟合模型都为幂函数曲线模型,雌性个体3个形态性状与体质量的最优模型分别为:y⌒=0.004x3.090、y⌒=0.382x2.983、y⌒=61.912x2.461;雄性个体的3个最优模型公式依次为:y⌒=0.005x3.003、y⌒=0.300x3.147、y⌒=57.681x2.156。通径分析结果显示,雌性个体中体高对体质量的直接影响最大,通径系数为0.535,而雄性个体全长对体质量的直接作用最大,通径系数为0.407。雌、雄个体的3个形态性状对体质量都有极显著的直接作用,其最优多元回归方程:雌性为BM=-88.530+1.297 TL+15.862 BH+39.021 BW;雄性为BM=-71.579+2.587TL+7.351 BH+35.595 BW。     

Evaluation of reference genes for quantitative real-time PCR analysis of gene expression during early development processes of the tongue sole (Cynoglossus semilaevis)

Differential expression of genes is crucial to growth and development of fish. To select the appropriate genes for gene normalization during Cynoglossus semilaevis early developmental process, eight candidate reference genes (ACTB, B2M, EF1A, GADPH, RPL7, TUBA, UBCE and 18S) were tested for their adequacy by using quantitative real-time PCR. The results showed that the expression of all the examined genes exhibited tissue dependent variations in the mature C. semilaevis. EF1A was listed as the most stable reference among the 14 tissues by RefFinder. Furthermore, the recommended comprehensive ranking of the stability determined by RefFinder showed that 18S was the most stable gene during the early developmental stages (from oosphere to 90 days old) in this study. However, when divided the C_t value data of the above mentioned early developmental stages into two separate periods (embryo and post-hatching periods), TUBA and 18S represented the most stable references of these two developmental periods, respectively. Consequently, the reference gene should be carefully and accurately chosen even for studies of the same species at various developmental processes. The relevant data may help in selecting appropriate reference genes for mRNA expression analysis, and is of great value in the studies of fish growth and development.     

人工养殖半滑舌鳎卵巢发育及其产卵类型研究

研究了人工养殖半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)卵巢发育组织学的季节变化及其与性成熟系数(gonadosomatic index,简称GSI)和肝质量指数(hepatosomatic index,简称HSI)的关系。结果表明,半滑舌鳎成熟鱼卵巢发育经历Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期、Ⅵ期,再到重复发育Ⅱ期;人工养殖条件下,3~5月份大部分鱼卵巢处于Ⅱ期,从6月份开始,其卵母细胞内开始沉积卵黄颗粒,9~11月份,卵母细胞内卵黄颗粒充盈整个胞质,基本达到生长成熟,排卵后至翌年2月份,卵巢进入了退化吸收Ⅵ期或重复发育Ⅱ期;繁殖期GSI达到最高峰;产卵后或重复发育Ⅱ期,GSI显著下降,此时HSI显著升高至全年最高峰;半滑舌鳎在1 a中只有1个繁殖期,进行分批产卵。     

半滑舌鳎肾脏组织结构与细胞种类研究

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是中国重要的海水养殖鱼类品种,目前对于其肾脏结构与细胞种类的研究较少。本研究以半滑舌鳎肾脏为研究对象,通过切片技术、免疫组织化学与显微镜观察,描述半滑舌鳎肾脏结构与细胞分布情况。结果显示,半滑舌鳎的肾脏可以分为头肾与体肾两部分;头肾较小,具有独立的结构,位于肾脏前部,靠近脑,形态上呈分叉状;头肾由淋巴髓样细胞构成,无肾小球等分泌结构,免疫细胞丰富,包括淋巴细胞、单核细胞、颗粒细胞,是半滑舌鳎免疫细胞的主要生发部位之一,是免疫系统的重要组成;半滑舌鳎的体肾与头肾后部分叉处相连,呈纺锤状,紧贴腹腔背部,向后延伸;体肾主要由肾单位组成,有丰富的肾小囊、近曲小管、远曲小管和集合管结构,表明其具有排泄功能。     

10 个半滑舌鳎家系 MHC IIB 基因多态性初步研究

为检测10个半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)家系MHCⅡB(Cyse-DAB)基因的多态性水平、MHCⅡ类B位点数目以及平衡选择的作用,作者利用多聚酶链式反应(PCR)和直接测序的方法对10个半滑舌鳎家系MHCⅡB基因位点遗传变异和平衡选择进行了研究。用特异性引物和PCR扩增的半滑舌鳎MHCⅡB基因片段大约397 bp,包含一部分第一外显子,全部第一内含子和全部第二外显子。10个半滑舌鳎家系中,每家系选取5个体,每个体5个克隆序列分析发现60个不同序列,代表60个等位基因,其中有28个是新发现的,已提交到Gen Bank。同源分析表明60个等位基因相似性为89.36%。共50个个体中,有6个存在5个不同等位基因,表明在半滑舌鳎至少存在3个座位。有9个家系的MHCⅡB序列多肽结合区(PBR)的非同义替换(dN)显著高于同义替换(dS)。     

脊尾白虾Dnmt2启动子克隆及其转录调控分析

为探明脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda) Dnmt2 (DNA methyltransf-erase2, Dnmt2)启动子对Dnmt2转录的调控作用, 本研究利用染色体步移技术克隆得到脊尾白虾Dnmt2启动子, 使用在线软件预测该基因启动子区域的转录调控元件及转录因子结合位点, 通过构建一系列缺失表达载体, 利用双荧光素酶报告基因检测技术鉴定了该基因核心启动子区, 并对其启动子活性进行检测。结果表明, 克隆的脊尾白虾Dnmt2启动子长度为1315 bp, 转录起始位点“A”位于ATG上游236 bp, 启动子区域含有多种转录因子结合位点, 包括STAT3、SOX、NF-κB、E2F、GATA-1等, 但缺乏CpG岛。双荧光素酶报告基因检测显示, Dnmt2核心启动子区位于–196~+81 bp, 对启动子区域进行活性检测发现, 在该基因启动子–640~–452 bp区域内可能存在促进基因表达的转录调控元件, 而在–1160~ –640 bp区域可能存在抑制该基因表达的转录调控元件。本研究结果为进一步研究Dnmt2启动子的表达调控机制提供理论依据。     

缢蛏天然抗性相关巨噬蛋白2(Sc-Nramp2)基因克隆及其在副溶血弧菌刺激下的表达分析

克隆得到缢蛏天然抗性相关巨噬蛋白2（Sc-Nramp2）基因的cDNA全长序列3 681 bp,该基因的开放阅读框有1 776 bp,编码591个氨基酸,预测分子量为65.86 kDa;其结构具有Slc11蛋白家族的典型特征,包括有10个典型的跨膜结构和2个糖基化位点。Sc-Nramp2基因3'-UTR有2个类似于脊椎动物Nramp2中铁反应控制蛋白结合位点;同源性分析表明,Sc-Nramp2和太平洋牡蛎Nramp2-like的同源性最高为71.6%。实时荧光定量PCR结果表明,Sc-Nramp2基因在闭壳肌、外套膜、肝胰腺、斧足、水管和鳃6个组织中均有表达,其中肝胰腺中的表达量最高,其次是鳃,与其他组织均有极显著性差异（P<0.01）;注射副溶血弧菌后,肝胰腺中Sc-Nramp2基因的表达量较对照组显著上调（P<0.01）,且表达量呈现先上升后下降的趋势,在12 h时达到最大表达量,推测Sc-Nramp2基因参与了缢蛏非特异性免疫应答反应。