运用RAPD技术分析3种罗非鱼的遗传多样性

应用RAPD技术,从7个系列140种随机引物中筛选出15个,对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)、奥利亚罗非鱼(O.aureus)和星洲银罗非鱼(O.sp.)进行遗传多样性分析。结果表明,尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼、星洲银罗非鱼的多态位点比例(P)分别为54.7%、44.4%和56.0%,种内个体间遗传距离分别为0.145 0、0.115 6和0.141 3,种内遗传相似系数分别为0.855 0、0.884 6和0.858 7;种间遗传距离的聚类分析表明,星洲银罗非鱼与尼罗罗非鱼亲缘关系较近,一定程度上验证了星洲银罗非鱼的分类地位。     

奥利亚罗非鱼微卫星位点的筛选

从GenBank上选取40对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的微卫星引物,分别在奥利亚罗非鱼(Oreo-chromis aureus)(83系)、红色奥利亚罗非鱼、奥利亚罗非鱼(02系)和尼罗罗非鱼的基因组上进行扩增。40对引物中有37对(92.5%)可进行有效扩增,32对引物(80%)可检测到个体间等位基因的多态性。其中引物UNH168与奥利亚罗非鱼的性别相关,在雌性个体中可扩增出二条大小不同的特异带(分别为135和171 bp),在雄性个体中则只有一条(171 bp)。将特异条带回收、克隆并测序,结果显示雌雄个体中171 bp条带的序列完全相同,包括103bp的侧翼序列和34个CA重复,在雌性个体中获得的135 bp条带则只有16个CA重复。引物UNH846、UNH860和UNH995可鉴别奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼,UNH890可鉴别出红色奥利亚罗非鱼。可见,大部分的尼罗罗非鱼微卫星位点存在于奥利亚罗非鱼中。     

罗非鱼4个选育群体遗传结构SSR分析

采用SSR分子标记分析了吉富品系罗非鱼的两个家系(GF1和GF2)以及奥利亚罗非鱼(Fo)和奥本尼罗罗非鱼(Fn)群体的遗传结构。结果显示,扩增后等位基因数为3～8个,随引物不同而异,14对引物共扩增60个等位基因,扩增片断大小在102～267 bp之间。微卫星分析表明,奥本尼罗罗非鱼(Fn)的平均观测杂合度(0.764 3)和平均期望杂合度(0.519 6)均最高,吉富尼罗罗非鱼(GF1)平均多态信息含量(0.419 5)最高;吉富尼罗罗非鱼(GF2)平均观测杂合度(0.614 2),奥利亚罗非鱼(Fo)的平均期望观测度(0.446 6)、平均多态信息含量(0.359 2)最低;因此,吉富鱼(GF1)的遗传多样性最高,奥利亚的遗传多样性最低。Hardy-Weinberg平衡遗传偏离指数(D)奥利亚(Fo)和尼罗(Fn)(0.463 4和0.478 9)明显高于吉富的两家系(0.234 1和0.250 0)。Fo与GF2间遗传距离(0.477 0)最大;而GF1和GF2间的遗传距离(0.302 7)最小,遗传相似系数(0.607 3)最大,可推断新一代吉富罗非鱼与本地选育群体有相对较远的亲缘关系,更具杂种优势。     

基于18S-ITS1-5.8S序列的吉富罗非鱼群体遗传多样性分析

运用PCR技术扩增吉富罗非鱼选育群体第20和21世代18S-ITS1-5.8S序列,分析二序列的遗传变异。结果表明,18S-ITS1-5.8S序列中,18S、内转录间隔区(ITS)1和5.8S序列分别为156、483~540、64 bp,主要变异位点位于ITS1中;基于ITS1序列的第20代吉富罗非鱼(17尾)群体内遗传距离为0.001,保守位点530个,变异位点10个,单倍型4个,单倍型多样性为0.331±0.143,核苷酸多样性为0.002,平均核苷酸差异为1.279;基于ITS1的第21代吉富罗非鱼(42尾)群体内遗传距离为0.015,6个个体存在严重碱基缺失现象,保守位点492个,变异位点49个,单倍型12个,单倍型多样性为0.638±0.083,核苷酸多样性为0.014,平均核苷酸差异为6.945。ITS序列在该两吉富罗非鱼群体中变异较小,基于ITS1序列分析的两代群体遗传多样性水平较低。     

罗非鱼群体选育及奥尼杂交种生产技术

为提高罗非鱼雄性率 ,取淡水渔业研究中心引进的奥本品系的奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼 ,通过群体选育保存亲本的优良性状 ,用尼罗罗非鱼♀×奥利亚罗非鱼♂的杂交手段 ,繁育的杂交种奥尼鱼雄性率 95 %以上。 6a来选育的后备亲本共 75万尾 ,生产奥尼鱼苗 5 .2亿尾。     

两个奥利亚罗非鱼群体热休克蛋白70基因序列比对分析

采用RACE技术,对两个奥利亚罗非鱼群体(Oreochromis aurea)(美国奥利亚和中国奥利亚)热休克蛋白Hsp70基因完整编码区(code sequences,CDS)cDNA的进行克隆测序。序列分析结果表明:两个奥利亚罗非鱼群体热休克蛋白Hsp70基因CDS序列完全相同,全长1 923 bp,编码640个氨基酸,相对分子质量为70.29×103,理论等电点5.462,均具有Hsp70家族的3个签名序列:IDLGTTYS、IFDLGGGTFD、VVLVGGSTRIPKIQK;核定位信号标签KRKHKKDISQNKRALRR;Dank特征基序DLGTT-S-V;胞质Hsp70特征基序EEVD;靠近C端的GGMP4肽序列;2个糖基化位点NKSI和NVSA。对所得基因序列与已发表的青锵(Oryzias latipes)等物种Hsp70基因的氨基酸序列进行同源性比较,发现两个奥利亚罗非鱼群体与莫桑比克罗非鱼最高99.4%,与牙鲆最低83.9%;系统进化树分析表明奥利亚罗非鱼的Hsp70 cDNA序列与青鳉等物种的Hsp70基因聚在一支,而与牙鲆的Hsp70基因相分离。     

星洲银罗非鱼线粒体DNA的RFLP研究

用EcoRⅤ、MboⅡ、NaeⅠ、PvuⅡ、StyⅠ、KpnⅠ、SacⅠ、HindⅢ、DraⅠ、HpaⅡ等10种限制性核酸内切酶对星洲银罗非鱼线粒体DNA(mtDNA)进行酶切分析,其中StyⅠ、SacⅠ和DraⅠ表现出多态性,HpaⅡ酶切后产生零碎片段,EcoRⅤ、NaeⅠ、PvuⅡ、KpnⅠ只有一个切点,HindⅢ有两个切点,MboⅡ有5个切点但有小片段丢失。在星洲银罗非鱼中共发现4种单倍型,单倍型间平均遗传距离为0.008 0,其mtDNA多态度为0.002 4,遗传多样性较丰富。     

盐度对尼罗罗非鱼血清甲状腺素浓度和成活率的影响

在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)由淡水逐渐向不同盐度海水(5,10,15,20,25)适应过程中,运用放射免疫测定法研究血清中三碘甲腺原氨酸(T3)浓度的变化,并分析盐度变化对尼罗罗非鱼成活率的影响。结果表明,盐度对尼罗罗非鱼血清中T3水平和成活率有着显著的影响。在盐度5~20的范围内变化后,血清T3的浓度在6 d内随着盐度上升而增大,第7天达到高峰;随后,逐渐降低并趋于稳定,在第14天时,各盐度组尼罗罗非鱼血清中T3开始处于稳定状态;稳定后,各实验组血清中T3的浓度均比对照组升高,并表现出随盐度的升高而升高的趋势。在盐度20时,实验第17天,尼罗罗非鱼的成活率为80%。而在盐度为25时,实验第11天,尼罗罗非鱼的成活率仅为54%。对不同盐度下尼罗罗非鱼死亡原因及血清甲状腺激素在盐度变化下的生理意义和对死亡率的影响作了讨论。     

皱纹盘鲍和九孔鲍遗传差异nad2-cox1分析及鲍属系统发育

基于nad2-cox1核苷酸序列分析了皱纹盘鲍和九孔鲍3个养殖群体的遗传差异,基于cox1分析了鲍属19种鲍的系统发育关系。共获得625 bp的DNA片段,33个片段共检测到17种单倍型,其中皱纹盘鲍2个群体26个个体15种单倍型,九孔鲍7个个体2种单倍型。皱纹盘鲍大连群体与厦门群体有6种交叉共享单倍型,皱纹盘鲍与九孔鲍之间无共享单倍型。皱纹盘鲍群体内个体间的遗传距离(D)为0.002~0.015,九孔鲍个体间D值为0.003,两种鲍间的遗传距离为0.300~0.320。鲍属系统发育分析显示,皱纹盘鲍与日本鲍、盘鲍聚为一支(D值为0.000~0.004),而后与大鲍聚在一起(支持率为100﹪)(D值为0.018),九孔鲍、细纹九孔鲍、杂色鲍聚为一支(D值为0)。九孔鲍与马蹄螺科的Diloma bicanaliculata聚为一支,白鲍、黑鲍、红鲍、北国鲍、堪察加鲍聚为一支(支持率87﹪)。     

尼罗罗非鱼淋巴毒素α基因克隆与表达分析

【目的】克隆尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)淋巴毒素α基因(lymphotoxin alpha, LTα),分析该基因的组织分布,探讨该基因在抗菌抗病毒免疫过程中的重要作用。【方法】通过RACE技术获得尼罗罗非鱼淋巴毒素α基因(On-LTα)的cDNA全长,通过生物信息学分析其序列结构特征;利用实时荧光定量PCR检测基因的组织分布特征,以及健康尼罗罗非鱼感染无乳链球菌后该基因的表达变化,并进一步分离出尼罗罗非鱼非特异性毒性细胞(NCC),检测脂多糖(LPS)和聚肌胞苷酸(Poly I:C)刺激后,On-LTα在NCC中的表达变化。【结果】On-LTα基因序列全长为2699 bp,包含705 bp开放阅读框(ORF),编码234个氨基酸(GenBank登录号:MK770358)。该蛋白属于跨膜蛋白,具有肿瘤坏死因子(TNF)家族保守结构域。实时荧光定量结果表明,On-LTα在健康尼罗罗非鱼11种组织中均有表达,在脾脏中的表达量最高;无乳链球菌刺激后,该基因在脾脏中的表达量显著升高;LPS与PolyI:C刺激后,On-LTα在NCC中表达量也显著上调。【结论】On-LTα参与了尼罗罗非鱼抗菌抗病毒的免疫应答过程。     

星洲银罗非鱼线粒体细胞色素b基因的序列分析

克隆并测定了星洲银罗非鱼(Oreochromis sp.)细胞色素b基因(cyt b)的全序列,得到全长1 141bp的序列用于分析,用MEGA4.0分析软件与GenBank中的线粒体DNA序列进行序列比较,显示星洲银罗非鱼与其他鱼类的cyt b基因的同源性较高,同源度介于83%~93%间;根据星洲银罗非鱼与莫桑比克罗非鱼、尼罗罗非鱼等12种鱼类的cyt b基因序列构建的系统进化树,初步确定尼罗罗非鱼、莫桑比克罗非鱼为星洲银罗非鱼的父母本。     

硝化细菌对罗非鱼苗培育环境及抗病力的影响

于罗非鱼鱼苗培育水体中引入不同浓度的硝化细菌,检测主要水质因子,测定罗非鱼与抗病力有关的酶的活力,研究微生态调控对水质和对罗非鱼抗病力的影响。结果显示,硝化细菌浓度为100/L时,氨氮含量相对于对照组降低25.05%,亚硝酸氮含量降低45.16%,COD值降低12.33%,差异显著(P<0.05);鱼苗培育成活率相对于对照组高7.58%,体长增加22.18%,体重增加46.15%;幼鱼的抗菌酶、碱性磷酸酶(AKP)和超氧化物歧化酶(SOD)活力相对于对照组分别提高18.60%、59.19%和49.89%,差异显著(P<0.05),组织过氧化物酶(POD)活力差异不显著。表明不同浓度的硝化细菌可显著改善罗非鱼苗培育环境的水质,增强罗非鱼苗的抗病力。     

持续高温对吉富罗非鱼幼鱼消化酶和溶菌酶活力的影响

通过人工控温,对吉富罗非鱼（GIFT Oreorhromis niloticus）幼鱼实施34℃持续高温处理,研究持续高温对吉富罗非鱼幼鱼消化酶和溶菌酶活力的影响。结果表明：持续高温对吉富罗非鱼幼鱼消化酶活力的影响有统计学意义（P〈0．05）,对溶菌酶活力影响不具统计学意义（P〉0.05）;随着时间的推进,脂肪酶、淀粉酶活力增加,差异有统计学意义（P〈0．05）,溶菌酶活力增加,但差异无统计学意义（P〉0.05）。表明持续高温能一定程度地提高罗非鱼的消化能力和免疫功能。     

尼罗罗非鱼pik3r1基因的克隆和mRNA表达分析

【目的】哺乳动物pik3r1基因参与多种免疫途径,探索pik3r1基因在罗非鱼(Oreochromis)中的作用。【方法】克隆尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)pik3r1(命名为On-pik3r1)cDNA全长,对该基因进行生物信息学分析,并运用荧光定量PCR方法分析无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)刺激后On-pik3r1 mRNA在各组织种的表达模式。【结果与结论】On-pik3r1基因编码区2190 bp,编码729个氨基酸,5′端非编码区(UTR)为542 bp,3′UTR为2248 bp,理论分子质量为83.99 ku,等电点为5.73。On-pik3r1与斑马拟丽鱼(Maylandia zebra)相似性最高(98.53%),与其他物种的同源性在70%以上,表明pik3r1在物种进化过程中高度保守。On-pik3r1在健康尼罗罗非鱼各组织中均有表达,在肌肉中表达量最高,其次是鳃、皮肤,在胸腺中表达量最低。经灭活无乳链球菌刺激后,On-pik3r1表达量在肠道、鳃、脾脏、头肾、脑部等5个组织中均极显著下调(P<0.01),在胸腺中表现为4 h时极显著下调(P<0.01),24、48、72 h时为显著下调(P<0.05)。On-pik3r1参与了罗非鱼的对无乳链球菌的免疫应答过程。     

短期饥饿对奥尼罗非鱼幼鱼生长和几种消化酶的影响

研究在(27.0±1)℃条件下,奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus×O.aureus)幼鱼[初始体重为(2.49±0.31)g]短暂饥饿处理后再投喂的补偿生长。结果显示:在恢复生长时期,饥饿3、6、9和12d处理组的特定增长率和摄食率显著高于对照组(P<0.05);各处理组的饲料转化率与对照组差异不显著(P>0.05);胃蛋白酶、胰蛋白酶和脂肪酶的活力变化趋势相同,均随先饥饿再饱食的顺序先下降后上升,而淀粉酶活力变化趋势不明显;恢复投喂后,各组奥尼罗非鱼幼鱼的消化酶活性均恢复到对照组水平。表明饥饿3d组的奥尼罗非鱼幼鱼在恢复生长中具有超补偿能力,饥饿6d组幼鱼具有完全补偿能力,饥饿9和12d组幼鱼具有部分补偿能力。奥尼罗非鱼幼鱼短暂饥饿后出现的补偿生长效应主要通过增加食欲、提高摄食率实现。     

Structure of mitochondrial DNA control region of Pholis fangi and its phylogenetic implication

In this study, the entire mitochondrial DNA （mtDNA） control region （CR） of Pholis fangi was amplified via polymerase chain reaction followed by direct sequencing. The length of the mtDNA CR consensus sequence of P. fangi was 853 bp in length. In accordance with the recognition sites as were previously reported in fish species, the mtDNA CR sequence of P. fangi can be divided into 3 domains, i.e., the extended terminal associated sequence （ETAS）, the central conserved sequence block （CSB）, and the CSB domain. In addition, the following structures were identified in the mtDNA CR sequence of P. fangi：2 ETASs in the ETAS domain （TAS and cTAS）, 6 CSBs in the central CSB domain （CSB-F to CSB-A）, and 3 CSBs in the CSB domain （CSB-1 to CSB-3）. These demonstrated that the structure of the mtDNA CR of P. fangi was substantially different from those of most other fish species. The mtDNA CR sequence of P. fangi contained one conserved region from 656 bp to 815 bp. Similar to most other fish species, P. fangi has no tandem repeat sequences in its mtDNA CR sequence. Phylogenetic analysis based on the complete mtDNA CR sequences showed that there were no genetic differences within P. fangi populations of the same geographical origin and between P. fangi populations of different geographical origins.