几种海洋弧菌的密度感应系统及其信号干扰

密度感应(quorun sensing，QS)是细菌通过感受种群密度的变化而控制特定基因表达的一种机制(Miller et al.,2001)。密度感应细菌可以产生和释放特定的化学信号分子,称为自诱导分子(autoinducer，AI)，其浓度随着细菌密度的增加而增加。当少量细菌分泌的自诱导分子进入环境后,由于其浓度太低而无法被细菌中的受体蛋白检测到；但是,当细菌达到一定密度后,自诱导分子的浓度超过一定的阈值.受体蛋白与自诱导分子结合,并将此信号传导到细胞内,特异性地调控特定基因的表达。迄今为止的研究表明,许多细菌都可分泌化学信号分子来协调种群的活动，这些化学信号的种类是多种多样的,而且同一种细菌可以利用多种化学信号和复杂的调节环路来进行通讯。细菌种内和种间的通讯对细菌的存活及与自然生境之间的相互作用至关重要(Miller et al.,2001) 迄今为止研究的密度感应系统主要可分为3类:一类以酰基高丝氨酸内脂(acylated homoserine lactoes，AHL)为自诱导分子,如:费氏弧菌(Vibrio fischeri);一类以多肽为自诱导分子,如:革兰氏阳性细菌;一类是以哈维氏弧菌(V. harveyi)为代表的密度感应系统。在系统中有3种类型的信号分子( Miller et al.2001; Defoirdt et al.2004,Henke et al,2004)作者将着重介绍与海洋弧菌的密度感应系统、信号干扰及其应用相关的研究成果,为今后进一步的研究提供依据。     

比较基因组学分析弧菌属群体感应通路的分布与进化

群体感应是一种细菌细胞间的通讯过程, 细菌通过测量细胞外自诱导剂浓度从而感知群体细胞密度变化。群体感应使细菌能够在两种基因表达模式下转换: 在低细胞密度时有利于个体发展, 而在高细胞密度时则有利于群体发展。目前主要有7种群体感应通路, 分别以oligopeptides、AHL(Acylated Homoserine Lactones)、AI-2(Autoinducer-2)、CAI-1(Cholera Autoinducer-1)、PQS(Pseudomonas Quinolone Signal)、AI-3(Autoinducer-3)以及DSF(Diffusible Signal Factor)作为各群体感应通路的信号分子; 其中oligopeptides存在于革兰氏阳性细菌中, 其余6种信号分子存在于革兰氏阴性细菌中。弧菌是导致人类感染和水产品污染的主要病原菌, 传统的抗生素治疗弧菌感染具有很强的选择压力, 导致越来越多耐药弧菌出现。面对愈发严峻的弧菌耐药性问题, 目前群体感应淬灭被认为是治疗弧菌感染的重要替代手段之一, 因而有必要调查弧菌属细菌不同群体感应通路的分布情况, 为针对弧菌的群体感应淬灭剂研发提供重要参考信息。通过比较基因组学分析, 发现全基因组测序的46株弧菌存在AHL、AI-2以及CAI-1这3种信号分子通路, 其中5株弧菌均含有上述3种信号分子通路, 共有30株弧菌只含有AI-2和CAI-1两种信号分子通路; 而46株弧菌都不存在PQS、AI-3以及DSF群体感应通路。此外, 弧菌群体感应通路的分布与物种进化有关, 含有同种群体感应信号分子通路的弧菌, 其亲缘关系较近, 说明该通路的基因进化自它们的共同祖先。本研究表明开发针对弧菌的群体感应淬灭剂应以AI-2和CAI-1两种信号分子介导的通路作为靶点。     

哈维氏弧菌密度感应系统对几种胞外酶的活性影响

密度感应系统是细菌通过感受群体密度变化而控制基因特定表达的1种机制。对病原菌密度感应系统的研究有助于找到新的抗感染策略。目前哈维氏弧菌分泌的蛋白酶、脂酶、磷脂酶和溶血素等致病相关因子是否受密度感应系统的控制尚不清楚。哈维氏弧菌有3个平行的密度感应系统。本研究通过检测3个密度感应系统基因突变株的胞外酶(如蛋白酶、脂酶、磷脂酶和溶血素等)活性,发现明胶酶的活性受密度感应系统的信号分子HAI-1和AI-2的正控制,且受AI-2的控制程度更大;脂酶也在一定程度上受HAI-1和AI-2的正控制;卵磷脂酶受HAI-1的负控制;溶血素受HAI-1和AI-2共同的负控制。结果表明,哈维氏弧菌胞外分泌的几种毒力相关因子都受密度感应系统的调控,但控制方式各不相同。     

具有群体感应系统微藻共栖细菌的筛选及抑藻活性的研究

以从海洋微藻中分离到的206株共栖细菌为材料,采用生物传感器法筛选具有群体感应系统的细菌,根据16SrRNA基因对它们进行了分子生物学鉴定和系统发育学分析。利用气相质谱联用法(GC-MS)检测群体感应信号分子酰基高丝氨酸内酯类化合物(AHLs)的种类;采用细胞活体荧光测定方法,研究了这类共栖细菌对微藻生长的抑制作用。结果表明,在分离到的206株微藻共栖细菌中有11株具有群体感应系统,它们分属于3类海洋细菌的系统分支:α-Proteobacteria、γ-Proteobacteria和Gram+细菌,通过GC-MS检测确定11株共栖细菌都含有信号分子C8-HSL,部分含有C6-HSL和C14-HSL,其中9株细菌具有抑藻活性,其代谢产物分别对东海原甲藻、棕囊藻、海链藻和赤潮异湾藻的生长具有不同程度的抑制作用。     

海洋细菌密度感应淬灭酶及在水产养殖中的应用

许多病原菌通过密度感应现象(Quorum sensing,QS)调控毒力因子的产生,因此淬灭密度感应(Quorum quenching,QQ)在不影响病原菌生存条件下能够有效控制病原菌毒力因子的表达,是一种治疗水产养殖业细菌性病害的新策略。QQ是海洋细菌的一个普遍特征,主要通过QS小分子阻抑物(Quorum sensing inhibitors,QSIs)和QQ酶干扰QS过程,QQ酶降解信号分子是最常见的QQ方式。目前在海洋细菌中广泛存在N-酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactones,AHLs)内酯酶和AHL酰基转移酶两种QQ酶,在放线菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、浮霉菌门和疣微菌门的海洋细菌中均发现有AHL内酯酶,在α-变形菌纲、γ-变形菌纲、蓝细菌门、拟杆菌门的海洋细菌具有AHL酰基转移酶。目前已发现多种AHL降解酶可以降低病原菌毒力因子的产生,在水产养殖细菌病害防治方面潜力巨大,并且作为一种新型治疗手段受到广泛关注。     

海绵共栖细菌抗菌活性及其群体感应信号的研究

利用平板涂布法从南海海绵生物样品中分离海绵共栖细菌,以枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及酿酒酵母作为实验用指示菌对海绵共栖细菌进行了抗菌活性筛选。利用气相质谱联用仪(GC-MS)建立了群体感应信号分子酰基高丝氨酸内酯类化合物(AHLs)的检测方法,分析了活性菌株粗提液中信号分子的产生及种类。同时采用16S rDNA同源性和系统发育分析对活性菌株进行种属鉴定和系统发生学研究。结果表明,在分离到的94株海绵共栖细菌中18株(占19.1%)细菌具有抗菌活性。通过GC-MS检测确定大多数活性菌株都含有AHLs,因此提出了海绵共栖细菌抗菌活性与群体感应之间可能存在必然联系的推测。通过细菌分类鉴定,结果显示具有抗菌活性的细菌大部分属于芽孢杆菌属(Bacillus)。     

海绵共栖细菌抗菌活性及其群体感应信号的研究

利用平板涂布法从南海海绵生物样品中分离海绵共栖细菌,以枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及酿酒酵母作为实验用指示菌对海绵共栖细菌进行了抗菌活性筛选。利用气相质谱联用仪(GC-MS)建立了群体感应信号分子酰基高丝氨酸内酯类化合物(AHLs)的检测方法,分析了活性菌株粗提液中信号分子的产生及种类。同时采用16S rDNA同源性和系统发育分析对活性菌株进行种属鉴定和系统发生学研究。结果表明,在分离到的94株海绵共栖细菌中18株(占19.1%)细菌具有抗菌活性。通过GC-MS检测确定大多数活性菌株都含有AHLs,因此提出了海绵共栖细菌抗菌活性与群体感应之间可能存在必然联系的推测。通过细菌分类鉴定,结果显示具有抗菌活性的细菌大部分属于芽孢杆菌属(Bacillus)。     

厚壳贻贝肠道细菌的生物被膜对其幼虫和稚贝附着的影响

为研究肠道细菌在厚壳贻贝(Mytilus coruscus)幼虫和稚贝生长发育过程中的作用,本研究从成体厚壳贻贝肠道中分离出了10株细菌,通过分别形成单一细菌生物被膜,检验其对厚壳贻贝幼虫和稚贝附着的影响和生物被膜特性。实验结果发现,10株肠道细菌所形成的生物被膜均能诱导厚壳贻贝幼虫和稚贝的附着,但不同种类肠道细菌的诱导能力不同,其中Bacillus sp.4对厚壳贻贝幼虫具有高诱导活性,Phaeobacter sp.1具有低诱导活性;Phaeobacter sp.1对厚壳贻贝稚贝具有高诱导活性,Bacillus sp.4具有低诱导活性。通过比较分析 Bacillus sp.4和Phaeobacter sp.1生物被膜的生物量及胞外产物发现,肠道细菌被膜细菌密度、膜厚和胞外脂类对厚壳贻贝幼虫的附着变态无影响,而胞外蛋白和胞外多糖可以影响幼虫的附着变态;对于厚壳贻贝稚贝的附着,肠道细菌被膜细菌密度、膜厚和胞外α-多糖均能影响其诱导活性,而胞外脂类和胞外蛋白无影响。本研究成果可为提高厚壳贻贝的健康生态养殖相关技术提供相关的指导,为解析生物被膜调控厚壳贻贝附着机制和该物种生态健康养殖提供理论依据。     

低盐度形成的微生物膜对厚壳贻贝稚贝附着的影响

为研究环境因子在厚壳贻贝(Mytilus coruscus)稚贝附着过程中的调控作用, 作者探讨了低盐度对微生物膜生物构成、群落结构的影响及所形成微生物膜对厚壳贻贝稚贝附着的影响。在实验室条件下, 研究微生物膜的日龄与干质量、细菌密度和硅藻密度、叶绿素a含量的关系及其对厚壳贻贝稚贝附着的影响。通过DGGE指纹图谱技术对微生物膜中的细菌群落结构多样性进行了分析。研究发现,盐度13和23时形成的微生物膜能有效促进厚壳贻贝稚贝的附着, 且盐度23、28d时稚贝附着率最高, 达到72%。相关性分析表明, 微生物膜的诱导活性与盐度、干质量、细菌密度、硅藻密度、日龄呈显著正相关性, 与叶绿素a无相关性。微生物膜的干质量、附着细菌密度及底栖硅藻密度明显随着日龄的增加而增加, 叶绿素a含量与微生物膜日龄无显著相关性。细菌群落在厚壳贻贝稚贝附着过程中发挥重要调控作用。     

一种AHL降解菌株的高效筛选方法

酰化高丝氨酸内酯化合物(acyl-homoserine lactone,AHL)是革兰氏阴性细菌(G-)群体感应的信号分子。本文建立1种从环境微生物中高效地筛选AHL降解菌株的方法。首先利用AHL作为唯一能源对环境微生物进行初筛,再利用顶层琼脂法和报告菌株Chromobacterium violaceumATCC 12472、Agrobacterium tumefaciensA136等进行复筛,共筛选得到21株具有AHL降解活性的菌株。对其中活性最高的菌株A11进行初步的菌种鉴定,通过形态观察、16S ribosomal RNA(16S rDNA)基因分析最终确定为假单胞菌属细菌Pseudomonassp.A11。     

用于海洋沉积物中厌氧氨氧化细菌分子生态学研究的引物比较

为比较厌氧氨氧化细菌16SrRNA基因的2对特异性引物(Amx368F/Amx820R、Brod541F/Amx820R)在其分子生态学研究方面的优点与不足,本研究采用高通量测序和qPCR技术对长江口及其邻近海域沉积物中厌氧氨氧化细菌细菌的群落组成、多样性和丰度进行比较分析,结果表明,引物Amx368F/Amx820R特异性较高,能够较为完整地反映沉积物中厌氧氨氧化细菌的多样性信息,且其覆盖的厌氧氨氧化细菌丰度与功能基因hzo丰度正相关(P<0.01);而引物Brod541F/Amx820R特异性较低,覆盖部分厌氧氨氧化细菌及其他多个门的细菌,其量化的厌氧氨氧化细菌与功能基因hzo丰度无明显相关关系(P>0.05)。因此,引物Amx368F/Amx820R能够更加真实地反映厌氧氨氧化细菌在海洋沉积物中的群落特征,在其分子生态学研究中更具优势。     

海水养殖碳循环的实验研究

以浮游生物为主体的受控生态实验表明,溶解无机碳和DOC分别占海水碳贮库的89.75％和10.25％;在有机碳贮库中,浮游生物碳占5.43％,细菌碳占7.39％,表明细菌在海水碳循环中起重要作用,这种作用可从虾池样品分析获进一步证实。在食物链(14)C标记实验中,生物对碳吸收率随饵料密度增加而增加,由于饵料利用率的变化,应注意选择最适的饵料密度。鱼虾混养的~(14)C示踪实验表明:营养元素不断从低营养级向高营养级转移,各种生物样品~(14)C放射性活度平均百分比分别是,扁藻84.63％,卤虫8.99％,长毛对虾0.97％,棱鮻5.42％。     

九孔鲍鲍苗脱板期养殖环境细菌分离及分子鉴定

为了解九孔鲍鲍鱼脱板期养殖环境中细菌的多样性,分离培养了脱板病发生期养殖环境(包括附着基上和养殖池水中)细菌32株,并用限制性片段长度多态性分析和16S rDNA序列分析法对其进行了分子鉴定,构建了系统进化树.结果表明,所分离的细菌分为3大类群9个属,分别是:γ-变形菌纲(γ-Proterbacteria)的交替假单胞菌属(Pseudoalteromonas)、Cobetia属、盐单胞菌属(Hlomonas)、弧菌属(Vibrio)和海单胞菌属(Marinomonas);厚壁菌门(Firmicutes)的盐水球菌属(Salinicoccus)、动球菌属(Planococcus)和芽孢杆菌属(Bacillus);还有拟杆菌门(Bacteroidetes)的Tenacibaculum属.这些细菌大多与GenBank库中分离自发病的水产养殖生物的细菌最相似.这说明从该养殖环境中分离培养出的细菌和水产养殖病害间存在着一定的关系.     

自切附肢对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)幼蟹存活、生长和能量收支的影响

三疣梭子蟹池塘高密度养殖过程中,种内相残所致的自切附肢现象极其严重,但迄今为止,有关自切附肢对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)生理生态的影响仍处于空白阶段。本文重点研究了自切附肢对三疣梭子蟹幼蟹存活、蜕壳生长及能量收支的影响,结果显示:(1)自切附肢显著影响了幼蟹的成活率,整体上自切附肢数越多,成活率越低,其中自切4条(A4)和5条(A5)附肢组幼蟹的成活率仅为60%左右,显著低于对照组(93.3%)(P0.05);(2)自切附肢缩短了幼蟹的蜕壳周期,并且自切附肢数越多,蜕壳周期越短;(3)蜕壳后幼蟹的增重率随自切附肢数增加而降低,但特定生长率随自切附肢数增加而提高;(4)自切附肢后幼蟹的摄食率略有降低,整体上与对照组的差异不显著(P0.05),而饲料转化率有所提高,尤以A4和A5组幼蟹最为明显,其饲料转化率显著高于对照组(P0.05);(5)自切附肢改变了幼蟹的能量分配比例,随着附肢自切数量的增加,用于呼吸的能量比例(R/C)逐渐降低,而用于生长的能量比例(G/C)逐渐升高。     

肠道细菌对厚壳贻贝稚贝附着的作用研究

为探讨肠道细菌形成的微生物被膜对贝类附着的作用,从厚壳贻贝(Mytilus coruscus)成体肠道中分离10株肠道细菌,调查厚壳贻贝肠道细菌形成微生物被膜特性,分析微生物被膜密度、细菌种属与厚壳贻贝稚贝附着之间的相互关系。所有肠道细菌均可有效促进稚贝附着。其中,Paracoccus sp.1微生物被膜诱导的稚贝附着率最高(61%),且微生物被膜膜厚较厚,细菌分布较密集;仅5株肠道细菌Roseovarius sp.1、Winogradskyella sp.1、Tenacibaculum sp.4、Bacillus sp.5和Nonlabens sp.1的被膜密度与附着显著相关(P0.05)。系统发育分析发现肠道细菌诱导附着率与其种属无关。本研究表明源于厚壳贻贝成贝肠道细菌可以促进其稚贝的附着,说明肠道细菌对厚壳贻贝的生长发育具有一定的作用。本研究结果为深入探讨肠道细菌与厚壳贻贝相互作用和推动该种规模化养殖提供理论依据。     

微生物粘膜对杂色鲍幼虫附着和变态的影响

为了探讨广泛存在于海中基质表面的微生物粘膜对鲍幼虫附着和变态的诱导作用,研究了不同年龄微生物粘膜 ( 1 ～ 6 d ) 对杂色鲍幼虫附着和变态的影响.结果表明:1 ～ 6 d微生物粘膜均显著地诱导幼虫附着,其中 3, 5 和 6 d 微生物粘膜还显著地诱导幼虫变态;幼虫的附着率和变态率分别与微生物粘膜中的藻类密度和细菌密度呈显著的正相关性,推测藻类和细菌可能在幼虫的附着和变态中起着重要作用.垂直基质选择性试验结果表明,90 % 以上的幼虫附着在具 23 d 微生物粘膜的载玻片表面且变态率达 70 % 以上,进一步证实了微生物粘膜可以诱导杂色鲍幼虫的附着和变态,同时也证实了幼虫具备选择附着基质的能力.     

酰胺醚类化合物缓蚀行为的理论研究

应用密度泛函(DFT)理论,在M062X/6-311+G(d,p)水平下对丙烯酰胺基甲基醚(AAME)和N-羟甲基丙烯酰胺(N-MAM)在真空和溶剂条件下模拟其缓蚀行为。结果表明,N-MAM与AAME分子的活性位点主要分布在N、O杂原子上,同等条件下AAME分子的缓蚀性能优于N-MAM,溶剂化效应使分子的缓蚀性能比在真空条件下得到了提高。通过分子动力学模拟,AAME在真空和溶剂条件中,在Fe(110)面的吸附能分别为486.39和789.44 kJ/mol,均大于相同条件下N-MAM的吸附能(228.85和449.84 kJ/mol),表现出更优的缓蚀效果。多个N-MAM或AAME分子可通过分子间氢键作用在Fe(110)面有序自组装铺展成膜。     

海假交替单胞菌（Pseudoalteromonas marina）鞭毛蛋白对生物被膜形成及厚壳贻贝附着的影响

大多数海洋无脊椎动物在发育过程中都经历浮游、底栖附着阶段,厚壳贻贝(Mytilus coruscus)作为海洋经济物种与大型污损生物,其附着机制受到广泛关注。为探究海洋细菌与厚壳贻贝附着的互作关系,选取了对厚壳贻贝稚贝附着具有较高诱导活性的海洋细菌—海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas marina),采用酸解超速离心法提取P. marina的鞭毛蛋白。将提取的鞭毛蛋白与琼脂糖溶液混合,形成凝胶直接刺激稚贝;再用提取的鞭毛蛋白处理P. marina生物被膜进行稚贝附着实验。通过共聚焦激光扫描分析形成的生物被膜上生物量、细菌密度和胞外产物含量的变化。结果表明:P.marina鞭毛蛋白与琼脂糖形成的混合凝胶可显著促进厚壳贻贝稚贝的附着;鞭毛蛋白处理的生物被膜对厚壳贻贝稚贝附着的诱导活性显著提高;生物被膜上的生物量、细菌密度、膜厚、胞外β-多糖、脂质和蛋白浓度都有所增加。研究表明,鞭毛蛋白可以直接调控厚壳贻贝稚贝的附着,也可通过改变P.marina生物被膜的生物学特性,间接影响厚壳贻贝稚贝的附着,为探究细菌鞭毛蛋白与厚壳贻贝附着互作机制提供理论依据。     

哈维氏弧菌的生物学特性、流行病学及检测技术

哈维氏弧菌是1种革兰氏阴性、发光的海洋细菌,广泛分布于海洋环境中。它是最近10多年才被认识到的水产养殖动物的重要致病菌。文中综述哈维氏弧菌的生物学特性、流行病学、致病机制、密度感应系统、检测技术、疾病的防治及其应用。     

分子印迹聚合物的合成及其在海水分析中的应用

分子印迹聚合物是1种对某一特定的分子(印迹分子或模板分子)具有特异性识别和选择性的化合物,由于其高效性、稳定性和制备简单等特点,在分离、仿生传感器和模拟酶催化等方面具有重要的应用前景。本文综述了分子印迹聚合物的设计方式、制备方法和在海水研究中的应用。