人工诱导雌核发育牙Ping的染色体及核型证明

于１９９４￣１９９６年,分别在威海海洋渔业捕捞公司（石岛）和鸿洋实业总公司龙须岛育苗场采集人工培育的３－５龄牙Ｐｉｎｇ亲鱼,采用紫外线照射法使牙Ｐｉｎｇ精子遗传物质失活,并用冷休克法抑制受精卵第二极体释放,从而获得雌核发育二倍体牙Ｐｉｎｇ。原肠期采用空气干燥法、Ｇｉｅｍｓａ染色,得到雌核发育二倍体,正常二倍体及单倍体的染色体制片,进行染色体和核型的分析。结果表明,牙Ｐｉｎｇ的雌核发育二倍体和正常二     

不同发育阶段文蛤同工酶基因的表达研究

文蛤(Meretrix meretrix),隶属于瓣鳃纲(Lamellibranchia)、帘蛤目(Veneroida)、帘蛤科(Veberidae).在我国是一种重要的养殖种类.目前有关文蛤的研究主要集中在生态学方面,而有关文蛤个体发育的研究还未见报道.已经证明在动物发育过程中同工酶谱的变化与形态分化和器官形成具有相关性,同工酶电泳技术解释为“基因如何控制个体发育”以及确定个体发育的基因调控表达的重要阶段等问题提供一种有效的实验方法.     

人工诱导雌核发育牙鲆的染色体及核型证明

于1994-1996年,分别在威海海洋渔业捕捞公司（石岛）和鸿洋实业总公司龙须岛育苗场采集人工培育的3－5龄牙鲆亲鱼,采用紫外线照射法使牙鲆精子遗传物质失活,并用冷休克法抑制受精卵第二极体释放,从而获得雌核发育二倍体牙好。原肠期采用空气干燥法、Giemsa染色,得到雌核发育二倍体、正常二倍体及单倍体的染色体制片,进行染色体和核型的分析。结果表明,牙鲆的雌核发育二倍体和正常二倍体的染色体数均为2n=48,核型为48t,即48条端部着色点染色体,臂数NF=48,两者的核型设有明显差异;单倍体为24条端部着丝点染色体;在3个组别中,第一号染色体上都有一明显的次缢痕。雌核发育二倍体牙鲆的诱导率为98％。     

山东近海褐牙鲆自然与养殖群体生化遗传结构及其遗传变异的比较分析

山东近海褐牙鲆自然群体活样本共 79尾 ,分别于 1 996年 5月、1 997年 1月和 1 998年 4月采自青岛近海 ;养殖群体活样本 5 2尾于 1 997年 1 2月采自山东荣成寻山养鱼场。采用水平淀粉胶和垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳方法及 3种缓冲系统 (TC、EBT和TG)分别对自然和养殖群体的 1 5种同工酶进行生化遗传分析。结果表明 ,山东近海牙鲆自然群体的多态基因座位比例 ( 31 .0 % )和群体平均杂合度 ( 0 .0 80 2 )都明显高于养殖群体 ( 2 4 .1 % ,0 .0 788) ;在自然群体的 9个多态基因座位、养殖群体的 7个多态基因座位中 ,除了Cat(P <0 .0 5 )和Idhp - 1(P <0 .0 5 ,养殖群体中 )有显著差异、Ldh -C(P <0 .0 1 )完全偏离Hardy -Weinberg定律外 ,其余多态座位基因频率均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律     

牙鲆F1代近交系、雌核发育系的建立及遗传检测

在牙鲆育种中基于构建的大量家系,已经筛选出生长快成活率高的F₁代家系0719,0750和0751,为了使其优良性状进一步纯化,采集以上3个优良家系中成熟个体的精子和卵子,分别利用家系内兄妹近交和鲈鱼冷冻精子诱导雌核发育的方式,构建了近交系3个、雌核发育系7个,在其生长至127 d和190 d时,测定体长和体重两个性状,并利用方差分析、Student-Newman-Keuls多重比较及绝对增重比较等法对两个性状进行分析,发现0751的雌核发育系较其他近交系和雌核发育系生长更快(P＜0.05)。利用倍性分析仪对0751近交系和雌核发育系的染色体倍性进行分析。结果显示近交系和雌核发育系分别在G₀-G₁期和G₂-M期DNA 相对含量相近,G₀-G₁期DNA指数均为1.000,都具有二倍体的特点。利用筛选的14对具有多态性的微卫星引物分别对近交系和雌核发育系的遗传特征进行检测,发现近交系和雌核发育的等位基因数(N_a)分别为2.214 3和2.000 0,有效等位基因数(N_e)分别为2.082 9和1.936 9,观测杂合度(H_o)分别为0.564 2和0.413 8(P＜0.05),期望杂合度(H_e)分别为0.515 4和0.490 1,遗传杂合度(Ave_Het)分别为0.506 6和0.482 8,多态信息含量(PIC)分别为0.403和0.366,雌核发育系的遗传指数均低于近交系。除EKOP-E1-In,EKOP17-Li,EKOP-E1-Ey 3个位点仅在近交系中为高度多态,其他位点在两个系中均为中度多态。近交系和雌核发育系的遗传偏离指数(d)分别为0.091 5和-0.157 3,反映了近交系杂合子的比例远高于理论上的数值,纯合子缺失;雌核发育系杂合子缺失,纯合子比例高。利用雌核发育较近交方式更有利于基因的纯合,在牙鲆育种中具有较大的应用价值。     

牙鲆胃肠道及肝脏GnRH受体的免疫组织化学研究

利用免疫组织化学ABC法，对牙Ping胃肠道及肝脏促性腺激素释放激素（GnRH）受体的表达及分布特点进行了研究。结果显示：胃肠道粘膜上皮、腺上皮及肝细胞呈GnRH受体免疫反应阳性，阳性反应物分布在细胞膜和细胞质中，细胞核呈阴性反应。提示：牙Ping胃肠道上皮细胞及肝细胞能够表达GnRH受体，说明GnRH可能通过其受体影响牙Ping消化系统的功能。     

中国两性生殖卤虫各品系碱性磷酸酶、酸性磷酸酶同工酶基因的表达特征

采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳法 ,对中国两性生殖卤虫 Artemia sinica的 1 4个品系的碱性磷酸酶、酸性磷酸酶同工酶基因的表达特征进行了分析 ,并与 Artemia urmiana的碱性磷酸酶、酸性磷酸酶同工酶基因的表达特征进行了比较研究。结果表明 :中国两性生殖卤虫各品系的 ALP、 ACP同工酶的酶谱相同 ,均为单体酶。 ALP、 ACP同工酶分别由 ALP - 1、 ACP- 1 ,ALP- 2、ACP- 2 ,ALP- 3、ACP- 3三个基因座位编码 ,ALP- 1、ACP- 1座位存在a、 b两个共显性等位基因 ,ALP- 2、ACP- 2存在 a、b、c三个等位基因 ,ALP- 3、ACP- 3座位存在 a、b两个等位基因。共发现 7种基因型 :1 .0 / cc/ bb,2 .0 / bb/ bb,3.0 / aa/ aa,4.0 /ab/ aa,5.0 / ac/ ab,6.0 / ac/ aa,7.ab/ ab/ aa。仅在 A.urmiana中发现 0 / cc/ bb、 0 / bb/ bb基因型 ,而 A.sinica的主要基因型为 :0 / ac/ aa、 0 / ab/ aa、 0 / aa/ aa。仅 GN品系的 ALP - 1、 ACP- 1有基因座位表达。     

牙鲆PIK3R3-like基因的表达分析及重组表达

本文从牙鲆(Paralichthys olivaceus)中鉴定得到了PI3K家族的成员之一——PIK3R3-like,并分析其可能为PIK3R3的亚型。由于其部分外显子在转录或修饰时被删除,导致该基因会产生一种较短的mRNA(PoPIK3R3-like-Ⅱ),与完整的转录组相比缺失21 nt。对PoPIK3R3-like的可变剪接长链(PoPIK3R3-like-Ⅰ)进行序列分析发现该基因包含一个1 425 bp的开放性阅读框,共编码474个氨基酸,编码的蛋白共包含三个结构域,分别是一个nSH2结构域、一个iSH2结构域和一个cSH2结构域。同源性分析结果显示PoPIK3R3-like-Ⅰ、PoPIK3R3-like-Ⅱ均与其它硬骨鱼的PIK3R3-like相似度较高,系统进化分析显示PoPIK3R3-like与硬骨鱼聚为一支,与两栖类、鸟类和哺乳类相距较远。作者通过qRT-PCR检测了PoPIK3R3-like在各组织中的表达分布,发现其在牙鲆的各组织中均有表达,但在鳃和脑中表达量较高,使用迟缓爱德华氏菌侵染牙鲆鳃细胞及单核-巨噬细胞后,PoPIK3R3-like表达量分别呈现先上升再下降和显著上升的趋势,提示该基因在牙鲆抵抗迟缓爱德华氏菌感染相关的免疫应答中可能发挥作用。利用原核表达的方法在大肠杆菌中异源表达了PoPIK3R3-like-Ⅰ的重组蛋白,SDS-PAGE结果显示得到的重组蛋白与预测大小一致,蛋白纯化结果显示得到的蛋白纯度较高,可用于下一步PIK3R3-like基因功能的相关研究。     

牙鲆TAK1基因的表达分析及免疫功能探究

为探究转化生长因子β激活激酶1基因(TAK1)在硬骨鱼先天免疫中的重要作用,本研究基于实验室已建的牙鲆(Paralichthys olivaceus)转录组数据库,对牙鲆TAK1基因(PoTAK1)进行了克隆及验证。研究显示,其开放阅读框(ORF)长为1 728 bp,编码575个氨基酸,蛋白分子量(Mw)约为64.33 kDa,理论等电点(pI)为6.66,编码的蛋白在N端具有一个S＿TKc结构域,在C端具有一个卷曲螺旋区域(Coiled coil region)。氨基酸多序列比对和系统发育分析表明,TAK1基因在脊椎动物中高度保守。组织表达分析显示,PoTAK1在肝脏和鳃中的表达量较高;体内攻毒实验表明,被迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染后,PoTAK1在脾脏和头肾中的表达量均显著上调;体外免疫刺激实验表明,Poly I:C、TNF-α和迟缓爱德华氏菌刺激后,在各时间点牙鲆鳃细胞系中PoTAK1的表达量均显著上调。亚细胞定位显示,PoTAK1主要在细胞质中表达。双萤光素酶报告实验证明,PoTAK1能够激活MAPK通路下游AP-1转录因子的活性。体外免疫调节...     

牙鲆gnrh基因的表达分析

本文通过qPCR方法,研究了我国重要海水鱼类——牙鲆（Paralichthys olivaceus）雌、雄成体组织以及性腺分化期的脑、性腺中gnrh1、gnrh2和gnrh3的表达水平。结果显示,gnrh1分布于所有检测的组织：在脑、垂体、肾脏和肝脏中高表达,在性腺中表达相对较低;gnrh2则在雌、雄性的肝脏以及雄性的肠、肾脏、眼睛和头肾中;而gnrh3只在雄性的肾脏、眼睛和肌肉中检测到微弱表达。人工诱导的牙鲆雌核发育鱼苗分别用17β-雌二醇（E₂）和17α-甲基睾酮（MT）处理,使其分化为雌性或雄性个体表型。在性腺分化期的脑中,gnrh1的表达呈现上升趋势,在全长（total length,TL）4 cm鱼苗中,E₂组的表达显著高于MT组（P<0.05）;gnrh2在2 cm TL时E₂组显著高于MT组（P<0.05）,随后在E₂和对照组的表达水平均出现下降趋势;gnrh3在2 cm TL时E₂和对照组的表达均显著高于MT组（P<0.05）,自6 cm TL时MT和E₂组的表达开始下降。在性腺中,三种gnrh在性腺分化前2 cm TL表达量都相对较高,随后呈现下降趋势。综上,推测牙鲆gnrh1可能参与了性腺分化的启动、分化过程及性腺发育,gnrh2主要参与了性腺分化的启动,gnrh3主要参与了性腺分化的启动和分化过程。     

牙鲆多聚免疫球蛋白受体基因的克隆、表达及鉴定

采用PCR扩增、构建重组高效表达载体的方法,进行了牙鲆多聚免疫球蛋白受体(pIgR)基因的克隆、原核表达研究,并利用SDS-PAGE、western-blot及ELISA方法对纯化的重组蛋白特性进行了分析。结果表明,PCR扩增出pIgR开放阅读框(ORF)基因全长为1005 bp,所构建的pET-32(a)-pIgR重组质粒经PCR和双酶切鉴定含有ORF全长基因。SDS-PAGE结果表明,表达的目的蛋白相对分子质量为58 kDa,与理论预期值一致,IPTG诱导6h后表达量趋于稳定,经亲和层析纯化得到高纯度的重组蛋白。Western-blot结果表明,重组pIgR能够与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性反应;ELISA结果表明重组pIgR能够与牙鲆IgM发生特异性结合。本研究获得了纯化的重组pIgR,证明其具有IgM结合活性,为下一步研究牙鲆pIgR的转运机制及在黏膜免疫防御中的作用机理提供了分子基础。     

野生和养殖牙鲆(Paralichthys olivaceus)遗传差异的RAPD和ISSR研究

利用RAPD和ISSR两种分子标记技术,分析了山东威海近海野生和养殖牙鲆的遗传多样性差异。结果表明,用10个RAPD引物对两个样本各30个个体的基因组DNA进行扩增,共获得110个重复性好且带谱清晰的扩增位点,片段大小在200—2500bp之间,野生样本和养殖样本的多态位点比例分别为59.09%和60·91%,Shannon多样性值分别为16·563和16·917,野生样本内平均遗传距离为0·17427,养殖样本为0·17553,样本间遗传距离为0·17419。用6个ISSR引物共在两样本中检测到161个位点,野生样本有111个(68·94%)为多态位点,养殖样本有112个(69·57%)为多态位点,野生和养殖样本的样本内平均遗传距离分别为0·19996和0·20007,样本间遗传距离为0·20002,Shannon多样性值分别为29·254和29·688。平均位点多态率显著性检验标明,无论是利用RAPD还是ISSR技术,两群体间平均位点多态率皆差异不显著,说明第一代养殖群体的遗传结构尚未发生明显变化。     

山东近海牙鲆同工酶的生化遗传分析

１９９６年５月,１９９７年１月、１２月和１９９８年４月在山东青荣成近海采集了１３１尾活牙鲆共７１０个生化样品,采用水平淀粉胶和垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法,对牙鲆的２５种同工酶进行了分析。结果检测出ＬＤＨ、ＭＤＨ、ＭＥＰ、ＩＤＨＰ、Ｇ３ＰＤＨ、ＡＫ、ＣＫ、ＡＣＰ、ＰＧＭ、ＳＤＨ、ＡＤＨ、ＣＡＴ、ＳＯＤ、ＧＤＨ和ＧＰＩ等１５处同工酶在牙鲆眼睛、肌肉、心脏、肝脏、胸鳍和肾脏等６种组织或器官听表达情况,     

重组酵母菌对牙鲆生长及血清激素含量的影响

于１９９８年１０－１１月间在荣成市寻山养殖场实验了饲喂具有大麻哈鱼生长激素基因的酵母菌对牙鲆的生长及其血清激素的影响。实验分为对照组和三组实验组,其中对照组的铒料中不含重组酵菌,实验组的铒料中分别含有重组酵母菌０．２５‰、０．５０‰、０．７５‰（Ｗ／Ｗ）。实验表明,通过投喂重组酵母菌,可以增加牙 血清生长激素的含量,牙促进牙鲆的生长。重组酵母菌的含量不同,对牙鲆血清甲状腺素和三碘甲状腺原氨酸的影响     

山东近海牙鲆(Paralichthys olivaceus)自然和养殖群体10个微卫星基因座位的遗传多态性分析

采用微卫星遗传标记技术对山东近海牙鲆自然群体和养殖群体的遗传多样性进行了研究。实验所用牙鲆于2003年5月分别采自山东近海和青岛胶南养鱼场，各20尾，取全血或肌肉组织，以酚-仿抽提方法提取基因组DNA，利用筛选获得的10对微卫星引物进行PCR扩增，反应产物经8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、EB显色，用ImageMasterl D Elite(Version 3．01)软件分析电泳结果，并计算了相应的遗传学参数。结果表明，在自然和养殖群体中，10个基因座位的等位基因平均数(α)分别为6．7和6．1，每个基因座位有效等位基因数(αe)分别为1．8—6．8和2．5—6．7，群体平均杂合度(H)分别为0．8120和0．7310；两个群体间的遗传相似性系数、遗传距离和基因分化系数为0．8558、0．1557和0．0558；自然群体内每个座位上的多态信息含量(PIC)为0．59—0．84、个体识别率(DP)为0．54—0．86、非父排除率(PPE)为0．41—0．72，其累积个体识别率和非父排除率均达到0．9999，表明所选座位属中高识别力的遗传标记，可以将它们应用于今后牙鲆雌核发育群体的遗传变异分析以及进一步的遗传育种的研究中。     

实验微粒饲料中花生四烯酸含量对牙鲆(Paralichthys olivaceus)仔稚鱼生长、存活的影响

采用花生四烯酸即廿碳四烯酸（AA, 20∶4n-6）含量梯度法,制备了四种n-3HUFA含量相等、DHA/EPA比例相同、AA含量分别为0.06%、1.00%、1.5%、2.0%的实验微粒饲料,进行了AA的不同含量对牙鲆仔稚鱼生长、存活、体内相关成分以及对外部压力耐受性的影响研究.26天的养殖试验结果表明,当牙鲆仔稚鱼实验微粒饲料中AA的含量为1.5%时,牙鲆仔稚鱼的生长、存活以及对不同压力的耐受性都达到最佳.养殖试验结束后,对稚鱼体内相关成分的分析结果表明,稚鱼体内AA的含量随着实验微粒饲料中AA含量的增加而增加.     

海水工厂化养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus)和褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)腹水病病原菌的分离与鉴定

从患腹水病大菱鲆和褐牙鲆成鱼体内分离到两株致病作用强的病原菌FS1和FS2,经人工感染实验表明菌株FS1和菌株FS2为腹水症的致病菌。采用常规的生理生化鉴定方法及梅里埃全自动微生物分析系统(VITEK32),结合分子生物学方法进行病原菌的鉴定。结果表明,菌株FS1和菌株FS2分别为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)和溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)。菌株FS116SrRNA基因序列与迟缓爱德华氏菌的同源性达99%;菌株FS2的16SrRNA基因序列与溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌等的同源性均达99%。为最终确定菌株FS2的分类地位,测定了其HSP60基因序列,进行网上同源性比对。分析结果表明,菌株FS2与溶藻弧菌的同源性达99%,而与其他弧菌HSP60基因的同源性均低于91%。这两种致病菌混合感染或分别感染均可造成养殖鲆鱼腹水病。     

牙鲆体内消化酶活性的研究

采用生化方法对一年龄牙鲆胃、肠中不同消化酶的活性进行了研究。实验组I的牙鲆平均体重为 ( 35 0± 2 0 )g ,实验组II的牙鲆平均体重为 ( 4 60± 30 )g。结果表明 ,在牙鲆的胃、前肠、中肠、后肠中可以检测出蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性。胃中的蛋白酶主要为酸性蛋白酶 ,肠中的蛋白酶主要为碱性蛋白酶。肠中蛋白酶活性由前肠向后肠递减 ,前肠与中肠的酶活性没有显著差异 (P >0 .0 5 ) ;牙鲆肠中脂肪酶活性较胃中的高 ,在肠的不同部位脂肪酶的活性无显著差异 (P >0 .0 5 ) ;牙鲆前肠中的淀粉酶活性最高 ,胃次之 ,中肠、后肠中淀粉酶活性较低。随着牙鲆的生长 ,蛋白酶、脂肪酶活性增强 ,淀粉酶活性减弱。对产生上述实验结果的原因进行了初步分析。     

牙鲆(Paralichthys olivaceus)秦皇岛弧菌感染症及其病原细菌研究

采用病原分离与鉴定、人工感染试验等方法,在对养殖牙鲆病例进行发病情况、病理变化特征检验的基础上,进行病原学检验。结果表明,此病例属于由弧菌属(VibrioPacini1854)细菌引起的败血感染症。经对12株纯培养菌(HQ010712-1—HQ010712-12)进行形态特征、理化特性等表观分类学指征的检验,选择代表菌株(HQ010712-1株)进行16S rRNA基因的测定与系统发育学分析等,判定为弧菌属的一个新种。将HQ010712-1株送中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行了复核鉴定与分类定名,依据分离地定名为秦皇岛弧菌(Vibrioqinhuangdaorasp.nov.);参考菌株为HQ010712-1。