哈维氏弧菌VIB645毒性相关质粒的结构解析

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是水产养殖动物的常见致病菌。前期研究发现,哈维氏弧菌致病性最强的菌株VIB645含有2个核苷酸序列非常相似的溶血素基因—vhhA和vhhB,分别位于染色体DNA和1个大小约为65.6 kb的质粒上(命名为pVH1)。本研究用碱裂解法提取该菌株的毒性相关质粒pVH1,利用多种限制性内切酶进行酶切,构建随机DNA文库并测序。合计测序97.63 kb,覆盖度为148.3%,鉴定出125个ORF(开放阅读框,>150 bp)。这些预测的ORF,根据其功能主要分为以下几类:(1)毒力相关基因,包括RTX毒素钙离子结合蛋白、转铁蛋白结合蛋白A前体、外膜粘附蛋白;(2)结合转运相关基因,包括TraC、-D-、F-、G-、H-、I-、K-、N-、U-、W、TrbB-、C;(3)转座相关基因;(4)其他功能基因,如甲基转移酶,DNA结合蛋白,DNA复制蛋白DnaC等;(5)未知基因。本研究结果对揭示哈维氏弧菌的致病机理具有重要意义。     

哈维氏弧菌溶血素基因vhhA在大肠杆菌中的表达及活性研究

哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）是水产养殖动物（鱼、虾）的重要致病菌。已发现哈维氏弧菌对鱼类的致病性与其分泌的胞外产物中的溶血素相关，致病力最强的菌株VIB645有2个碱基序列非常相似的溶血素基因，vhhA和vhhB。本研究将vhhA克隆于pET-24d（＋）表达质粒，VHH溶血素蛋白作为1种带6组氨酸的融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中得到了过量表达。重组菌在鱼血平板上表现出很强的溶血活性，并且在卵磷脂平板上表现出磷脂酶活性。SDS-PAGE分析表明，表达蛋白的分子量约为43kDa。在17，25和37℃时重组的VHH溶血素蛋白都能得到很好的表达，达到最大表达量的时间分别为9,6和3h。在25℃进行诱导时，分泌到上清液中的表达蛋白的量最多。     

大菱鲆Hepcidin基因的克隆和真核表达载体的构建

Hepcidin是鱼类的一种重要的抗菌肽.通过比较GenBank中不同Hepcidin基因的同源相似性,设计出特异性的引物,以我国海水养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus L)肝脏为模板利用RT-PCR 技术克隆获得了一条基因.使用生物信息学手段对该基因序列进行了比对和分析,证实这条基因为Hepcidin1 precursor基因,属于Hepcidin基因家族.通过设计引物在Hepcidin基因的5′和3′端分别引入EcoR I和NotⅠ酶切位点.经过双酶切后获得具有EcoR I和Not I酶切位点的Hepcidin成熟肽片段,并与同样使用该酶线性化的表达载体pPIC3.5K连接.构建了表达载体pPIC3.5K/Hepc1,并将其导入到酵母基因组中,完成了真核表达载体的构建,为Hepcidin的真核表达作了基础性的准备工作.     

哈维氏弧菌的生物学特性、流行病学及检测技术

哈维氏弧菌是1种革兰氏阴性、发光的海洋细菌,广泛分布于海洋环境中。它是最近10多年才被认识到的水产养殖动物的重要致病菌。文中综述哈维氏弧菌的生物学特性、流行病学、致病机制、密度感应系统、检测技术、疾病的防治及其应用。     

中国对虾幼体致病菌哈维氏弧菌的分离及其生物学特性研究

于1996年4—5月,在青岛丰城地区一些对虾育苗场发生大规模爆发性传染病,主要感染中国对虾幼体,尤其是蚤状幼体。死亡率高达80％以上。从自然发病及人工感染患病濒死中国对虾幼体中分离出38株细菌,研究其形态特征,生理、生化特性及对中国对虾幼体的致病性。结果表明,38株分离物均为革兰氏阴性杆菌,菌体为杆状或短杆状,极生单鞭毛运动,不发光,氧化酶呈阳性,发酵葡萄糖产酸,TCBS平板上生长,菌落呈黄色或绿色,对弧菌抑制剂0／129（150g／ml）敏感,此均为弧菌属的典型特征,属于弧菌。其中26株细菌被归为同一类群,参照伯杰氏细菌学鉴定手册（1994年,第9版）鉴定表明,该菌同哈维氏弧菌（Vibrioharveyi）最为接近;另外,Biolog系统鉴定表明也为哈维氏弧菌,因此定名为哈维氏弧菌。利用浸泡感染法以2．5×103—2.5×107cfu／ml浓度的细菌感染不同发育时期（无节幼体期、蚤状期、糠虾期和仔虾期）的中国对虾幼体。结果表明,该病原菌主要感染中国对虾幼体的无节幼体晚期、蚤状期和糠虾早期并导致其大量死亡,而在仔虾期感染死亡率较低,并且2．5×104cfu／ml以上浓度的病原菌即可导致蚤状幼体严重感染死亡,由此可见,所分离的致病菌对中国对虾蚤状期幼体具有较强的致病力。人工感染试验结果     

哈维氏弧菌密度感应系统对几种胞外酶的活性影响

密度感应系统是细菌通过感受群体密度变化而控制基因特定表达的1种机制。对病原菌密度感应系统的研究有助于找到新的抗感染策略。目前哈维氏弧菌分泌的蛋白酶、脂酶、磷脂酶和溶血素等致病相关因子是否受密度感应系统的控制尚不清楚。哈维氏弧菌有3个平行的密度感应系统。本研究通过检测3个密度感应系统基因突变株的胞外酶(如蛋白酶、脂酶、磷脂酶和溶血素等)活性,发现明胶酶的活性受密度感应系统的信号分子HAI-1和AI-2的正控制,且受AI-2的控制程度更大;脂酶也在一定程度上受HAI-1和AI-2的正控制;卵磷脂酶受HAI-1的负控制;溶血素受HAI-1和AI-2共同的负控制。结果表明,哈维氏弧菌胞外分泌的几种毒力相关因子都受密度感应系统的调控,但控制方式各不相同。     

中国对虾育苗池水中哈维氏弧菌的检测

１９９６年４月～５月,在山东莱州市大华育苗池、山东即墨市丰城育苗场发病育苗池、环境水体及活体饵料中共采集８０份样品,用间接ＥＬＩＳＡ技术对其进行了苗期对虾病原菌－哈维氏弧菌的检测。结果表明,发病育苗池中哈维氏弧菌的检出率（５８．３％）明显高于正常育苗池（２０．４％）,证实丰城对虾育苗场暴发的流行病与育苗水体中的哈维氏弧菌有关;大华育苗场育苗水中也检测出哈维氏弧菌,但大华育苗场并未发病,说明哈维氏弧菌似乎是条件致病菌。在丰城育苗场及大华育苗场的蓄水池中均检测到哈维氏弧菌,而活性饵料中未检出,表明育苗水中的哈维氏弧菌来源于外海水。     

拟态弧菌全长toxR基因的克隆和序列分析

对克隆的拟态弧菌Vibrio mimicus的全长toxR基因及进行相关的序列分析.根据已发表的其他几种弧菌toxR基因两翼核苷酸序列,设计和合成上下游简并引物,以拟态弧菌1.1969标准株的基因组DNA为模板进行PCR扩增,将获得的1.3kb扩增片断进行克隆、鉴定和测序,并将该序列提交至GenBank (登录号为EF693743).首次获得拟态弧菌840bptoxR基因全长核苷酸序列.与其它弧菌的相应序列分析比对显示,该序列与霍乱弧菌Vibrio cholerae的toxR基因有87%-88%的相似性,与鳗弧菌Vibrio anguillarum的toxR基因有75%的相似性,与副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus的toxR基因有45%的相似性.该基因编码1个含有279个氨基酸残基的蛋白质,其分子量为31.13kDa,等电点为5.35,并含有一个典型的转录激活区和一个跨膜区.系统发育树分析表明,几种常见致病性弧菌的toxR基因序列存在较大分歧,拟态弧菌能较容易与进化相近的霍乱弧菌鉴别区分开来.toxR基因全长核苷酸序列的获得将为拟态弧菌的菌种鉴定增添新的分子靶标,有助于其结构和功能的研究及通过突变分析鉴定出新的受toxR基因调控的致病基因.     

致病性哈维氏弧菌:海洋寄生性纤毛虫的内共生细菌

哈维氏弧菌被观察到与海洋寄生性纤毛虫刺激隐核虫具有内共生现象,其作为一种致病性细菌,可导致感染刺激隐核虫的大黄鱼产生严重的继发性细菌感染。我们通过16s宏测序技术对刺激隐核虫的细菌群落进行鉴定,并通过标准的细菌培养方法分离鉴定出哈维氏弧菌。通过透射电镜和荧光原位杂交方法,在刺激隐核虫的细胞胞质中,均观察到内共生的哈维氏弧菌的存在;而在其细胞核中,则没有相关信号存在。哈维氏弧菌与刺激隐核虫的相关关系以及内共生的哈维氏弧菌对刺激隐核虫的影响作用,仍需要深入进行研究。     

哈维氏弧菌生物被膜体外模型的建立及成膜特性研究

采用改良微孔板法建立哈维氏弧菌Vibrio harveyi TS-628菌株生物被膜体外模型,并进一步研究环境因子对哈维氏弧菌体外形成生物被膜的影响。结果发现,哈维氏弧菌TS-628菌株可以在聚苯乙烯板中形成生物被膜,并且该菌生物被膜的形成受起始菌液浓度、温度、pH等理化因子的显著影响。温度为30℃、NaCl质量分数为3%—6%、pH为7、孵育时间为36h是哈维氏弧菌形成生物被膜的最佳条件。此外哈维氏弧菌在分别经表皮黏液、鳃黏液、肠道黏液、肝脏提取液、脾脏提取液、肌肉提取液包被的基质上成膜效果显著,其中在经肝脏提取液包被的基质上形成的生物被膜量显著高于在其他生物基质上形成的生物被膜量(p<0.01)。     

白色噬琼胶菌QM38β-琼胶酶基因agaD02 的克隆与表达

从白色噬琼胶菌(Agarivorans albus)QM38基因组中扩增到一段编码β-琼胶酶的DNA序列,命名为agaD02。序列相似性分析的结果表明,基因agaD02和弧菌Vibrio sp.JT0107及Vibrio sp.PO-303的琼胶酶基因具有同源性,其相似性程度分别为98.7%和97.4%,而同GenBank中的其他序列同源性很低。对此基因的序列进行了分析,结果表明,其开放阅读框长度为2 868 bp,编码的蛋白质包含955个氨基酸,在蛋白数据库中的编号为ABM90422,推测其分子质量为106 ku,等电点为4.87。利用网上数据库资源和生物学软件对预测的琼胶酶蛋白序列进行了同源性分析和结构分析。设计两端含酶切位点的特定引物,克隆agaD02基因,构建入表达载体pET24a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),转化后提取质粒进行酶切和电泳验证,转化后的大肠杆菌经诱导可产生胞外琼胶酶。     

最小弧菌热不稳定型溶血素表达载体的构建和高效表达

根据已发表的最小弧菌热不稳定型溶血素（Vibrio mimicusheat-labile hemolysinVmhA）核苷酸序列,设计和合成一对特异性引物,以最小弧菌96-6-3的基因组DNA为模板,PCR扩增得到热不稳定型溶血素基因片段,克隆于表达载体PQE-2/VmhA中,转化大肠杆菌M15,经IPTG诱导,表达出预期大小50.2KD的融合蛋白.Westernblot检测显示,该蛋白与抗最小弧菌热不稳定型溶血素兔血清呈阳性反应,表明该蛋白具有溶血素的免疫原性,可作为基因工程疫苗的候选抗原.     

一种新的海洋微藻病毒丝氨酸蛋白酶基因的克隆表达及其活性分析

从海洋球石藻Emiliania huxleyi病毒EhV99B1的基因组中克隆了丝氨酸蛋白酶(Sp)基因(GenBank登录号:KC161207),对该基因的开放阅读框(ORF)进行系统的生物信息学分析,并在大肠杆菌中融合表达,通过亲和层析法获得了纯化的重组Sp。结果表明:EhV99B1-Sp基因的ORF为1 110bp,编码368个氨基酸,蛋白相对分子质量为39.5kDa;该基因片段与GenBank中EhV86-Sp的同源性很高,核苷酸及其对应的氨基酸序列同源性分别为95%和97%,而与其他物种Sp序列的同源性仅为28%~32%,说明其可能是丝氨酸蛋白酶家族中的一个新成员;预测的二级结构特征显示EhV99B1-Sp的蛋白结构域中具有典型的LTAGHC(组氨酸活性位点区域)和AICNGDSGGPLF(丝氨酸活性位点区域)两个丝氨酸蛋白酶催化活性位点的氨基酸基序,是一个两次跨膜蛋白;将该基因在大肠杆菌中进行低温诱导表达,得到分子量为60kDa的重组蛋白,经鲤鱼肌肉丝氨酸蛋白酶(MBSP)抗体检测证实为Sp,且重组蛋白在大肠杆菌细胞中具有明显的生物学活性。本研究结果为进一步探讨EhV99B1-Sp在病毒与宿主相互作用过程中的调节作用及其功能与应用奠定基础。     

6-磷酸山梨醇脱氢酶(gutD)基因克隆、测序和表达

本研究根据6-磷酸山梨醇脱氢酶基因(gutD)两端序列设计引物，以假单胞杆菌(Pseudonmonas XM)的总DNA为模板通过PCR的方法克隆gutD基因并进行序列分析，将克隆得到的gutD基因与原核表达载体pBV220连接并转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM101后检测其蛋白表达及菌株生长耐盐性。     

香鱼Apo-14基因的克隆、序列分析及其mRNA表达与盐度适应性的关系

14 kDa载脂蛋白（Apo-14）是鱼类一种特有的载脂蛋白,是鱼类高密度脂蛋白（HDLs）的重要成分,其生物学功能目前还不明确.本研究采用简并引物,从香鱼（Plecoglossus altivelis）肝脏cDNA文库中筛选香鱼Apo-14基因,该基因cDNA序列全长905个核苷酸,开放阅读框编码一个有144个氨基酸,分子量约为15.9 kDa的蛋白.香鱼Apo-14基因mRNA主要在香鱼肝脏中表达,在肠、肾和鳃中也有少量表达.同源性分析揭示,香鱼Apo-14与已知鱼类中虹鳟（Oncorhynchus mykiss）Apo-14最相似,氨基酸序列同源性为70%.qRT-PCR表明,咸淡水处理组（盐度为10）的肝、肠、肾、鳃中,该基因mRNA均比淡水处理组（盐度为0）明显下调（p〈0.05）,揭示载脂蛋白Apo-14可能与盐度适应相关.     

脊尾白虾C-型凝集素基因cDNA全长的克隆和表达分析

本研究利用本实验室构建的脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)血细胞c DNA文库中的C-型凝集素基因EST序列,采用c DNA末端快速扩增(rapid amplification of c DNA end,RACE)技术克隆获得脊尾白虾C-型凝集素基因c DNA全长,命名为Ec CTL。该基因全长1285 bp,包含1041 bp的开放阅读框,编码346个氨基酸组成的蛋白质,分子量为38.56 k Da,为甘露糖型凝集素。同源性分析表明,脊尾白虾Ec CTL基因氨基酸序列与秀丽白虾(Palaemon modestus)的同源性最高,达到91%。荧光定量PCR分析结果表明,Ec CTL基因在血细胞、肝胰腺、肌肉等组织中均有表达,其中在肝胰腺当中的相对表达量最高。感染鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)后6~12 h,脊尾白虾血细胞和肝胰腺中Ec CTL的表达量较对照组均显著增加(P0.05),且具有明显的时间差异性。本研究证明脊尾白虾C-型凝集素在其免疫反应中起到重要作用,为进一步探索脊尾白虾免疫系统打下基础。     

最小弧菌热不稳定型溶血素基因克隆与序列分析

根据已发表的最小弧菌热不稳定型溶血素（heat-labile hemolysin）基因核苷酸序列，设计和合成一对特异性引物，以最小弧菌96-6-3的基因组DNA为模板，PCR扩增得到热不稳定型溶血素基因片段，克隆到质粒载体pMD-18T中进行测序和分析．其结果表明扩增的热不稳定型溶血素基因片段与已发表的最小弧菌热不稳定型溶血素的同源性高达98％，扩增片段编码由446个氨基酸组成的多肽，推测分子量为50200．软件分析表明编码的氨基酸有较高的抗原性，可作为基因工程疫苗的候选基因片段．     

桐花树多酚氧化酶同源基因片段的克隆及序列分析

以桐花树(Aegiceras corniculatum (L.) Blanco)叶为材料, 采用同源PCR克隆策略, 扩增桐花树多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase, PPO)铜结合区之间的cDNA序列.该序列长度597 bp (Genbank accession No. GQ404509), 编码了一段由199 个氨基酸残基组成的多酚氧化酶保守区片段.桐花树PPO保守区片段具有PPO铜结合区A(CuA)的特征信号序列Hnswl.FFpFHRyyLyffE.同源比对表明, 该序列与GenBank上其他已有的植物多酚氧化酶氨基酸序列的同源性都在65%以上.     

缢蛏天然抗性相关巨噬蛋白2(Sc-Nramp2)基因克隆及其在副溶血弧菌刺激下的表达分析

克隆得到缢蛏天然抗性相关巨噬蛋白2（Sc-Nramp2）基因的cDNA全长序列3 681 bp,该基因的开放阅读框有1 776 bp,编码591个氨基酸,预测分子量为65.86 kDa;其结构具有Slc11蛋白家族的典型特征,包括有10个典型的跨膜结构和2个糖基化位点。Sc-Nramp2基因3'-UTR有2个类似于脊椎动物Nramp2中铁反应控制蛋白结合位点;同源性分析表明,Sc-Nramp2和太平洋牡蛎Nramp2-like的同源性最高为71.6%。实时荧光定量PCR结果表明,Sc-Nramp2基因在闭壳肌、外套膜、肝胰腺、斧足、水管和鳃6个组织中均有表达,其中肝胰腺中的表达量最高,其次是鳃,与其他组织均有极显著性差异（P<0.01）;注射副溶血弧菌后,肝胰腺中Sc-Nramp2基因的表达量较对照组显著上调（P<0.01）,且表达量呈现先上升后下降的趋势,在12 h时达到最大表达量,推测Sc-Nramp2基因参与了缢蛏非特异性免疫应答反应。