红鳍笛鲷弧菌病病原的研究

从广东湛江特呈岛鱼排取患病红鳍笛鲷进行病原分离、纯化,得到一株病原菌Ls 1。该菌 为革兰阴性短杆菌,有运动性,菌落半透明,最适温度28～30℃,需盐生长,氧化酶反应阳性,发酵 葡萄糖不产气,不发酵肌醇,对弧菌抑制剂O/129敏感。经API ID32E细菌鉴定系统及弧菌科细 菌生化鉴定管鉴定,该菌为一株溶藻弧菌(Vibrioaginolyticus);其对红鳍笛鲷的半数致死量为6.32 ×105mL-1。药敏试验结果表明,该菌对阿莫西林、先锋V不敏感,对新生霉素、卡那霉素、多粘菌 素B、四环素中度敏感,而对庆大霉素、氟哌酸、氯霉素、红霉素、链霉素和复方新诺明等有较高的敏 感性。     

红鳍笛鲷和紫红笛鲷种类和群体的矢耳石地标点法识别

【目的】探讨矢耳石地标法在笛鲷种内及种间中的判别作用。【方法】利用2017年购自广西北海、海南文昌、广东阳江的87尾红鳍笛鲷(Lutjanus erythropterus)和76尾紫红笛鲷(Lutjanus argentimaculatus)成鱼的矢耳石样本,基于地标点法分析耳石的形态差异,运用判别分析检验耳石形态差异在2种笛鲷的种间和同种不同群体间的判别功效。【结果】位于听沟前中部交叉点的两个地标点10、11贡献较大,解释了耳石形态变异的64.88%～65.85%,表明两种笛鲷耳石形态的种间差异和种内群体差异主要集中于听沟前中部。基于耳石形态的地标点方法对2种笛鲷的种间判别成功率为97.4%和100.0%;红鳍笛鲷和紫红笛鲷的种内不同群体判别成功率分别为85.7%、83.3%、80.0%和94.1%、78.1%、81.5%。【结论】矢耳石地标点法可作为2种笛鲷种间和种内判别的有效工具。     

红鳍笛鲷(Lutjanus erythopterus)精巢发育的组织学研究

为掌握红鳍笛鲷的繁殖特性,通过石蜡切片、苏木精-伊红染色对红笛鲷精巢的发育进行组织学研究。结果表明,红鳍笛鲷的精巢属于叶状精巢,精子发生过程与其他脊椎动物一样,包括精原细胞、初级精母细胞、次级精母细、精子细胞和精子形成。精巢的生长发育过程的组织学结构共分为5期:3~4月龄精巢为第Ⅰ期精巢,精原细胞无定向分散在结缔组织之间;5~6月龄精巢为第Ⅱ期精巢,精原细胞成束分布,形成曲细精管的雏形;6~9月龄精巢为第Ⅲ期精巢,曲细精管出现管腔,曲细精管的管壁由精原细胞和大量初级精母细胞和次级精母细胞及少数精子细胞构成;10月龄精巢为第Ⅳ期精巢,曲细精管内除了精原细胞和初级精母细胞外、还形成了次级精母细胞和精子细胞,同时,管腔中出现极少量的精子;16月龄精巢为第Ⅴ期精巢,外观呈椭圆形的圆柱状,曲细精管的管腔和壶腹中充满成熟的精子。     

三种笛鲷属鱼类的随机扩增多态性DNA初步研究

RAPD技术是由Williams和Welsh领导的两个科研小组于1990年几乎同时独立创立的一种DNA多态性分析技术，它的原理是利用一系列随机排列的寡核苷酸单链引物，以研究对象的基因组DNA为模板进行PCR扩增，通过扩增产物DNA片段的多态性来检测基因组DNA的多态性。     

三种笛鲷属鱼类的随机扩增多态性DNA初步研究

RAPD技术是由 Williams[1]和 Welsh[2 ]领导的两个科研小组于 1 990年几乎同时独立创立的一种 DNA多态性分析技术 ,它的原理是利用一系列随机排列的寡核苷酸单链引物 ,以研究对象的基因组 DNA为模板进行 PCR扩增 ,通过扩增产物 DNA片段的多态性来检测基因组 DNA的多态性。该技术已被广泛地应用于种质鉴定、遗传多样性、亲缘关系及系统分类研究 [3～ 6]。但对海水鱼类RAPD研究报道较少。红鳍笛鲷 (L utjanus erythopterus Bloch)、紫红笛鲷 (L utjanus argentimaculatus Forskal)和勒氏笛鲷 (L utjanus russelli Bleeker)具有…     

红鳍笛鲷皮肤色素细胞组成、分布及类胡萝卜素含量分析

【目的】揭示红鳍笛鲷（Lutjanus erythropterus）红体色的分布特征及影响机制。【方法】利用色差仪分别测定背部、腹部和尾部皮肤的体色值,用形态学观察、石蜡切片、冰冻切片和透射电镜切片等方法分析色素细胞组成、分布和数量特征,并使用紫外分光光度法和液相色谱-质谱/质谱法研究类胡萝卜素和体色特征的关系。【结果与结论】红鳍笛鲷体表的红色素细胞显著多于黑色素细胞（P <0.001）,且从背部向腹部逐渐减少,红体色受到黑色素细胞分布的影响;皮肤和视网膜是类胡萝卜素的主要沉积部位,皮肤中类胡萝卜素以脂肪酸结合的形式存在,其中红色类胡萝卜素主要有虾青素、角黄素和β-柠乌素等3种,虾青素和角黄素含量与红色素细胞数量呈正相关。建议在饲料中补充虾青素和角黄素以提升红色。     

红鳍笛鲷微卫星DNA标记的开发与遗传多样性分析

以三亚外海的红鳍笛鲷(Lutjanus erythropterus)自然群体为研究对象,利用磁珠富集法开发19个适用于红鳍笛鲷的微卫星DNA标记,其中16个为多态性标记,等位基因数为2～11,期望杂合度为0.242～0.896,观测杂合度为0.156～1.000,Ler 14、Ler 29、Ler 49等3个位点偏离哈迪-温伯格平衡(P<0.0031),Ler9-Ler18、Ler12-Ler19、Ler46-Ler47、Ler46-Ler49、Ler18-Ler50、Ler14-Ler51等6对位点间检测到明显的连锁(P<0.05),Ler29、Ler13、Ler49、Ler19、Ler24、Ler25、Ler14、Ler51、Ler18、Ler9等10个位点属于高度多态位点[多态信息含量(PIC)>0.5],Ler47、Ler12、Ler15、Ler46等4个为中度多态位点(0.25>PIC>0.5)。     

红鳍笛鲷仔稚幼鱼形态与色素细胞发育

【目的】揭示红鳍笛鲷(Lutjanus erythropterus)早期形态特征及色素细胞发育特点。【方法】利用生物显微镜和正置荧光显微镜对0～29日龄的仔稚幼鱼进行连续观察,记录其形态学特征和色素发育的变化情况,分析全长、体长、头长和体高数据。【结果与结论】根据卵黄囊的消失、鳞片出现以及是否全身披鳞片可将红鳍笛鲷胚后发育划分为仔鱼期(0～21 d)、稚鱼期(22～28 d)和幼鱼期3个阶段,而仔鱼期又可细分为早期仔鱼(0～2 d)和后期仔鱼(3～21 d)2个阶段。初孵仔鱼只有黑色素细胞,无游泳能力且生长较慢。鳍条的发育以胸鳍最快,其次是尾鳍、背鳍、臀鳍和腹鳍。初孵仔鱼黑色素细胞形如星点状,在腹部呈近直线排列;2日龄仔鱼开口,随着食性转换仔鱼头部上方出现黄色素细胞;16日龄仔鱼鳃盖出现虹彩色素细胞,呈银白色和紫红色;红色素细胞出现时间最晚,在26日龄稚鱼背鳍及尾鳍鳍膜上首次出现。红鳍笛鲷胚后发育的形态学特征变化及色素细胞发育时序符合硬骨鱼类发育模式。     

红笛鲷IRAK-1基因克隆及哈维弧菌感染后的组织表达

用同源克隆和RACE的方法克隆红笛鲷(Lutjanus sanguineus)白细胞介素1受体相关激酶1(Interleukin-1receptor-associated kinase 1,IRAK-1)基因的cDNA全序列,并用荧光定量PCR分析其在健康鱼及哈维弧菌感染后红笛鲷的组织表达。结果表明,该序列全长3 207 bp(登录号KF728204),包含5′非编码区(UTR)202 bp,3′UTR752 bp,开放阅读框(ORF)2 253 bp,编码750个氨基酸。根据推导的氨基酸序列预测其蛋白分子质量为82.6 ku,理论等电点为6.59。IRAK-1包含1个N端死亡结构域、proST结构域、中央激酶结构域和C末端结构域。荧光定量PCR分析显示,红笛鲷IRKA-1基因在肝脏和皮肤的表达量最高,其次是心脏、鳃、肌肉和胸腺,其余组织的表达量较低。哈维弧菌侵染红笛鲷后,各组织中IRAK-1基因mRNA表达量均呈上调趋势,肝组织中变化最显著。     

恩诺沙星在红笛鲷体内的药代动力学

在水温26±2℃、盐度28条件下,恩诺沙星(enrofloxacin,EF)按5 mg/kg的剂量腹腔注射和口灌红笛鲷(Lutjanus sanguineus),用反相高效液相色谱法研究恩诺沙星在红笛鲷体内的药代动力学和组织分布。结果显示:注射和口灌后红笛鲷血浆的药时数据均符合一级吸收二室模型;血药达峰时间(tp)分别为0.75和1.5 h,血药质量浓度峰值(cmax)分别为5.22和3.94μg/mL,药时曲线下面积(AUC)分别36.98和17.24 mg/(L.h),消除半衰期(t1/2β)分别为13.28和9.18 h;恩诺沙星在组织中分布较广,注射和灌服给药肌肉、肝脏和肾脏的cmax分别为3.53和3.40μg/g、4.08和3.98μg/g、11.23和5.40μg/g,tp分别为1.5和2.0 h、1.0和2.0 h、0.75和1.5 h,AUC分别33.17和23.12 mg/(L.h)、39.36和18.20 mg/(L.h)、98.97和56.69 mg/(L.h);EF在红笛鲷体内消除速度较慢,注射和灌服给药肌肉、肝脏和肾脏的t1/2β分别为22.08和83.32 h、41.52和94.47 h、20.94和21.81 h。表明恩诺沙星注射给药在红笛鲷体内的吸收和消除均快于口灌给药。     

注射氟苯尼考对红笛鲷免疫指标的影响

以0、5、10、20 mg.kg-1的氟苯尼考腹腔注射红笛鲷,研究氟苯尼考在国家规定的使用范围内对红笛鲷血清部分免疫指标的影响。结果显示:5 mg.kg-1组氟苯尼考对所测的各项指标无影响或影响不显著;10 mg.kg-1组中氟苯尼考对红笛鲷血清SOD活力、AKP活力有显著性提高(P<0.05),对溶菌酶的含量、IgM的含量无显著性影响;20 mg.kg-1组中红笛鲷血清碱性磷酸酶AKP、超氧化物歧化酶SOD活力、溶菌酶、抗体IgM均受到显著性抑制(P<0.05),但影响持续时间不同,这表明高浓度氟苯尼考显著抑制红笛鲷各项免疫指标,从而影响到鱼体自身的免疫功能。     

红笛鲷NCCRP-1基因原核表达条件的优化及纯化

通过克隆编码红笛鲷(Lutjanus sanguineus)非特异性毒性细胞受体蛋白-1(nonspecific cytotoxic cell receptor protein-1,NCCRP-1)成熟肽基因序列,然后与载体连接构建pET21a-NCCRP融合蛋白表达载体,将其转入大肠杆菌BL21进行诱导表达并优化条件。SDS-PAGE分析表明,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.8 mmol/L、37℃条件下培养3 h后表达量最大,分子大小与预期值相符,融合蛋白主要以包涵体形式高效表达,通过HisTrap HP柱子使其得到进一步纯化;Western blot分析表明,该融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性结合,说明获得该表达产物。     

红笛鲷CD40和去除信号肽CD40的原核表达

根据红笛鲷(Lutjanus sanguineus)CD40基因cDNA全长序列设计2对特异性引物,利用RT-PCR技术从红笛鲷头肾组织中扩增出CD40 ORF序列和去信号肽序列,分别与原核表达载体pET-32a(+)相连,构建原核重组表达质粒,命名为pET32-CD40和pET32-△CD40,并分别转化至大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导后,分别于54 ku和53 ku处有清晰的目的蛋白条带。融合蛋白的表达效率最佳的表达条件,pET32-CD40是诱导温度37℃,起始D(600nm)为0.4,IPTG浓度为0.08 mmol/L,诱导5 h;pET32-△CD40是诱导温度37℃,起始D(600nm)为0.6,IPTG浓度为0.10 mmol/L,诱导6 h。在各自优化的表达条件下,pET32-△CD40融合蛋白表达量较pET32-CD40融合蛋白高。RNAstructure软件分析发现,CD40的mRNA 5′端序列形成复杂且较为稳定的二级结构,不利于翻译的起始,表明信号肽序列的存在可能对CD40基因在原核细胞中的表达有一定的影响。     

一种复方中草药饲料添加剂在红笛鲷网箱养殖中的应用

将黄芪、当归、甘草和山楂等粉碎后按一定比例配伍制成复方中草药饲料添加剂后,按质量分数0.5%、1.0%、1.5%和2.0%添加到基础饲料中,连续投喂红笛鲷(体重234.95±19.26 g,体长24.76±1.42 cm)56 d,研究复合中草药制剂对红笛鲷生长、成活、免疫和抗病力的影响。结果表明,基础饲料中添加本复方中草药饲料添加剂能够显著促进红笛鲷的生长,增强其血清中的抗菌活力和溶菌酶活力,提高红笛鲷成活率及其对溶藻弧菌的免疫保护率,其中以添加1.5%(质量分数)和连续饲喂28 d效果为最佳(P<0.01)。     

红笛鲷重组激活基因rag1原核表达条件的优化及纯化

克隆编码红笛鲷(Lutjanus sanguineus)RAG1蛋白(recombination activating protein1)活性核心区的基因序列,并与pET-28a(+)载体连接,构建原核表达载体pET-28a-RAG1,将其转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,利用IPTG进行诱导表达。为提高融合蛋白的表达效率,运用传统的实验方法对诱导条件进行优化。SDS-PAGE分析表明,在37℃条件下,利用0.1 mmol/L IPTG诱导8 h后,RAG1重组融合蛋白的表达量最大,相对分子质量与预测值相符,该蛋白主要以包涵体形式高效表达,利用His Trap HP亲和柱使其得到进一步纯化;Western blot分析显示,该融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性结合,说明表达蛋白为目的蛋白。     

脂多糖、苯酚、硫酸铜对红笛鲷非特异性细胞毒性细胞受体基因表达的影响

应用Real-time PCR技术,研究脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、苯酚、硫酸铜刺激红笛鲷(Lutjanussanguineus)后非特异性细胞毒性细胞受体(NCCRP-1)基因在不同组织里的表达差异。结果发现,LPS刺激红笛鲷24 h后NCCRP-1在红笛鲷头肾、脾脏、胸腺、肝脏、心脏、脑、肌肉和肠组织中均有表达,其中头肾表达量最高,脾脏次之,然后依次是肝脏、脑、肌肉、胸腺和肠,心脏表达量最少。LPS、苯酚和CuSO4刺激红笛鲷后,随着刺激时间的增长,NCCRP-1表达量在各组织达到峰值的时间不同。以头肾为模式组织,RT-PCR的结果显示,红笛鲷NCCRP-1在LPS、苯酚和CuSO4的刺激下的表达模式相似,随着时间的增加NCCRP-1表达量逐渐增加,分别在24、9、12 h处达到最高,达到对照组的52、30、24倍左右,之后表达量开始下降。免疫组织化学表明,NCCRP-1只在头肾、脾脏和胸腺的特定细胞中表达。     

红笛鲷脾脏、头肾和胸腺中IgM~+细胞与ANAE~+ T细胞的分布

采用ANAE组化方法(α-醋酸萘酯酶染色法)和ABC免疫组化方法(亲合素-生物素-过氧化物酶复合物法)分析了1龄红笛鲷成鱼的胸腺、头肾和脾脏中IgM+细胞(具有免疫球蛋白分子IgM的细胞)、ANAE+ T细胞的分布。结果表明,三个淋巴器官皆有IgM+细胞、ANAE+ T细胞;胸腺皮质区IgM+细胞数量最多,其次是头肾、胸腺髓质区、脾脏;ANAE+ T细胞以脾脏中数量居多,其次是头肾、胸腺髓质区、胸腺皮质区;ANAE+ T细胞在三个器官中多呈均匀分布,而IgM+细胞在血管、胸腺小体、黑色素巨嗜细胞中心等的外周呈密集分布。实验结果进一步证明了胸腺中的T细胞多为不成熟的T细胞,此外,还含有大量的IgM+细胞;而脾脏、头肾内的ANAE+ T细胞多于胸腺,推测胸腺成熟的T淋巴细胞迁移到头肾和脾脏。     

紫红笛鲷随机扩增多态性DNA及遗传多样性分析

采用RAPD技术分析了湛江近海紫红笛鲷 (LutjanusargentimaculatusForsk l)的遗传多样性。从 12 0个随机引物中筛选出了 14个引物。 14个引物共检测到 173个位点 ,其中多态位点比例 (P)为 6 8.79%,遗传距离 (D)为 0 .2 2 2 8,遗传多样性指数 (H)为 0 .190 4。结果表明 ,目前湛江近海的紫红笛鲷自然群体的遗传多样性仍然维持在良好水平 ,捕捞尚未对其造成明显影响。