宁波-舟山港口航道3种致病性细菌毒力特征与耐药性

本文调查分析了宁波-舟山港口航道副溶血弧菌 Vibrio parahemolyticus、溶藻弧菌Vibrio alginolyticus和嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila的毒力特征和耐药性特点。用PCR方法检测分离菌株的毒力基因分布模式发现,副溶血弧菌毒力基因型以gyrB⁺,toxR⁺,tlh⁺和 tdh⁺为代表,溶藻弧菌毒力基因型以aspA⁺,tlh⁺,collagenase⁺和toxS⁺为代表,嗜水气单胞菌毒力基因型以aerA⁺,alt⁺,aha1⁺和hlyA⁺为代表;副溶血弧菌、溶藻弧菌和嗜水气单胞菌代表菌株相应基因的检出率分别为57.1%、40.0%和50.0%。用24种常见抗生素对3种细菌的分离代表菌株进行药敏调查,耐药率分别为4.17%、8.33%和29.17%。实验结果表明宁波-舟山港口航道3种致病性细菌具备较丰富的毒力基因种类和耐药性,需要有针对性地制定预防措施。此外,鉴于毒力基因型与致病性之间的相关性,毒力基因可作为标记基因,用于致病性细菌的检测。     

海洋弧菌HN897 β-琼脂糖酶基因vas1-1339异源表达及活性分析

海洋弧菌HN897株是一株高产琼脂糖酶的Vibrio astriarenae菌, 前期功能缺失实验证明其β-琼脂糖酶基因vas1-1339的缺失可显著降低弧菌HN897株的琼脂水解活性。文章在大肠杆菌中异源表达Vas1-1339基因编码蛋白, 分析该基因的表达及蛋白功能活性。首先, 构建含vas1-1339基因开放阅读框全长的表达载体pET28a-1339, 利用原核表达技术在大肠杆菌中成功地异源表达了Vas1-1339琼脂糖酶; 然后, 利用卢戈氏碘液染色分析发现异源表达Vas1-1339琼脂糖酶的大肠杆菌能够高效水解琼脂, 且异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)最优诱导浓度为10μmol·L^-1; 免疫印迹分析发现胞内基因表达产物羧基端可能存在切割现象, 推测Vas1-1339琼脂糖酶存在复杂的成熟过程。对纯化的琼脂糖酶活性分析发现海洋弧菌HN897株β-琼脂糖酶Vas1-1339能够独立发挥琼脂糖降解功能。     

3种致病弧菌感染对大黄鱼7种酶活性的影响

大黄鱼溃疡病主要由3种致病弧菌引起:溶藻弧菌Vibrio alginolyticus、哈维弧菌V. harveyi和副溶血弧菌V. parahaemolyticus。为了解大黄鱼抗病原菌感染的免疫反应机理,对其疾病防御提供重要的理论基础,本实验将健康的大黄鱼随机分为3个实验组和1个对照组,分别注射0.2 mL的哈维弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌及灭菌生理盐水。在人工感染后的第0,1,2,4,7,10,13,16,20天分别采样,通过测定每组大黄鱼血清中7种免疫相关酶活性,比较这3种致病弧菌对大黄鱼影响的差异性。结果表明:在感染后的1～10 d,实验组大黄鱼血清中血清溶菌酶(LSZ)、酸性磷酸酶(ACP)、过氧化物酶(POD)、髓过氧化物酶(MPO)的活性变化,总体表现为先升高、后降低再逐渐升高最后趋于-致的现象,且不同病原菌之间存在-定的时效差异。 碱性磷酸酶(AKP)对入侵体内的哈氏弧菌反应较敏感,ACP、POD和MPO对溶藻弧菌反应较敏感,LSZ和PO对副溶血弧菌反应较敏感。     

水产动物致病性副溶血弧菌双重PCR 检测方法的研究

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是多种水产养殖动物的主要病原菌,尤其是可引起凡纳滨对虾幼虾呈毁灭性死亡。本研究基于gyrB和toxR两种基因序列设计2对特异性引物,建立一种副溶血弧菌快速、准确的双重PCR检测方法,扩增目的片段大小分别为285 bp和368 bp。结果表明在同一PCR反应体系中副溶血弧菌可同时扩增大小分别为285 bp和368 bp的2种基因片段,两种引物对4种其他水产动物病原菌无交叉反应;敏感性检测结果显示,该双重PCR最低能检测8.867 2×103 CFU/mL菌体浓度的副溶血弧菌,对副溶血弧菌模板DNA的检出极限为0.029 3 mg/L;对发病中国对虾糠虾幼体、水产品及虾池养殖用水进行双重PCR检测,呈阳性反应的样品可分离出优势生长的副溶血弧菌。该实验所建立的基于gyrB和toxR两种基因的双重PCR检测方法可用于副溶血弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及分子流行病学的调查研究。     

4株长牡蛎(Crassostrea gigas)致病性哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)鉴定及其毒力基因检测

为明确江苏连云港养殖长牡蛎大规模死亡病因,对分离自长牡蛎的4株病原菌开展了致病性、表型特征、分子特征等研究,结果表明4株病原菌均具致病性,4株病原菌ML1、ML2、ML3、ML4对长牡蛎的半数致死量LD50分别为2.8×105、1.1×105、1.8×105和1.6×105 CFU/mL;4株病原菌均为呈短杆状革兰氏阴性细菌,氧化酶阳性,还原硝酸盐,能利用甘露醇、纤维二糖,形态及理化特性结果表明4株分离菌与弧菌属的哈维氏弧菌亲缘关系最近;16SrRNA、gyrB、rpoA基因同源性检索及系统发育学分析结果表明4株分离菌与GenBank数据库中哈维氏弧菌的基因序列相似性最高且在系统发育树中聚为1个分支;根据4株分离菌的致病性、表型与分子特征,表明引起长牡蛎大规模死亡的病原为哈维氏弧菌。为进一步明确分离菌株毒力基因的携带情况,检测了分离鉴定的4株病原菌的9种毒力基因,结果表明,4株病原菌均可检测到luxR、toxR、vhhA和vhhB 4种毒力基因,扩增片段大小分别为679bp、390bp、1324bp和216bp,其他5种毒力基因未检测到,且分离鉴定的4株病原哈维氏弧菌携带相同的毒力基因,这些毒力基因可作为检测致病性哈维氏弧菌的分子标记。     

海洋蛭弧菌DA5全基因组测序及序列分析

为深入挖掘和利用海洋蛭弧菌及其基因资源, 本研究利用Illumina HiSeq测序平台对一株属于嗜盐噬菌弧菌(Halobacteriovorax)的海洋蛭弧菌DA5进行了全基因组测序, 对基因组进行组装、基因预测和功能注释, 并与其他8株蛭弧菌进行了比较基因组分析。结果显示: DA5基因组大小为3.27Mb, GC含量为36.5%, 预测编码基因3175个。在DA5基因组中注释到303个基因具有直系同源蛋白簇分类, 与代谢通路相关基因1239个。比较基因组分析表明: DA5符合海洋蛭弧菌基因组的基本特征, 与其他8株蛭弧菌共有467个同源基因家族, 而DA5特有基因为266个。DA5中与细胞运动相关基因62个, 其中编码甲基受体趋化蛋白、鞭毛蛋白、鞭毛马达及其开关蛋白基因均与嗜盐噬菌弧菌BAL6_X的对应基因亲缘关系最近。对DA5全基因组序列的注释和功能分析, 为深入研究其捕食特性和作用机制, 并更有效地利用其防控海水养殖细菌病害提供了基础。     

别样玫瑰变色杆菌(Aliiroseovarius sp.)Z3基因组测序及比较基因组分析

菌株Z3是一株从凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肠道样品中分离出的细菌。本研究利用Illumina HiSeq测序平台对其进行了测序, 用SOAPdenovo等软件进行基因组组装、系统发育分析、基因预测和功能注释, 并与别样玫瑰变色杆菌属(Aliiroseovarius)已知的5个种的模式株进行了比较基因组分析。基因组注释结果显示, Z3基因组大小为3525503bp, GC(guanylate and cytidylic acid)含量为59.4%, 预测包含3509个编码蛋白基因。通过16S rRNA基因全长序列比对、平均核苷酸一致性(ANI)、DNA-DNA杂交(DDH)和共线性分析发现, 菌株Z3与Aliiroseovarius crassostreae CV919-312T的16S rRNA基因全长序列相似度最高, 为98.20%, 与Aliiroseovarius sediminilitoris DSM 29439T的DDH和ANI值最高, 分别为26.80%和84.95%, 属于Alliroseovarius属的新种, 将其命名为Aliiroseovarius sp. Z3。经比较基因组分析发现, Aliiroseovarius sp. Z3与5个近缘的模式株细菌共享2005个直系同源核心基因簇; Z3拥有的413个独立基因经注释, 主要与碳水化合物转运与代谢、氨基酸转运与代谢、复制、重组及修复等功能相关。功能注释发现Z3具有进行完整的反硝化途径的相关基因, 其利用的可能是环境中的硝酸盐、亚硝酸盐等。本研究对Z3全基因序列的注释、功能和比较基因组的分析, 不仅丰富了Aliiroseovarius属细菌基因组资源, 还为深入研究其反硝化特性等提供了基础。     

深海噬菌体BVE2内溶素的重组表达及其活性研究

本研究从一株来源于西南印度洋沉积物的噬菌体BVE2基因组中得到了一条全长702 bp,编码噬菌体内溶素的基因Lysin132,编码的蛋白共含有234个氨基酸残基,预计分子量为25.74 kDa;氨基酸序列同源比对结果表明BVE2 Lysin132具有多个酰胺酶活性位点。进化树分析结果表明BVE2 Lysin132是一种N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶。将Lysin132克隆到pEASY-Blunt E2 Expression Vector中,构建了E.coli-pEASY-Lysin132表达菌株。成功用IPTG诱导表达,得到了大量带有6×His标签的重组BVE2 Lysin132。经镍柱纯化后进行SDS-PAGE电泳,得到单一目的蛋白条带。酶学性质分析结果表明,重组BVE2 Lysin132的最适反应温度为30℃,在中高温下热稳定性良好,在10～50℃下孵育90 min,仍能保持70%以上的酶活力;最适pH为7.0,在pH 6.0～8.0时均能保持80%以上的酶活力,表明该酶有较宽的pH作用范围;Na⁺、Mg²⁺可以使酶活力显著提高20%以...     

含铁肠杆菌素受体调节蛋白VPA0148对副溶血弧菌毒力的影响

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种嗜盐性革兰氏阴性菌, 广泛分布于海洋环境中, 能够引起肠胃炎、伤口感染以及败血症, 是人类重要的病原菌之一。宿主体内被认为是一种低铁环境, 能够激发致细菌的毒力。副溶血弧菌能够分泌弧菌素或利用外源铁载体来获取铁。在低铁条件下, 编码双组份调控系统的基因簇VPA0148-VPA0149转录上调, 使含铁肠杆菌素受体PeuA转录出有活性的蛋白。VPA0148编码产物为一个响应调节因子, 具有一个磷酸基团接收结构域和一个DNA结合结构域。本研究发现, VPA0148的缺失增强了菌株的生物膜形成能力和对斑马鱼的致死能力, 同时能够促进菌株在低铁环境中的生长, 并增强菌株的群集运动。研究结果表明含铁肠杆菌素受体调节蛋白VPA0148对副溶血弧菌致病力具有调控作用, 增进了对铁调节副溶血弧菌毒力机制的认识。     

褐斜鲽(Plagiopsetta glossa)线粒体基因组特征及重排机制研究

冠鲽科(Samaridae)隶属于鲽形目(Pleuronectiformes), 包含冠鲽属(Samaris)、沙鲽属(Samariscus)和斜鲽属(Plagiopsetta)。目前研究表明, 冠鲽(Samaris cristatus)和满月沙鲽(Samariscus latus)的线粒体基因组结构都有重排, 并且两者的基因数量也有差别。为检测斜鲽属鱼类中是否也有不同的特征结构, 我们选用褐斜鲽(Plagiopsetta glossa)作为代表种进行斜鲽属鱼类线粒体基因组特征分析, 同时与冠鲽属及沙鲽属鱼类的线粒体基因组特征进行对比。分析显示, 褐斜鲽的线粒体基因组全长为18723bp, 包括39个基因: 13个蛋白基因、24个tRNA基因、2个rRNA基因、2个控制区、1个轻链复制起点和比典型基因组多的13个间隔子。和经典鱼类的线粒体基因组相比, 褐斜鲽和满月沙鲽都多了tRNA-Cys和tRNA-Tyr两个tRNA, 冠鲽只多了tRNA-Cys, 且3个种类都多了一个控制区, 但褐斜鲽与满月沙鲽的基因排列顺序相同。褐斜鲽线粒体基因的重排导致不同位置的6个tRNA形成了六连体基因簇“tRNA-Cys₁-Tyr₁- Ser1-Lys-Arg-Ser2”, “ND5-ND6-Glu-Cytb-Thr”则位于六连体之后, 但这11个基因相对的排序没有发生变化。采用双复制随机丢失模型(double replications and random loss, DRRL)对褐斜鲽基因的重排现象进行分析, 认为该鱼类基因数量、排列顺序以及比典型基因组多13个间隔子等特征为该模型提供了新的依据。     

源于克雷伯氏菌Klebsiella sp.AC-11的3株噬菌体的生物学特性

从国家海洋局第三海洋研究所海水养殖池中分离得到一株细菌AC-11,16SrDNA序列分析表明其与肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种(Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae)具有最高的序列同源性达99.78%.以此菌株为宿主菌,于2008年11月采用双层平板法分离得到3株裂解性噬菌体KP1,KP...     

北部湾养殖牡蛎体内异养细菌数量及其耐药性研究

为了探究北部湾养殖区域香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)体内的异养细菌和弧菌数量及其耐药概况变化, 对不同养殖场牡蛎体内的异养细菌进行分离培养, 并统计其数量, 通过药敏纸片扩散等方法研究了细菌的耐药状况。结果显示: 牡蛎在高死亡率养殖环境中体内的异养细菌[(8.6±0.4)×10⁶CFU·g^-1]和弧菌[(9.5±0.4)×10⁵CFU·g^-1]数量较高, 在中死亡率环境中体内的异养细菌[(6.9±0.2)×10⁶CFU·g^-1]和弧菌[(4.5±0.6)×10⁵CFU·g^-1]数量次之, 在低死亡率养殖环境中体内的异养细菌[(3.3±0.1)×10⁶CFU·g^-1]和弧菌[(2.5±0.6)×10⁵CFU·g^-1]数量最低。耐药细菌主要为革兰氏阴性菌, 对β-内酰胺类(青霉素)、糖肽类(万古霉素)的耐药率较高, 对四环素类(四环素、多西环素)的耐药率次之, 对氨基糖苷类(链霉素、庆大霉素、妥布霉素、新霉素)、大环内酯类(红霉素)、喹诺酮类(诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、恩诺沙星)的耐药率较低。在高死亡率环境中牡蛎体内的多重耐药菌占79.7%, 其耐药谱型(48种)较广; 在中度死亡率环境中牡蛎体内的多重耐药菌占66.2%, 其耐药谱型为30种; 在低死亡率环境中牡蛎体内的多重耐药菌占58.4%, 其耐药谱型为17种。本文探究了牡蛎死亡率与其体内异养细菌数量和细菌耐药性的关系, 结果显示牡蛎在高死亡率环境中体内的耐药细菌数量多、耐药谱型较广, 低死亡率环境中牡蛎体内的耐药细菌数量较少, 异养细菌数量与牡蛎死亡率呈正相关关系, 两者相关系数为0.996。     

我国东南沿海坛紫菜遗传多样性研究

利用线粒体COX和叶绿体rbcL基因片段对我国东南沿海坛紫菜(Pyropia haitanensis Chang et Zheng)9个野生群体和2个养殖群体(共125个个体)进行遗传多样性分析。比对分析后得到408 bp的COX基因片断和488 bp的rbcL基因片断。联合分析的基因片断长度为896 bp,其中T、C、A、G的含量分别为34.9%、14.6%、34.2%和16.3%。检测到变异位点128个,其中单碱基变异位点19个,简约信息位点109个。群体的平均核苷酸多样性为0.035 9±0.028 4,单倍型多样性为0.817 0±0.024 0。125个个体共定义了31个单倍型,其中Hap1、Hap10和Hap16是核心单倍型,分别占全部样本的32.8%、12.8%和24.8%。群体遗传距离和地理距离相关性检测显示二者呈线性相关(R²=0.002 2,p=0.735 4),即遗传距离随地理距离的增大而增大,但未形成地理隔离。根据单倍型构建的ML树显示,坛紫菜群体之间没有明显的地理谱系结构,表明各个群体之间存在基因交流。     

Generation and analysis of expressed sequence tags from the salt-tolerant eelgrass species, Zostera marina

Zosteramarina, a monocotyledonous angiosperm, is one of themost important seagrass species. To investigate the salt-tolerancemechanismand discover salt-tolerant genes in Z. marina, a cDNA library was constructed. Single-pass sequencing of the 5' ends of 4 081 clones yielded 4 002 high quality expressed sequence tags (ESTs), which were assembled into 241 contigs and 1 673 singletons, representing 1 914 unigenes. The average length of the ESTs was 582 bp, with sizes ranging from100-1 500 bp. Basic Local Alignment Search Tool (BLASTX) analysis revealed that 1 664 unigenes had significant homology to known genes in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) non-redundant (nr) database (E-value≤5-10). Among them, the twomost abundant genes encoded metallothionein (157 ESTs) and chlorophyll a/b-binding protein (38 ESTs), accounting for 7.1% and 1.7% of the total ESTs, respectively. Using Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), 1 462 unigeneswere assigned to 1 161 pathways (E-value≤5-10). A total of 938 unigenes were assigned Gene Ontology (GO) terms based on the GO hierarchy analysis, and InterProScan searches recognized 1 003 InterPro families. Three genes formetallothionein in Z. marina that belonged to Class II was identified. Results of this study will improve understanding of the molecular mechanisms of saline tolerance in Z.marina.     

伶仃洋夏季叶绿素a时间变化特征及分析

文章使用2019年7月5日—20日在珠江河口伶仃洋定点连续观测的海表面叶绿素a质量浓度、海表面气温、气压、风速、风向、海表温度、盐度、流速、流向、遥感降雨量数据和中等分辨率成像光谱仪可见光波段影像, 利用小波分析和集成经验模态分解方法分析了观测期间内伶仃洋海表面叶绿素a的时间变化特征及其影响因子。分析结果表明, 观测期间海水表层叶绿素a质量浓度的变化范围为0.44~1.75µg·L^-1, 平均值为0.80µg·L^-1, 其变化周期主要为6h、12h和24h。其与相对应周期的潮流存在明显的相位关系, 并且在降雨后两者的相位关系发生了转换。7月5日—12日, 叶绿素a与潮流基本呈反相位关系, 涨急时叶绿素a质量浓度低, 落急时叶绿素a质量浓度较高, 浓度相差约为0.3µg·L^-1。珠江流域在7月8日—13日发生了一次强降雨过程, 降雨前后海水表层叶绿素a质量浓度在6h、12h和24h周期波段的振幅由0.02~0.09µg·L^-1增加到0.15µg·L^-1左右。同时, 降雨对珠江河口的叶绿素a质量浓度造成了一个持续80h的增加过程, 浓度增加了0.3µg·L^-1。发生降雨后, 7月13日—20日期间潮流滞后于叶绿素a约6h, 水位最高时叶绿素a质量浓度最低, 水位最低时叶绿素a质量浓度最高。由以上结果可以看出, 降雨不仅引起了河口区叶绿素a质量浓度的增加, 还造成了叶绿素a和潮流间相位关系的转换。     

不同光强下长茎葡萄蕨藻(Caulerpa lentillifera)直立枝和匍匐枝的光生理特征及其对升温的响应

海洋绿藻长茎葡萄蕨藻(Caulerpa lentillifera, 又名海葡萄)因具有较高经济和生态价值而备受关注, 光照和温度变化均会改变长茎葡萄蕨藻生理代谢, 最终影响其经济价值和生态功能。文章比较研究不同生长光强下(40、80、120和160 µmol·photons·m^-2·s^-1)长茎葡萄蕨藻不同部位, 即直立枝和匍匐枝的生理和生化特征, 以及其对升温(+3℃、+6℃和+9℃)的响应。结果显示, 光强由40升至120µmol·photons·m^-2·s^-1时对长茎葡萄蕨藻相对生长率(RGR)的影响不显著, 但是光强升至160µmol·photons·m^-2·s^-1时可使RGR降低49%。弱光下(40µmol·photons·m^-2·s^-1)直立枝的叶绿素(Chl a)和类胡萝卜素(Car)含量为匍匐枝的1.52和1.49倍; 直立枝的Chl a和Car含量随生长光强升高而降低, 匍匐枝随光强升高而升高, 二者蛋白含量则均随光强升高而先升高后降低。弱光下直立枝的净光合放氧速率(P_n)和呼吸速率(R_d)分别为匍匐枝的2倍和70%, 但是二者的最大光化学效率(F_V/F_M)差异不显著。光强升高提高直立枝和匍匐枝的P_n和R_d, 但对二者F_V/F_M的影响不显著。同时, 弱光下直立枝的超氧化物歧化酶(SOD)活性比匍匐枝低20%, 二者过氧化氢酶(CAT)活性差异不显著; 光强升高提高直立枝和匍匐枝的SOD活性, 降低CAT活性。研究还发现, 直立枝和匍匐枝的P_n随温度升高而降低, 但前者的降低程度即光合速率随升温的变化率随光强升高而降低, 后者的则随光强升高而升高, 可见温度升高在弱光下对长茎葡萄蕨藻直立枝的负面影响更大, 在强光下则对匍匐枝的负面影响更大。     

长臂缨鲆核糖体RNA基因序列多态性特征分析

为了解鲽形目Pleuronectiformes鲆科Bothidae长臂缨鲆Crossorhombus kobensis (Jordan & Starks, 1906) 核糖体RNA基因的序列多态性特征, 本研究共获得该鱼类包括18S、5.8S、ITS1和ITS2全长及28S部分序列的128条克隆序列。经序列比对、聚类分析以及重组检测, 结果显示5.8S (158bp) 无长度变异, 而其他4个基因片段则表现出较高的长度多态性, 并可分为不同序列类型: 18S (1856~1893 bp) 有4种序列类型A、B、C和R; 28S (967~974bp) 和ITS1 (407~ 505bp) 均有3种类型A、B和R; ITS2 (423~447 bp)存在2种类型A和B。此外5个基因片段在碱基组成中均表现出GC偏倚, 并且ITS2 (71.14%)>ITS1 (65.37%)>28S (62.22%)>5.8S (57.67%)>18S (54.95%)。对具有不同序列类型的18S、28S和ITS进行真、假基因推断时, 通常的判别特征不足以提供有力依据, 因此增加了与4种鲆科近缘鱼类长冠羊舌鲆Arnoglossus macrolophus、青缨鲆Crossorhombus azureus、大鳞短额鲆Engyprosopon grandisquama以及冠毛鲆Lophonectes gallus相应基因片段的比对。各基因片段的插入/缺失以及特异性碱基差异位点比对结果显示: 18S和28S的短序列类型A与4种鲆科鱼类序列一致, 而其他序列类型则不同; ITS1序列类型A与4种鲆科鱼类在类型B的缺失位点均无缺失, 因此推测18S、28S和ITS1的A类型为真基因, 而其他类型为假基因。ITS2的A和B类型在差异位点上与4个鲆科鱼类不存在一致性, 没有足够的依据对两个类型做出真、假基因的推断。长臂缨鲆核糖体RNA基因中, 5.8S序列最为保守遵循协同进化的方式, 而其他4个基因片段为非协同进化的方式。