拟穴青蟹chh基因近端启动子的功能分析

甲壳动物高血糖激素家族在调控甲壳动物的变态发育、生殖、蜕皮、血糖平衡及体内的渗透压平衡等方面起着重要的作用,甲壳动物高糖激素(CHH)是甲壳动物高血糖激素家族中的重要成员.通过Tail-PCR方法克隆获得拟穴青蟹(Scylla paramamosain)chh基因的近端启动子区序列,从翻译起始位点(ATG)起,共657 bp.生物信息学分析结果显示,转录起始位点位于翻译起始位点(ATG)上游第74个碱基(A),在转录起始位点(A)上游31 bp处存在TATA box;核心启动子区位于-41~+9 bp之间,包含在线软件预测的转录起始位点;潜在的转录因子结合位点包括Oct-1、C/EBPalp、GATA-1、Sp1、Ap-1、NF-κappa B、NF-1、RAP1、HNF-3等;目前获得的chh基因启动子区中没有Cp G岛.成功构建了chh基因4个启动子不同长度片段C1—C4,分别位于-583~+205、-388~+205、-286~+205、-46~+205 bp.含启动子不同长度片段的表达载体瞬时转染HEK293T细胞和Sf9细胞后的活性分析表明,在-286~-46、-583~-388 bp区域可能存在负调控基因表达的转录因子结合位点,在-388~-286 bp区域可能存在正调控基因表达的转录因子结合位点.     

金乌贼热休克蛋白基因的挖掘及对低盐胁迫的响应

热休克蛋白(heat shock proteins:HSPs)为动植物响应外界胁迫产生的一类蛋白质,能有效改善机体对外界胁迫的适应能力.本研究基于先前获得的低盐胁迫金乌贼(Sepia esculenta)高通量转录组数据,对与低盐胁迫密切相关的热休克蛋白(热休克蛋白家族和晶体蛋白(crystallin)家族)基因进行挖...     

基因foxl2的结构及表达调控

叉头框转录因子L2基因(foxl2)是参与多个靶基因转录调控的重要转录因子基因。目前研究认为该基因主要参与脊椎动物的卵巢分化、发育及其功能维持,但在无脊椎动物中的研究很少。本文结合作者已有的研究成果概述了foxl2基因结构特点,提出该亚家族主要以叉头框的6个特殊氨基酸序列与其它亚家族区分开来;总结了该基因自身的表达调控,认为可能在转录、转录后及翻译后等不同水平都存在调控;进一步对该基因在不同动物中的空间表达特征及功能等方面进行概述,推测foxl2基因在低等动物中具有的表达多样性可能与其功能多样性有关。     

大黄鱼白细胞介素17受体E-like的分子特征及进化分析

白细胞介素17受体(Interleukin 17 receptor,IL-17R)家族与IL-17细胞因子家族介导的各类反应有着密切联系.IL-17RE-like(IL-17REL)是一类最新发现的IL-17受体,其结构与IL-17RE相似,但尚未发现其配体.本研究克隆得到大黄鱼(Larimichthys crocea)IL-17REL(Lyc IL-17REL)的全长c DNA,其开放阅读框全长1 659个核苷酸,推断可编码一个由552个氨基酸组成的蛋白,含有信号肽、胞外段、跨膜区和胞内段.与其他物种的IL-17REL相似,Lyc IL-17REL蛋白的胞外段具有一个保守的FN I-like结构域,而胞内段缺少IL-17受体家族保守的SEFIR(SEF and IL-17R)结构域.多序列比对分析表明Lyc IL-17REL与日本河豚(Takifugu rubripes)IL-17REL的氨基酸序列同源性最高,序列一致性可达57.0%.系统进化分析表明,脊椎动物的IL-17受体家族可分为2类,IL-17RA/RB/RD为一类,IL-17RC/RE/REL为一类.其中鱼类及高等脊椎动物的IL-17REL与IL-17RE亲缘关系最近,并且推测二者可能是由同一基因从硬骨鱼类之前的物种中分化而来.组织分布表明Lyc IL-17REL在所有被检测的组织中为组成型表达,在黏膜相关组织如小肠和鳃中的表达量最高.大黄鱼受嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)诱导刺激后,Lyc IL-17REL在其头肾及鳃中的基因转录水平均显著上调.这表明Lyc IL-17REL可能在细菌感染引起的免疫反应中起着重要作用.     

青蛤(Cyclina sinensis)金属硫蛋白及硫氧还蛋白基因的克隆与表达分析

利用构建的cDNA文库及高通量测序方法,获得金属硫蛋白及硫氧还蛋白基因全长。结果表明,青蛤金属硫蛋白和硫氧还蛋白的cDNA全长分别为776bp和804bp,金属硫蛋白基因编码74个氨基酸,包含7个CXC特征结构;硫氧还蛋白基因编码165氨基酸,包含5个氨基酸构成的活性中心。采用实时定量PCR方法分析了两种基因在Cd2+胁迫下的表达变化,结果显示,金属硫蛋白基因在Cd2+胁迫下6—12hmRNA表达量急剧上升,与对照组有显著性差异(P<0.01)。硫氧还蛋白基因在Cd2+胁迫下mRNA在6h明显升高,在6—24h与对照组出现显著性差异(P<0.05)。说明Cd2+能够诱导青蛤金属硫蛋白和硫氧还蛋白基因表达的时序性升高,二者的转录过程反映了贝类抵御重金属胁迫的分子调控过程。     

泰来草WOX转录因子的筛选与结构分析

WOX转录因子家族是植物中特有的一类转录因子家族,其主要参与调控干细胞多能性、侧生器官的发育、花器官的形成和胚发育等多种生物学功能,同时是一类比较古老的转录因子,因此也有以此为基准进行进化分析的研究。目前,WOX转录因子家族在大多数陆生植物和淡水生植物中被发现,在海洋植物中,这一类转录因子的研究尚较少。泰来草(Thalassia hemprichii)是一种热带区域常见的海洋单子叶植物,具有重要生态功能。本研究利用高通量测序技术获得泰来草的转录组信息,从中筛选获得了一个WOX基因(命名为ThWOX8),CDS序列全长597 bp,编码198个氨基酸,对其进行三维结构建模,显示其具有典型的HB结构,属于WOX转录因子家族中的中间分支。由于对海洋植物的WOX基因研究较少,本研究收集了93个位于中间进化支的WOX转录因子进行了同源比较分析和进化树分析,结果显示了泰来草与豆科和毛茛目莲科植物的亲缘关系较为接近,这可能暗示了泰来草在水生植物和陆生植物之间存在演化关系。鉴于泰来草是一种重要的潮间带植物,对于平衡海洋生态环境较为重要,深入研究泰来草WOX转录因子家族基因有助于我们进一步认识泰来草在进化中的关系,以及为针对性地改进泰来草的人工繁育提供理论依据。     

海湾扇贝(Argopecten irradians)金属硫蛋白基因的克隆与分析

金属硫蛋白是一种普遍存在于生物体内的低分子量、半胱氨酸含量丰富、易于被外界刺激诱导的金属结合蛋白。采用表达序列标签法,结合cDNA末端快速扩增技术,首次获得了海湾扇贝金属硫蛋白(AiMT)的全长cDNA序列。该序列全长787bp,5′UTR(UntranslatedRegion)为79bp,3′UTR为270bp,开放阅读框(OpenReadingFrame,ORF)长度为438bp,可编码145个氨基酸。在其编码的氨基酸序列中半胱氨酸含量丰富,甘氨酸含量也较高,芳香族氨基酸含量低,不含组氨酸,存在有无脊椎动物和软体动物金属硫蛋白的特征序列CKCXXX-CXCX,C-末端的氨基酸序列也符合软体动物金属硫蛋白标签序列C-x-C-x(3)-C-T-G-x(3)-C-x-C-x(3)-C-x-C-K。序列特征分析表明,该序列具备金属硫蛋白的典型特征,是金属硫蛋白家族的成员。     

吡啶硫酮类防污剂对华美盘管虫早期不同发育阶段的毒性效应研究

以中国南海常见的多毛类——华美盘管虫(Hydroides elegans)作为受试生物,分别研究了吡啶硫酮铜和吡啶硫酮锌对早期不同发育阶段的华美盘管虫的急性毒理效应。发现暴露于吡啶硫酮铜的华美盘管虫精子和卵子的受精半数抑制浓度(IC50)分别为19.49μg/L和88.44μg/L,担轮幼虫24 h半数致死浓度(24h-LC50)和48 h半数致死浓度(48h-LC50)分别为7.35μg/L和5.00μg/L,后担轮幼虫24h-LC50和48h-LC50分别为8.57μg/L和5.87μg/L;暴露于吡啶硫酮锌的华美盘管虫精子和卵子的受精IC50分别为36.74μg/L和159.59μg/L,担轮幼虫24 h-LC50和48 h-LC50分别为8.57μg/L和6.67μg/L,后担轮幼虫24 h-LC50和48 h-LC50分别为12.03μg/L和8.07μg/L。表明华美盘管虫早期发育的不同阶段对吡啶硫酮铜和吡啶硫酮锌的敏感性表现出一定差异,与配子受精率和后担轮幼虫的毒性反应相比,担轮幼虫对吡啶硫酮铜和吡啶硫酮锌的毒性表现出较高的敏感性;而且,对吡啶硫酮铜的敏感性普遍高于吡啶硫酮锌。     

刺参组蛋白脱乙酰基转移酶基因克隆及其在夏眠期间表达特征的研究

刺参(Apostichopus japonicus)利用夏眠的习性来应对夏季的高温胁迫,长期的代谢减退和基因转录抑制是刺参夏眠调控过程中的关键策略。本研究克隆分析了刺参体内关键组蛋白脱乙酰基转移酶(HDACs)的基因全长及结构特征,测定了该家族成员(HDAC1,HDAC3和HDAC4)在夏眠期间的基因表达模式。研究表明:刺参HDAC3和HDAC4与紫海胆(Strongylocehtrotus purpturatus)相关基因的同源性最高,分属HDACs家族的Ⅰ型和Ⅱ型。定量表达分析表明,刺参不同组织中同属Ⅰ型的HDAC1和HDAC3基因在刺参夏眠不同阶段的表达均无显著差异;而属于Ⅱ型的HDAC4基因在深度夏眠阶段表达量显著上调。研究结果表明,II型HDACs在刺参夏眠基因转录抑制中具有潜在的特殊调节作用。     

石鲽卵巢雌二醇及其受体和睾酮受体免疫组织化学研究

细胞核的雌激素受体(ER)是参与调节脊椎动物发育和繁殖的转录因子,哺乳动物具有两种类型的ER(ER-α和ER-β),它们一旦与配体结合就能够形成二聚体,和其他转录激活因子相互作用,参与靶基因调节[1].目前,在鱼类中发现3种ER类型,即ER-α,ER-β和ER-γ[2~4],这说明鱼类ER生理功能比高等动物复杂,但对每种ER的功能研究较少.雄激素在脊椎动物(包括鱼类)的性别分化和性腺发育过程中起着十分重要的作用,一般认为这种作用是通过雄激素受体(AR)介导的[5].AR属于配体活性转录因子,是核受体家族的一员[6].     

Tissue-specific changes in OGG1 and SOD mRNA expression caused by NaOCl exposure in black seabream (<Emphasis Type="Italic">Acanthopagrus schlegelii</Emphasis>)

The DNA-damage defense mechanism was studied in black seabreams after oxidative stress caused by exposure to sodium hypochlorite (NaOCl). Liver, muscle, and brain tissues were obtained after different NaOCl-exposure times (0, 24, 48, 72, and 96 h) and concentrations (0.5, 1, 1.5, 2, and 3 mg/L), after which oxoguanine glycosylase (OGG1) and superoxide dismutase (SOD) mRNA-expression levels were analyzed. At all NaOCl concentrations tested, liver OGG1 expression increased to a maximum in a time-dependent manner after NaOCl exposure and then decreased. In muscles, OGG1 expression increased over time following exposure to a low concentration of NaOCl (0.5, 1, and 1.5 mg/L), whereas it showed a mixed pattern (both increases and decreases observed) in the high-concentration groups (2 and 3 mg/L). SOD mRNA expression increased over time, both in the liver and muscles. In the brain, both OGG1 and SOD mRNA expression levels were highest after exposure to the lowest NaOCl concentration (0.5 mg/L), whereas basal levels were maintained over time at higher concentrations. These results indicate that OGG1 and SOD provide resistance to oxidative stress in black seabreams. In addition, continuous exposure to oxidative stress can suppress enzyme expression, suggesting a risk for long-term exposure to NaOCl.     

单环刺螠硫醌氧化还原酶间接竞争ELISA检测方法的建立

硫醌氧化还原酶(Sulfide:quinone oxidoreductase,SQR),是线粒体硫化物代谢的关键酶。本研究以生活在潮间带下区及潮下带中的底栖生物—单环刺螠SQR重组蛋白为材料,建立了单环刺螠SQR间接竞争ELISA检测方法,为定量分析SQR蛋白水平表达奠定了基础。将SQR重组蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,检测效价高达1:64 000。采用免疫印迹实验,将该抗体与重组蛋白和体壁总蛋白杂交,均得到了单一的条带,表明该抗体特异性好。优化SQR间接竞争ELISA检测条件,得出最佳的抗原包被浓度为250ng/mL,一抗浓度为1∶20 000,二抗浓度为1∶12 000,此条件下建立的标准曲线检测范围为2.5～1 000ng/mL。精确度检测结果显示,批内差异在0.42%～7.27%、批间差异在2.58%～7.78%范围内,表明该条件下精确度具有良好的准确性和重复性。以上结果表明,已成功建立单环刺螠SQR间接竞争ELISA检测方法。     

单环刺螠engrailed和hedgehog基因在体壁中的表达特征

本文采用Masson染色技术,确定了单环刺螠体壁的组织排列特征,由外向内依次为假复层柱状上皮、外环肌层、中纵肌层、内环肌层,各组织之间由发达的结缔组织连接。采用原位杂交和免疫组织化学技术,确定单环刺螠engrailed和hedgehog基因的mRNA及蛋白均定位于体壁的结缔组织中,尤以外环肌层两侧的结缔组织中阳性信号更明显。探讨了两个基因在单环刺螠体壁功能维持中的潜在作用。     

宽体沙鳅(Botia reevesae)热休克蛋白70 基因的克隆及表达分析

为深入分析热休克蛋白响应胁迫的分子机制,实验以宽体沙鳅(Botia reevesae)为研究对象,利用同源克隆和cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE) 技术克隆得到宽体沙鳅热休克蛋白70(BR-HSP70) 的cDNA 全长。结果发现,BR-SP70 cDNA全长为2,371bp,包含1,947 bp的开放阅读框(opening reading frame,ORF),102 bp 5’-非编码区(untranslated region,UTR)和322 bp 3’-UTR等。通过序列同源性比对发现,BR-HSP70 cDNA与团头鲂(Megalobrama amblycephala)和猪(Sus scrofa)的同源性分别为98%及83%,且ORF编码的649个氨基酸中含有HSP70家族的家族信号标签、N-糖基化位点及EEVD等能位点等保守序列。上述结果表明,本研究所获的基因为宽体沙鳅 HSP70基因。实时荧光定量PCR 分析发现,氨氮胁迫和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)侵染均会显著上调宽体沙鳅鳃、肝脏及肾脏HSP70 mRNA的表达,表明HSP70基因在宽体沙鳅应对环境胁迫中发挥了重要的抗应激作用。     

The simultaneous immunological detection of four stress-70 protein isoforms in Mytilus edulis

Organisms exposed to adverse environmental conditions exhibit a stress-70 protein response which is highly conserved from bacteria to man. Immunological analysis of the stress-70 response in mussels is of interest for its potential use in marine biomonitoring. We have analysed the gill tissues of Mytilus edulis individuals for changes in stress-70 complement after exposure to 48 h of temperature stress. Using a commercially available monoclonal antibody raised against human hsp70 and epitope mapped to a conserved ATP binding region, the authors were able to detect by western analysis constitutively-expressed 72kDa and 78kDa isoforms in control animals acclimated at normal temperatures. After 48 h of heat stress, induction of a 70kDa protein was clearly seen along with an increase in the level of the 72kDa protein. Western analysis using two-dimensional gel electrophoresis indicated that the antibody recognised four stress-70 isoforms (70, 72, 72 and 78kDa). This simultaneous detection of four members of the stress-70 family will permit studies on the differential regulation of each of the four members of the multigene family in response to a variety of environmental Stressors.     

久效磷对单环刺螠体内几种酶活性影响的初步研究

运用冰冻切片技术和酶组织化学的方法研究了长期暴露于不同质量浓度久效磷(0,50,100,150ng/L)下的单环刺螠(Urechisunicinctus)体内的乙酰胆碱酯酶(AChE)、细胞色素C氧化酶(CCO)、碱性磷酸酶(AKP)的活性变化。实验表明,AChE在单环刺螠的体壁上呈现出较强的酶活性,活性位点处为红棕色的颗粒沉淀、并随久效磷胁迫浓度的提高显色越来越深;消化道切片上基本上没有AChE的活性。CCO在单环刺螠的体壁及肠道上都呈现出较强的酶活性,活性位点显示为棕色;肠道上,不同质量浓度组由低到高其CCO活性位点依次增多、显色也依次加深。低质量浓度久效磷(<150ng/L)胁迫对单环刺螠体内的AKP活性没有明显的影响。     

栉孔扇贝BI-1基因的克隆与表达分析

本研究采用RT-PCR和RACE技术首次获得了栉孔扇贝(Chlamys farreri)BI-1基因(Cf BI-1)c DNA全长序列,长度957bp,5′和3′非编码区长度分别为48bp和195bp,开放阅读框为714bp,预测编码一个含有237个氨基酸的蛋白质,分子量为27k Da;结构预测显示,Cf BI-1蛋白包含6个跨膜结构域。同源和分子进化聚类分析显示,Cf BI-1蛋白序列与其他一些物种中的BI-1蛋白序列相似性很高,表明BI-1具有很高的保守性。通过荧光定量PCR的方法检测了Cf BI-1 m RNA在栉孔扇贝正常组织中和在干露、脂多糖以及扇贝急性病毒性坏死症病毒刺激之后的表达水平的变化。结果表明,Cf BI-1在栉孔扇贝各组织中广泛分布,其中闭壳肌中的表达量最高,血淋巴中的表达量最低。在干露和病毒刺激以后,Cf BI-1基因表达水平较对照组都有显著上调(P0.05),表明Cf BI-1基因可能参与了干露刺激和急性病毒性坏死症病毒感染后的细胞应激响应及其诱导的细胞凋亡过程。综合上述分析,我们认为Cf BI-1基因在栉孔扇贝细胞凋亡调控过程中可能起到重要作用,可为栉孔扇贝凋亡相关基础研究提供参考。     

菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)金属硫蛋白基因克隆及Cd~(2+)胁迫下的表达分析

金属硫蛋白(Metallothionein,MT)是一类富含半胱氨酸的小分子蛋白质,参与机体重金属解毒和金属元素代谢等生理过程。本研究采用RACE技术,克隆获得了菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)金属硫蛋白(RpMT)的全长cDNA序列。RpMT的cDNA全长为570bp,编码75个氨基酸,包含15个MT所特有的Cys-Xn-Cys结构。采用实时荧光定量PCR技术,分析了两种壳色菲律宾蛤仔(白蛤和斑马蛤)RpMT基因在Cd2+暴露后的表达变化。结果发现:Cd2+急性和亚慢性暴露均可导致两种壳色蛤仔消化腺和鳃组织RpMT基因表达量的显著上调;暴露后两种壳色蛤仔鳃组织RpMT基因表达量的增加幅度均高于消化腺组织,且以白蛤鳃组织基因表达水平的上调幅度较高。上述结果表明,RpMT可能在菲律宾蛤仔抵御Cd2+胁迫过程中发挥了重要作用。     

温度和盐度对短节硬毛藻(Chaetomorpha brachygona Harvey)生长发育的影响研究

利用双因素实验和单藻培养等方法,对采自广东南澳岛的短节硬毛藻(Chaetomorpha brachygona Harvey)进行研究,在不同温度和盐度条件下,对该硬毛藻的生长、活力以及形态进行了观察与测定。结果表明,温度和盐度对短节硬毛藻的生长均有一定影响,当温度为20°C时,藻体培养第3、6和12天活力分别为0.70—0.75Y、0.60—0.70Y和0.55—0.65Y,培养12天时藻体有生殖细胞形成,此温度有利于藻体维持活力;温度为25—30°C时,培养第3天时会大量形成生殖细胞;在盐度10、20、40和50时,藻体的生长与温度相关,即30°C25°C20°C;在盐度20—30时,藻体长度最大达4.55 cm;在盐度10—30时,更有利于藻体生长,整体趋势为2030104050。因此,实验条件下,温度25—30°C、盐度10—30更利于短节硬毛藻的生长和形成生殖细胞。本实验表明,短节硬毛藻为暖水、广盐性种,有可能在我国南方海区大量生长并扩散,具有引发绿潮的潜力。     

The correlation between bioaccumulation and pattern of stress-related genes expression of black sea bream (<Emphasis Type="Italic">Acanthopagrus schlegeli</Emphasis>) by cadmium exposure

In order to correlate the expression of detoxifying enzyme genes and Cd accumulation in black sea bream, we analyzed four tissues (brain, gills, liver, and muscle) from black sea breams that were exposed to four different concentrations of Cd (0, 2, 13, and 25 mg/L) for various durations (0, 24, 48, 72, and 96 h). The highest level of Cd was accumulated in the liver, followed by the gills, brain, and muscle. The accumulation of Cd was significantly correlated with the duration of exposure and the concentration in brain, gill, and liver tissue, but not in muscle tissue, and the rate of accumulation increased with Cd concentration. The expression of metallothionein II (MT II) mRNA exhibited a similar pattern as Cd accumulation, especially in that the expression of MT II mRNA decreased in muscle tissue with increases in exposure duration. In contrast, the expression of cytochrome P450 1A (CYP1A) mRNA was highest in the liver, followed by brain, muscle, and gill tissues, and in gills and muscle tissue of Cd-exposed fish, the expression of CYP1A mRNA fell below that of the control fish. Overall, the liver of black sea bream was the most sensitive to Cd exposure, and the expression of MT II mRNA was 200-fold greater than the control fish. These findings indicate that the detoxification mechanisms of black sea bream are influenced by both MT II and CYP1A and that the genes participate in the detoxification of different tissues.