雨生红球藻和虾青素研究述评

虾青系作为食品和饲料色素添加剂有着广阔的应用前景,单细胞绿藻雨生红球藻在特定条件下可双大量积累虾青素,有可能成为该色素的良好天然资源,受到微藻学界的重视。但目前雨生红球藻培养还处于实验室阶段,大规模生产尚存在许多问题有待解决,我国这方面的研究处于起步阶段。为此通过微机查阅１９８１￣１９９７年的国内外发表的有关文献,结合我们的实验结果,从该藻的基础生物学特性、虾青素累积的机制、养殖现状进行了综述,并     

雨生红球藻的信号物质

以单细胞雨生红球藻为材料，在室内通气培养条件下，研究了经该藻处理过的培养液内是否存在对细胞生长或转化产生影响的信号物质。对比研究结果表明，处理过的旧液明显不利于红球藻游动细胞生长，但有利于不动细胞增加。预显着旧液中可能存在着降低游动细胞生长、同时还促使游动细胞向不动细胞转化的信号物质。旧液中该信号物质的多少与原来处理旧液的藻细胞密度有密切关系，密度越大信号物质越多，对细胞生长和转化的作用也越强。     

雨生红球藻光合和呼吸速率研究

于１９９４年在青岛以单细胞雨生红球藻为实验材料,利用ＭＣＭ改良配方制作培养洲,采用测溶解氧的方法,进行了光合和呼吸速率测定。结果表明,雨生红球藻光合速率、呼吸速率不仅与温度、光照强度有密切关系,同时还与其生活史中不同发育阶段有关。１７℃、２５℃、３３℃时,雨生红球藻游动细胞光饱和点光强度分别为２６０μＥ／（ｍ＾２．ｓ）、３２０μＥ／（ｍ＾２．ｓ）、３２０μＥ／（ｍ＾２．ｓ）左右,光补偿点光强分别为     

利用雨生红球藻生产虾青素的研究进展

作为天然虾青素的最佳生物来源，雨生红球藻已成为近年来国内外微藻研究的热点之一．本文综述了国内外雨生红球藻培养及虾青素积累的研究进展，介绍了国外天然虾青素商业生产的现状，并对现存的主要问题和发展方向做出阐述，以期推动国内利用雨生红球藻生产虾青素的商业化进程。     

雨生红球藻脂肪酸组成和含量的气相色谱分析

以正十九碳酸(C19：0)为内标,用HCI-CH3OH溶液提酯化雨生红球藻后进行毛细管气相色谱分析。通过正交实验确定抽提和酯化雨生红球藻脂肪酸的最佳酯化酸度、超声破碎时间和水浴时间。该法对雨生红球藻游动细胞脂肪酸含量测定的相对偏差为0．4％～9．5％;对雨生红球藻孢子为3．0％～11．8％。仪器的检测限为0．942μg。结果表明,雨生红球藻绿色游动细胞的饱和脂肪酸组分主要是C16：0,含量为2．22％;不饱和脂肪酸主要有C16：1,C18：2,C18：1和C18：3,含量在0.764％～3．28％。雨生红球藻孢子中的饱和脂肪酸主要有C16：0和C18：0,含量分别为4．34％和0．477％;不饱和脂肪酸主要为C16：1,C18：2,C18：1和C18：3;含量在0．901％～8．20％。     

雨生红球藻cDNA表达文库的构建与初步分析

为了筛选雨生红球藻虾青素合成过程中的关键酶基因的反式调节因子基因,以雨生红球藻的绿细胞为材料,提取了高质量的总RNA,并分离纯化了mRNA,经过反转录后的得到cDNA,构建了以λ-ZAPExpress为载体的表达型cDNA文库。经检测,所构建的文库的滴度为5.1×105,重组率为100%。用PCR方法对文库的质量进行了鉴定,文库的平均插入片断的大小为1.7kb。雨生红球藻cDNA表达文库的构建为研究虾青素的代谢工程奠定了基础。     

雨生红球藻紫外诱变及抗铵品系筛选

经紫外诱变,筛选出在碳酸氢铵浓度为400 mg/L条件下可以生存的突变株。通过培养基中氮、磷、铁、温度、光照及pH值对雨生红球藻诱变株生长的影响进行比较,对以上3种营养盐及3种环境因子分别进行三因素三水平正交实验,以优化培养条件。进而对雨生红球藻野生型及诱变株的生长状况及色素含量进行比较。实验结果表明,雨生红球藻抗铵品系在培养基中NaNO30.1 g/L,KH2PO40.01 g/L,FeCl3.6H2O 1.0 mg/L,在pH值为8.0,光照强度100μmol.m-2.s-1,温度为18℃的培养条件下,雨生红球藻的生物量得到有效提高。     

雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)基因工程选择试剂的筛选

采用细胞计数法，研究了重要经济微藻——雨生红球藻对10种基因工程常用选择试剂的敏感性。结果表明，雨生红球藻对除草剂草丁膦和抗生素Zeocin比较敏感，50μg／ml的草丁膦和25μg／ml的Zeocin可明显地抑制雨生红球藻生长，尤其是50μg／ml的草丁膦能导致细胞两周内全部死亡；高浓度的卡那霉素和硫酸链霉素也可抑制雨生红球藻的生长；雨生红球藻对包括氯霉素和G418在内的其他6种试剂不敏感，即使处理浓度高达1000μg／ml。本文结果提示草丁膦可能是雨生红球藻基因工程适宜的选择试剂，其相应的抗性基因bar可能成为雨生红球藻遗传转化的选择标记基因。     

雨生红球藻保藏方法的研究

用继代保藏法(液体保藏和固-液双相保藏)和固定化保藏法保藏雨生红球藻(Haemato-coccus pluvialis),对保藏4个月后雨生红球藻存活率、相对生长速率常数和叶绿素a的含量进行了探讨。研究结果表明:雨生红球藻保藏后,其存活率、相对生长速率常数和叶绿素a的含量由高到低依次为:液体保藏、固-液双相保藏和固定化保藏。液体保藏最高存活率为93.84%,相对生长速率常数为0.4648d-1,叶绿素a的含量下降11.91%。实验结果证明,固定化保藏法较适合菌种作较长时期的保藏。     

不同碳氮浓度对雨生红球藻生长及虾青素累积的影响

研究了不同二氧化碳浓度和硝酸钾浓度对雨生红球藻生长及虾青素累积的影响。结果表明,较高浓度的CO2(600×10-6)能够显著促进雨生红球藻的生长、光合作用的进行和虾青素的累积。红球藻单个细胞内的虾青素含量随着培养液中硝酸钾浓度的降低而增加,绿色游动藻种和绿色不动藻种培养12 d后获得的最大虾青素值分别为10.93 pg/个和12.64 pg/个。连续通气是促进雨生红球藻生长及虾青素累积的一种有效碳源提供方式。     

兼养对雨生红球藻细胞生长的促进作用及藻株差异性

结合叶绿素荧光技术,对比研究了不同雨生红球藻藻株在兼养(光照+乙酸钠)培养过程中细胞生长和光合作用的共性与差异性反应。结果表明:兼养明显提高红球藻细胞密度和比生长速率;乙酸钠不仅为红球藻提供异养的有机碳源,而且还明显导致藻细胞光自养的光合综合性能指数发生改变,兼养对细胞生长促进作用的贡献在前期主要来自于其中的异养部分,而在后期却明显来自于自养部分;兼养对细胞生长的促进作用在藻株之间存在一定差异,不同藻株对乙酸钠的适应能力和最适质量浓度也存在明显差异,藻株H0可适应的乙酸钠质量浓度较高,而藻株H6对乙酸钠需求和适应性相对较低。上述结果意味着规模化培养红球藻过程中,针对不同藻株采用适宜乙酸钠兼养方式可有效缩短培养周期,提高生产效率。     

温度对雨生红球藻叶绿素荧光特性及虾青素含量的影响

研究了不同温度(5～35℃)对雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)叶绿素荧光特性及虾青素含量的影响.测定的主要参数有:PSII的最大光能转化效率(Fv/Fm)、PSII的潜在活性(Fv/Fo)、PSII的实际光能转化效率(ΦPSⅡ)、光合电子传递效率(ETR)、细胞密度、叶绿素相对含量以及虾青素含量.单因子方差分析结果表明:在整个培养周期中,温度对雨生红球藻各叶绿素荧光参数、叶绿素相对含量、细胞密度以及虾青素含量均有显著影响(P<0.05).多重比较结果表明,在本实验条件下,雨生红球藻的最适生长温度是20℃,其单位体积虾青素含量以20℃处理组为最高,而单个细胞中的虾青素含量则以5℃和30℃为最高.相关性分析结果表明:培养天数为3～10天时,叶绿素相对含量与细胞密度均成显著正相关关系.本文还初步探讨了叶绿素荧光技术在筛选耐高温或耐低温微藻品系中的应用.     

亚硝基肌(NTG)对雨生红球藻的诱变效应

用浓度分别为0，0．5，1，1．5，2，2．5，3，3．5g／L的亚硝基胍(NTG)处理雨生红球藻(Haematococcus Pluvialis)，处理后的藻细胞分别置于100mL三角烧瓶培养，3d后用细胞计数测定抑制率。结果表明，NTG浓度为2．5g／L时生长K值最大，为0．389；藻液的细胞干质量最大．为0．711g／L；虾青素含量也最多，为1．86975 mg／L，之后随着浓度的增加反而下降。     

雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶基因克隆、分析及叶绿体表达载体构建

β-胡萝卜素酮化酶(BKT)是雨生红球藻虾青素合成途径中的关键酶。根据GenBank中所收录的雨生红球藻BKT的cDNA序列设计特异性引物,以高光照处理的雨生红球藻细胞的总RNA为模板,采用RT-PCR的方法克隆出了β-胡萝卜素酮化酶基因(bkt)。序列测定结果表明,bkt全长960bp编码320个氨基酸。克隆的bkt序列与GenBank收录的BKT的cDNA(AY603347)序列只相差一个碱基。并对其编码的氨基酸进行了二级结构的预测和疏水性分析。同时将所克隆的bkt构建入衣藻叶绿体表达载体p64Dbkt,为基因的进一步表达研究及探索其作用机制奠定了基础。     

雨生红球藻虾青素积累机制的研究进展

虾青素(astaxanthin)是一种具有极强抗氧化活性的类胡萝卜素,超强的抗氧化活性赋予了虾青素突出的生理功能,如提高动物免疫力、抑制肿瘤、清除自由基和活性氧等。虾青素具有广泛的应用价值,不仅可以用作水产养殖的饵料添加剂、人的食品添加剂,在药品、化妆品和高级营养保健品等     

雨生红球藻八氢番茄红素脱氢酶pds基因上游序列的分离和分析

在某些蓝藻、绿藻和高等植物中,八氢番茄红素脱氢酶是β-胡萝卜素合成过程中的一个关键酶之一,应用巢式PCR方法从雨生红球藻中克隆了八氢番茄红素脱氢酶基因约1kb的5’上游序列。通过生物信息学方法进行序列分析,发现pds基因上游序列中包含了一些可能的顺式元件,如ABRE调控元件、C-repeat/DRE调控元件等。同时,构建了由pds-启动子控制报告基因的重组载体,并转化到雨生红球藻细胞中,进行了报告基因瞬间表达的检测。结果表明,克隆的pds启动子区域具有启动子活性,可以驱使报告基因进行瞬间表达。     

藻际可培养细菌对雨生红球藻生长和虾青素积累的影响

为探究雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)藻际可培养细菌多样性及可培养细菌对雨生红球藻生长和虾青素积累的影响,本实验采用培养分离法,在乙酸钠兼养条件下,共分离到8株雨生红球藻藻际细菌,通过16S rDNA测序鉴定,并在NCBI网站比较序列发现,编号为DBQ、HS、BTH、DBB、XBL、HB、FH、JH的菌株分别与Pseudomonas sp.、Methylobacterium sp.、Chryseobacterium sp.、Bacillus sp.、Paracoccus sp.、Planctopirus hydrillae、Rhodobacter vinaykumarii、Brevundimonas vesicularis的16S rDNA序列具有最高的相似性。分别将8株细菌与通过抗生素处理获得的纯种雨生红球藻共培养,测定了8株藻际细菌对雨生红球藻细胞密度、藻液pH、叶绿素及虾青素含量的影响。实验发现,HS处理组在绿色阶段培养第9天获得最高细胞密度,为3.65×10~5cells/mL,且显著高于对照组;DBB处理组虽然能够促进藻细胞密度增加,但与对照组并无显著差异;DBQ处理组藻细胞密度显著低于对照组及其他处理组。第1～7天,藻液叶绿素浓度的变化与藻细胞密度变化趋势有一定相似性,绿色阶段后期,叶绿素浓度呈现下降趋势,也说明藻细胞内部叶绿素向其他色素转变,同时标志着绿色阶段的结束。绿色阶段培养过程中,藻液pH变化幅度较大,由初始值7.0左右上升到9.30左右,但是培养后期处理组与对照组藻液pH并无显著差异。在测定藻液虾青素含量时,仅HS处理组虾青素含量略高于对照组,但并无显著差异;通过计算单个藻细胞虾青素含量发现DBQ处理组单个藻细胞虾青素含量显著高于对照组。     

温度、光照强度和pH对雨生红球藻光合作用和生长速率的影响

采用测定净光合放氧速率的方法研究了温度、光照强度和pH对 4株雨生红球藻光合作用和生长繁殖速率的影响。结果表明 ,温度、光照强度和pH对雨生红球藻的光合作用和生长速率的影响十分显著 ;4株雨生红球藻光合作用的最适温度、光饱和点和pH分别为 :Haematococcuspluvialis 2 6 :1 5℃ ,2 5 0 μmol/(m2 ·s)和pH7 0 ;Haematococcuspluvialis 3 0 :2 0℃ ,2 0 0 μmol/(m2 ·s)和pH8 0 ;Haematococcuspluvialis 3 4 :1 5℃ ,2 0 0 μmol/(m2 ·s)和pH7 0 ;Haematococ cuspluvialisWZ :1 0℃ ,1 40 μmol/(m2 ·s)和pH6 0。雨生红球藻细胞数量的增加与光照时间成正比。初步认为H pluvialis3 0、H pluvialis2 6和H pluvialisWZ是 3个有潜力适合于大规模生产的藻种。     

雨生红球藻铁型超氧化物酶基因的克隆与序列分析

利用已报道的FeSOD保守区域,设计简并引物,通过简并PCR的方法获得了雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)FeSOD(HpFeSOD)cDNA的部分序列,然后采用RACE方法分别克隆到5′端和3′端。拼接后得到HpFeSOD cDNA全长,该基因全长为1 138 bp,ORF为684 bp,编码227个氨基酸。把已经得到的HpFeSOD序列推导成氨基酸序列与一些已知物种的FeSOD氨基酸序列相比较,雨生红球藻FeSOD与杜氏藻、衣藻、团藻、石莼、颤藻的同源性为89%、83%、78%、70%和63%。分子系统学分析表明,雨生红球藻FeSOD与杜氏藻FeSOD聚在一起,介于真菌与高等植物之间并且真核微藻FeSOD与高等植物的同源性更高,推测其在进化上与高等植物的亲源关系更近。