中国鲎N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性必需基团的研究

为了探讨中国鲎N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52,NAGase)活性的必需基团,采用了化学修饰法进行研究,分别以甲醛、乙酸酐、三硝基苯磺酸、对氯汞苯甲酸、苯甲基磺酰氟、二巯基苏糖醇、乙酰丙酮、溴代乙酸、碘代乙酸、N-溴代琥珀酰亚胺等10种修饰剂,在特定环境中对中国鲎NAGase进行化学修饰。结果表明:中国鲎NAGase中赖氨酸的ε-氨基、组氨酸的咪唑基、色氨酸的吲哚基和丝氨酸的羟基经修饰后,酶活力几近丧失,这些氨基酸基团为酶活性的必需基团,且可能处于酶的活性部位;半胱氨酸的巯基经修饰后不完全失活,说明半胱氨酸的巯基是NAGase催化活性所必需的,但可能不处于酶的活性部位;酶的二硫键被修饰后,酶活力明显下降,说明二硫键在维系NAGase的三维空间构象中起重要作用;而精氨酸的胍基经修饰后酶的活性基本不变,因此,精氨酸不是NAGase的必需基团。     

中国鲎内脏N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

以中国鲎(Tachypleus tridentatus)内脏为材料,分别通过30%和80%饱和度(NH_4)_2SO_4沉淀分级分离、葡聚糖凝胶柱Sephadex G-200层析、以及离子交换柱DEAE-32层析,从而获得N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52,NAGase),经PAGE检定达到电泳纯,酶的比活力为505.21 U/mg。SDS-PAGE显示一谱带,测得该酶蛋白亚基分子量为121.5kDa,等电聚焦电泳法测得酶的等电点pI为6.01。以pNP-β-D-GlcNAc为底物,研究NAGase催化反应的动力学参数。结果表明:中国鲎NAGase的最适pH、最适温度、K_m和V_(max)分别为5.4和55℃、0.421 mmol/L和13.158μmol/L·min~(-1);酶在pH=4.5~7.0范围内较稳定,在20~50℃之间具有较好的热稳定性。酶在276nm波长处有紫外吸收峰,在232.2nm波长的内源荧光激发下,酶内源荧光发射光谱峰在330.9nm波长处。Na~+,K~+和Li~+对NAGase活力没有影响,Ca~(2+)、Ba~(2+)和Co~(2+)对NAGase有不同程度的激活作用,Co~(2+)对NAGase的激活作用较大,5mmol/L Co~(2+)能使NAGase活力提高41.67%;Mg~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)、Mn~(2+)、Fe~(3+)、Al~(3+)、Pb~(2+)、Ag~+、Cd~(2+)和Hg~(2+)等10种金属离子对NAGase活力有不同程度的抑制作用,5mmol/L Cd~(2+)可使酶活力丧失85.60%,而Hg~(2+)对酶的抑制作用最强,0.1mmol/L Hg~(2+)可使酶活力丧失90.10%。EDTA对酶活力没有影响,推断中国鲎NAGase属于非金属酶类。     

盐度对中国鲎幼鲎生长、蜕壳、Na+-K+-ATP酶活性、免疫指标和抗氧化能力的影响

人工增殖放流是恢复鲎资源最有效、最迅速的方法, 而了解和掌握环境因子对中国鲎(Tachypleus tridentatus)幼鲎生长状况的影响规律, 进而选择适宜放流的时间和海区, 是保证人工放流得以成功的关键。本文在实验室条件下, 研究了不同盐度(5‰、10‰、15‰、20‰、25‰、30‰、35‰、40‰)对中国鲎幼鲎成活率、蜕壳率、蜕壳增重率、Na⁺-K⁺-ATP酶活性、免疫酶活性、抗氧化酶活性等的影响, 探讨了不同盐度水平下中国鲎幼鲎生长、蜕壳、渗透调节能力、机体免疫力和抗氧化能力等的变化。养殖试验持续56d, 结果表明: 不同盐度对中国鲎幼鲎的成活率、蜕壳率、二龄幼鲎均重及蜕壳增重率均有显著影响(P<0.05), 且均随盐度升高呈先升高后降低的趋势; 蜕壳率和蜕壳增重率与盐度的回归分析均表明, 中国鲎幼鲎蜕壳与生长的最适盐度分别为24.10‰和24.94‰; 一龄和二龄幼鲎的Na⁺-K⁺-ATP酶活性均随盐度的升高呈先显著升高后显著降低趋势(P<0.05); 35‰和40‰盐度试验组一龄幼鲎的酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)活性显著高于其他试验组, 而5‰盐度试验组一龄幼鲎的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)活性显著低于25‰试验组(P<0.05) ; 盐度对二龄幼鲎的ACP、AKP和溶菌酶(lysozyme, LZM)活性均没有显著影响(P>0.05); 35‰和40‰试验组一龄幼鲎的过氧化氢酶(catalase, CAT)活性显著高于盐度较低试验组(P<0.05); 二龄幼鲎的谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase)活性随着盐度的升高而升高, 盐度10‰试验组显著低于30‰和40‰试验组(P<0.05)。研究结果显示盐度对中国鲎幼鲎生长、蜕壳、Na⁺-K⁺-ATP酶活性、免疫指标和抗氧化能力均有显著影响, 蜕壳最适宜的盐度在24‰~25‰左右, 盐度过高或过低都将引起幼鲎生长率和成活率降低, 渗透调节能力、免疫力和抗氧化力显著下降。     

不同养殖期的凡纳滨对虾外壳膜NAGase基本性质比较

以不同生长期的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）的外壳为材料，分离提取外壳膜N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（EC3．2．1．52，NAGase），测定分析不同生长期的外壳膜NAGase的酶比活力及其性质的变化．结果表明：不同生长期的酶活力、最适温度、催化反应的动力学参数（Km、vm）、活化能等均存在差异．不同生长期酶的最适pH均为5．5．不同生长期的对虾外壳膜NAGase对Cu^2＋、Zn^2＋和Hg^2＋的敏感性也不同．Cu^2＋对养殖8周对虾外壳膜NAGase的激活作用最为显著，可以使酶活力提高到400％．Zn^2＋对不同生长期的酶活力均有抑制作用，但对成体对虾酶抑制作用最为显著，可以使酶活力下降80％．Hg^2＋对各个生长期的酶活力影响效果也不一样，当浓度为0．1mmol／dm^3时，仅对养殖6、8、9周的对虾的酶有激活作用，当Hg“浓度为1．0mmol／dm^3时，五个生长期的虾皮NAGase活力均受到不同程度抑制．     

中国鲎幼体阶段(黄皮鲎)饵料的初步研究

用杂鱼、星虫、牡蛎、乌贼、虾进行中国鲎幼体饵料种类、粒度以及白天和夜间摄食量差异等试验。结果表明：中国鲎幼体阶段(黄皮鲎)对乌贼的相对摄食量最大(2.1％)，而对小杂鱼的相对摄食量最少(0．2％)。中国鲎幼体阶段(黄皮鲎)均对粒度为0.3～0．5cm的乌贼相对摄食量最大(2．0％)，对粒度为2cm的乌贼相对摄食量最小(0．1％)。中国鲎幼体阶段(黄皮鲎)夜晚的摄食量明显大于白天：平均体重为147．4g组的昼夜相对摄食量的差异最大(白天为0．8％，夜间为1．7％)，平均体重为258．7g组的差异最小(白天为ll％，夜间为l4％)。     

亚洲海域鲎的种类和分布

审核有关亚洲海域鲎种类和分布的历史文献发现,亚洲海域只有圆尾鲎Carcinoscorpius rotundicauda、中国鲎Tachypleus tridentatus和南方鲎Tachypleus gigas3种鲎分布。圆尾鲎分布于中国香港、北部湾、雷州湾以南、印度尼西亚爪哇岛北岸以北、菲律宾南部以西和恒河河口印度东北部以东的海域。中国鲎分布于长江口以南的中国海域、日本濑户内海、九州岛北岸以南、印度尼西亚爪哇岛北岸以北、苏门答腊岛印度洋侧以东和苏拉威西岛以西的海域。南方鲎分布于越南西贡以南、爪哇岛北岸以北、菲律宾南部以西的太平洋海域及印度恒河印度东北部以东的印度洋海域。以前有关中国北部湾海域和香港海域有南方鲎的报道是错误的,把中国鲎的幼体及成体误当成了南方鲎。中国海域只有中国鲎和圆尾鲎2种鲎分布。中国的海南、广西、广东西部和香港(可能还包括台湾)等是圆尾鲎分布的海域。其沿岸要严禁食鲎,以防误食圆尾鲎而引起河豚毒素中毒。     

圆尾鲎(东南亚鲎)Carcinoscorpius rotundicauda在我国北部湾的发现

1984年4—6月间,笔者在进行鲎的资源调查中,在我国北部湾沿岸浅海发现了一种过去国内无人报导的圆尾鲎Carcinoscorpius rotundicauda。据有关资料记载,它是现存的三属四种(中国鲎Tachypleus trideutatus、美洲鲎Limulus polyphemus、马来亚鲎Tachypleus gigas、圆尾鲎Carcinoscorpins rotundicauda)中,个体最小的一种。这种鲎不能食用,人吃后会引起中毒乃至死亡。因此,广西沿海渔民都叫它鬼鲎仔。现将圆尾鲎的分类地位和形态特征,以及与中国鲎的不同之处记述如下:     

基于鲎试剂生产的中国鲎血液质量监测方法研究

为了研究中国鲎血液质量的监测方法,实验选择9只中国鲎检测其血液中铜含量、血细胞数量、血浆蛋白含量、血淋巴蛋白含量等指标,并进行相关性分析。结果表明,中国鲎血液中铜含量与血细胞数相关性r=0.917,与血浆蛋白含量相关性r=0.995,与血淋巴蛋白含量相关性r=0.983,均呈现极显著相关性。中国鲎血液中铜含量与血细胞数的相关关系为Y₁=6.14+0.86X(R²=0.840),与血浆蛋白含量的相关关系为Y₂=2.08+0.78X(R²=0.989),与血淋巴蛋白含量的相关关系为Y₃=1.87+0.62X(R²=0.966)。中国鲎血液中铜含量不但能够直接反映血蓝蛋白的含量,而且可以反映血细胞数、血浆蛋白含量、血淋巴蛋白含量。因此,以中国鲎血液中铜含量作为监测血液质量的指标,可以推动中国鲎可持续采血技术的发展与完善,对中国鲎的利用与保护具有重要意义。     

幼鲎发育的初步报告

一、序言 中国鲎(Tachypleus tridentus Leach)属于西太平洋沿岸的暖水性节肢动物,分布在日本南部与我国长江以南沿海各省。每年5—8月,雄鲎抱挟住雌鲎同游至近高潮线附近的沙滩上,由雌鲎掘沙成穴,产卵于穴中,然后由雄鲎排精行体外受精。鲎的受精卵借助阳光照射下沙滩的热量孵化。由于鲎卵外被覆一层不透明的卵壳,在没有特殊处理时,受精卵的卵裂阶段不能观察到,只有当卵壳破裂后,才能见到卵中的幼鲎。鲎的幼体称三叶幼虫(pr-     

维生素对凡纳滨对虾N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的效应研究

以凡纳滨对虾中提取的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase,EC 3.2.1.52)为研究对象,以对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-NAG)为底物,考察了几种养殖常用维生素对该酶活力的影响.结果表明,VB12、烟酸、核黄素等对酶活力基本上没有影响;而VB1、VB6、抗坏血酸等对该酶活力均有不同程度的抑制作用.随着抑制剂浓度增大,酶活力呈指数下降,测定导致酶活力下降50%的抑制剂浓度(IC50)分别为16.0、13.5、37.5mmol/dm3.进一步研究了VB6的抑制作用动力学,结果显示:VB6对酶的抑制作用为非竞争性可逆抑制,其对酶抑制常数(KI)为 15.2mmol/dm3.该研究对凡纳滨对虾的人工养殖具有一定的参考价值.     

鲎的卵黄发生

本文利用光学显微术和电镜显微术研究中国鲎(Tachypleus tridentatus Leach)的卵黄发生,概述了中国鲎的卵子发生并探讨卵黄粒形成的途径。中国鲎的卵子发生可划分为卵原细胞、早期卵母细胞、卵黄发生前的和卵黄发生的卵母细胞4个阶段。卵黄粒是在卵黄发生的卵母细胞中出现。5种细胞组分为:线粒体、平滑内质网膜囊、高尔基液泡、多泡小体和微吞饮泡参与了卵黄粒的形成。本文还讨论了卵黄粒的形成与细胞器的代谢之间的关系,比较了中国鲎与美洲鲎之间卵黄发生的差异。     

中华鲎(Tachypleus tridentatus)稚鲎对不同比例泥沙类型选择行为特征

中华鲎(Tachypleus tridentatus)是保障我国医疗检测安全的重要战略生物资源,国内外中华鲎行为生态学相关研究极少。在实验室内模拟砾石底(NS)、细砂(SS)、中砂(MS)、粗砂(CS)、泥(AR)、泥沙1 (AA)、泥沙2 (AB)和沙泥(SA) 8种不同比例的泥沙类型对中华鲎行为特征的影响。结果表明,稚鲎较多时间潜藏于泥沙中,较少时间裸露于泥沙表面活动(如爬行、游泳等)。稚鲎偏好在含淤泥较多的泥沙类型中潜沙,且在泥质和泥沙质类型中埋栖时间较在沙质中埋栖时间长;在裸露于泥沙表面时,稚鲎相对偏好栖息于沙质底。泥沙环境下稚鲎用于游泳的时间比例高于砾石底。在凌晨、上午、中午、下午、夜晚5个时间段中,稚鲎在夜晚和凌晨活动较活跃。通过揭示不同比例的泥沙类型底质对中华鲎稚鲎行为特征的影响,为野外增殖放流计划的设计与实施、放流适宜地点的选择以及稚鲎人工养殖环境的优化提供科学理论依据。     

鲎血淋巴中的先天性免疫系统

鲎(horseshoe crab)是一种生活在海洋中的大型底栖节肢动物,从早古生代的奥陶纪出现至今已有4亿多年的历史,是动物界具有独特进化地位的“活化石”之一。鲎隶属于节肢动物门(Arthropoda)、有螯肢亚门(Chelicerata)、肢口纲(Merostemata)、剑尾目(Xiphosurida)、鲎科(Limuroidea)。现存的鲎种类很少,     

文蛤抗癌多肽对N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶活力的影响

从文蛤体中分离纯化得到了抗癌多肽,研究该多肽对N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)活力的影响,结果显示文蛤抗癌多肽对该酶有明显的抑制作用.在本文中,我们将深入地研究其抑制作用机理和抑制效应类型,结果表明:随着文蛤多肽加入量的增大,该酶活力呈指数下降,测得导致酶活力下降50%的抑制剂浓度(IC50)为112.9 μg/cm3,该多肽对酶的抑制作用是一种可逆过程,抑制机理表现为混合型抑制类型,对游离酶(E)的抑制常数(KI)和酶-底物络合物的抑制常数(KIS)分别为77.03和697.44μg/cm3,说明文蛤抗癌多肽与游离酶的结合导致酶活力的丧失,明显的强于对酶-底物络合物的抑制效应,底物的存在对该酶被文蛤抗癌多肽抑制作用起了保护作用.     

产物及其类似物对锯缘青蟹NAGase酶活力的影响

以产物N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖(NAG)及其类似物-葡萄糖(glu)、半乳糖(gal)、果糖(fru)和蔗糖(suc)为效应物,研究它们对锯缘青蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)活力的影响及抑制作用机理.结果表明,上述效应物对酶均表现为可逆的抑制作用.NAG有较强的抑制作用,其IC50为0.011 mol/dm3.但产物类似物对该酶的抑制作用均弱于NAG.NAG对该酶的抑制作用机理表现为反竞争性抑制,抑制常数KIS为4.37×10-3mol/dm3;glu、gal、suc则表现为非竞争性抑制,抑制常数KI分别为0.125、0.394、0.474 mol/dm3;而fru则表现为竞争性抑制,抑制常数KI为0.455mol/dm3.     

中国鲎(Tachypleus tridentatus)微卫星标记筛选及种群遗传多样性和遗传结构分析

采用FIASCO方法构建了中国鲎(Tachypleus tridentatus)(CA)_n微卫星富集文库,对214个阳性克隆进行测序,筛选获得60条含有微卫星的序列,其中可设计引物的序列共38条。38对微卫星引物在37个中国鲎个体中PCR检测发现,只有9个位点具有多态性,其等位基因数为5—14个,每个位点平均具有8.1个等位基因。9个位点之间不存在连锁。利用该9个具有多态性微卫星标记分析了中国沿海9个中国鲎地理群体的种群遗传多样性和遗传结构。结果表明:中国沿海的中国鲎种群遗传多态性水平仍较高, 9个地方群体间无遗传差异,它们之间未见显著分化,且有着较高的基因流;推测人为的迁移是造成遗传无分化的主要原因。我们建议中国鲎已绝迹的海域可从其他海域引入中国鲎个体来恢复地方群体资源。     

中国鲎在冬季的发现及观察

THEDISCOVERYANDOBSERVATIONOFTachypleustridentatus自然界现有4种鲎,分布于中国的中国鲎（Tachypleustridentatus,又叫亚洲鲎）是其中的一种,每年的4~9月,成年雌、雄鲎双双到沙滩的高潮位产卵繁殖后代。但在隆冬的元月,一般认为鲎已去深海越冬[2]。有关中国鲎的越冬,目前研究得很少,在中国从未发现过有关的报道。人类对冬季中国鲎的形态、内部结构（主要是性腺的发育）及毒理还很不清楚。作者的观察有助于了解中国鲎生殖周期的周年变化及对中国鲎的生态进行周年分析。1材料来源1．1中国鲎的发现1998年1月1日（农历1997…     

中国鲎基因组微卫星富集文库的构建及分析

本研究旨在从DNA分子水平上研究中国鲎(Tachypleus tridentatus)种群遗传多样性及种群结构等相关信息,以期为保护其野生群体种质资源提供科学依据。本研究通过生物素—磁珠富集法筛选微卫星标记,构建中国鲎基因组微卫星文库。基因组DNA经Fast Digest Tru1I酶切后,选取400 bp~1000 bp片段,用生物素标记的(GT)15、(CT)15混合探针与其杂交,杂交复合物与链霉亲和素磁珠结合,捕获含有重复序列的微卫星片段,纯化后连接PMD19-T载体克隆,构建基因组微卫星文库。从334个阳性克隆中随机选取196个片段大于400 bp的阳性克隆进行测序,共获得127个微卫星序列,其中完美型占69.3%、非完美型占11.0%、复合型占19.7%。除探针使用的GT和CT的重复序列外,还筛选到多碱基GCT、TGG、AAAC、ACAA、GATTT、TTTTA的重复序列。根据微卫星序列设计选择合成40对引物,结果显示其中3对具有较高多态性,可作为进一步评价中国鲎野生种质资源等遗传信息的有效遗传标记。     

中国鲎在我国分布之北界

中国鲎(Tachrpleus tridentatus Leach),又称三刺鲎,是目前世界五种鲎之一,产于我国及日本南部沿海。鲎有两个特殊功能:它的一对复眼具有侧抑制作用;鲎血对病毒性热原极为敏感。根据这样的机能,目前已设计出一种新的电视摄象机;有些国家竞相研制价值昂贵的专利品——鲎试剂。由此,使这种远有四亿多年生命史、默默无闻的活化石一     

中国明对虾体壁N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

为了探讨对虾N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52,NAGase)的分离纯化及其酶学性质,作者以中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)体壁为材料,通过硫酸铵沉淀分级分离、SephadexG-100柱层析和DEAE-32离子交换柱层析纯化,获得聚丙烯酰胺凝胶电泳纯的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶酶制剂,纯化酶比活力为3938.56U/mg。通过SDS-PAGE凝胶电泳,测得该酶亚基分子量为48.88 kD。酶的最适pH为6.0,最适温度为45℃;该酶在pH 6.0~9.0区域较稳定,温度稳定性范围是20~35℃,45℃下处理1 h酶活力丧失65.04%。酶水解对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷的Km为0.229 mmol/L,Vmax为5.00μmol/(L·min)。进一步研究金属离子对酶活力的影响,结果表明:Li+、Na+和Ba2+对酶没有明显影响,Mg2+、Ca2+、Mn2+、Co2+、Fe3+和Al3+对酶均有不同程度的激活作用,Cu2+、Zn2+和Pb2+对酶呈抑制作用,1.0 mmol/L Hg2+对酶呈激活作用,而10 mmol/L Hg2+使酶活力降低42.37%。