提高太平洋牡蛎三倍体诱导率的几项技术措施

本文根据1996－2000年从事牡蛎三倍体育苗与养殖技术研究的生产试验中，主要从加强亲贝蓄养，让亲贝充分成熟；卵子的离体海水促熟培育，让卵子发育同步；洗卵处理；受精卵密度的掌握；三倍体诱导参数；外部环境条件等六方面探讨了如何提高牡蛎三倍体诱导率，以满足规模化生产的需要，推动牡蛎三倍体养殖业的发展。     

海水促熟太平洋牡蛎卵子受精的细胞学观察

利用铁－苏木精染色、整体封片的方法,观察了太平洋牡蛎卵子经海水浸泡促熟后的受精过程。生发泡尚未破裂的卵子,经海水浸泡后可以发育到第一次成熟分裂中期。受精后１０～１５ｍｉｎ,放出第一极体;受精后２０～２５ｍｉｎ,放出第二极体;之后,形成雌、雄原核,两性原核以染色体联合的方式结合于纺锤体的赤道面上,准备第一次卵裂。有多精入卵现象并能形成多个原核,但不能正常卵裂。那些经浸泡后生发泡仍未破裂的卵子,将不能     

太平洋牡蛎卵子体外发育的研究

研究了太平洋牡蛎（Crassostrea gigas Thunberg)卵子体外发育的过程。解剖性腺获取的卵子大多发育至第1次减数分裂前期。在海水、氨海水中浸泡能促使生成泡破裂，促进卵子的继续发育，而且卵子在氨海水中的发育速度要快于在纯海水中的发育速度。     

香港巨牡蛎♀×太平洋牡蛎♂异源三倍体的初步研究

本文以香港巨牡蛎(Crassostrea hongkongensis)和太平洋牡蛎(C.gigas)为研究对象,进行牡蛎异源三倍体研究试验。在水温25℃条件下,香港巨牡蛎剥离卵子于海水中浸泡促熟1.5h后,与太平洋牡蛎精子受精,获得最高卵裂率为(24.40±3.79)%。受精后20min,采用盐度为10的低渗海水处理杂交受精卵25min,可获得68.65%的异源三倍体幼虫,孵化率为12.71%。异源三倍体幼虫的存活率和生长率均未表现出优势。受精后第9天,异源三倍体幼虫的存活率仅为(0.116±0.023)%,平均壳长为(103.50±0.85)(m;对照组的存活率和壳长分别为(42.17±2.74)%和(123.25±8.60)μm。幼虫在附着变态前死亡。     

紫外线诱导太平洋牡蛎雄核发育的研究

为诱导太平洋牡蛎雄核发育单倍体 ,本文研究利用紫外线诱导太平洋牡蛎雄核发育的条件。结果表明 :在强度为2 .8mW·cm-2 ·s-1的紫外线 (2 5 4nm)下分别照射 0 ,10 ,15 ,2 0 ,2 5 ,3 0 ,3 5 ,40 ,5 0 ,60 ,70和 80s后 ,照射 3 0s的卵子能够保持较高的受精率 (73 .5 % ) ;该处理组的D形幼虫发生率为 0。染色体检查结果显示此时单倍体率最高 (4 7.8% )。证明在强度为2 .8mW·cm-2 ·s-1的紫外线下照射 3 0s是获得雄核发育单倍体的适宜条件。研究还表明受精率和D形幼虫发生率随照射时间的增加而下降 ,遗传失活的卵子与正常精子受精后其胚胎发育至D形幼虫前期停止。实验中各处理组均出现非整倍体。原因可能由于紫外线对卵子染色体遗传失活的作用程度不同以及光线对DNA的修复作用。     

6-DMAP诱导太平洋牡蛎三倍体 5.孵化率和D幼畸形率与三倍体诱导率的关系

１９９６～１９９７年,在进行６－ＤＭＡＰ（６－二甲基氨基嘌呤）诱导太平洋牡蛎三倍体实验的同时,进行胚胎孵化率和Ｄ形幼虫畸形率与三倍体诱导率关系的研究。解剖法获取精卵,人工授精。三因素三水平Ｌ９（３４）正交试验、分组的实验结果表明：胚胎孵化率与三倍体诱导率间呈不显著的负相关（ｒ＝－０．０７４）,ｙ＝６４．９２５－０．０５６ｘ;Ｄ形幼虫畸形率与三倍体诱导率间呈显著的正相关（ｒ＝０．３８５,Ｐ＜０．０５）,ｙ＝１２．１３５＋０．２７２ｘ。三因素四水平Ｌ１６（４５）正交试验、分组的实验结果表明：胚胎孵化率与三倍体诱导率间呈不显著的负相关（ｒ＝－０．２１０）,ｙ＝７６．６１８－０．４７１ｘ;Ｄ形幼虫畸形率与三倍体诱导率间呈不显著的负相关（ｒ＝－０．０２２）,ｙ＝２３．１１５－０．０２９ｘ。讨论提出：在保证一定的三倍体诱导率的前提下,对获取的精卵进行离体促熟和必要的洗卵、缩短诱导持续时间,是提高胚胎孵化率和降低Ｄ形幼虫畸形率的重要措施。     

温度休克诱导长牡蛎三倍体的研究

本文采用低温２～９℃和高温３５～３９℃温度休克法、在受精后１０～２５ｍｉｎ，进行１０～２５ｍｉｎ处理，诱导牡蛎三倍体。结果表明：各处理组都有不同程度的三倍体产生，其中受精后２０ｍｉｎ开始在４～５℃下处理１５ｍｉｎ诱导三倍体效果最好，诱导率为６８×１０＾－２，幼贝三倍体率为６０．５×１０＾－２，生长速度处理组壳高明显超过对照组，而壳长生长和幼虫死亡率无明显差异。     

太平洋牡蛎雄核发育卵中核行为的细胞学观察

利用荧光显微镜观察太平洋牡蛎正常卵子与雄核发育卵子在受精过程、减数分裂和卵裂早期中的核相变化。雄核发育单倍体是将强度为2.8mW.cm-2.s-1的紫外线照射30s的卵子与正常精子受精后得到的。结果表明,尽管紫外线照射并没有影响卵子的成熟分裂及雌性、雄性原核的形成,但使它们的发生过程滞后。在第1卵裂中期,雄核发育卵子中雌性原核并不像雄性原核一样形成染色体,而是形成1个浓缩的染色质小体(DCB)。第1卵裂后期,DCB不参与核分裂。第1卵裂结束时,DCB位于2个分裂球其中之一的细胞质内或在赤道板处被分割成2部分。实验结果首次提供了太平洋牡蛎雄核发育的细胞学证据。     

温度休克诱导长牡蛎三倍体的研究

本文采用低温２～９℃和高温３５～３９℃温度休克法，在受精后１０～２５ｍｉｎ进行１０～２５ｍｉｎ处理，诱导牡蛎三倍体。结果表明：各处理组都有不同程度的三倍体产生，其中受精后２０ｍｉｎ开始在４～５℃下处理１５ｍｉｎ诱导三倍体效果最好，诱导率为６８×１０－２，幼贝三倍体率为６０．５×１０－２，生长速度处理组壳高明显超过对照组，而壳长生长和幼虫死亡率无明显差异。     

中国对虾及中华绒螯蟹多倍体诱导中6-DMAP在卵子中残留量的检测

海洋动物多倍体的诱导目前已成为海水养殖中品种改良的重要手段(楼允东，1984)。在美国，太平洋牡蛎和虹鳟的多倍体诱导已大规模应用于生产，并获得良好的经济和社会效益。我国也先后开展了鱼类(桂建芳等，1991；尤锋，1993)、中国对虾(戴继勋等，1993；相建海等，1992)、贝类(喻子牛等，1995)及中华绒螯蟹(陈立侨等，1997)等多种海洋动物多倍体诱导的研究，并取得了一些进展。6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)由于其低毒、经济和高效，目前已成为海洋动物多倍体诱导中经常使用的诱导剂，但至今，国内外尚无关于6-DMAP在卵子内的残留的报道。在环境保护和生物安全倍受关注的今天，人们非常关心多倍体诱导食物的安全性问题，本文首次利用高压液相色谱技术检测了在中国对虾和中华绒螯蟹多倍体诱导处理后，卵子和幼体内6-DMAP的残留量，并对检测结果进行了分析讨论。     

栉江珧解剖卵的体外促熟研究

本研究探讨了在不同浓度或不同处理时间下氨海水、5-羟色胺、多巴胺和维生素对栉江珧(Atrina pectinata)解剖卵的促熟作用。通过体外浸泡的方法处理栉江珧卵母细胞使其成熟,并完成人工授精。研究表明:浓度0.008%~0.014%的氨海水处理40~60min可显著提高栉江珧解剖卵的生发泡破裂率和受精率(P0.05),且胚胎的畸形率较低,栉江珧解剖卵的促熟效果最好;而5-羟色胺、多巴胺和维生素对栉江珧解剖卵的体外促熟的效果不明显。通过人工授精、早期胚胎发育观察,本研究阐明了栉江珧卵子的最佳促熟条件,得到了育苗生产所需的幼虫量,为确立栉江珧人工育苗技术提供了基础资料。     

太平洋牡蛎受精过程中的精核扩散与成熟分裂

光镜下观察了太平洋牡蛎受精过程中的原核形成和成熟分裂。受精前,卵子处于第一次成熟分裂前期（即生发泡阶段）。精子入卵后开始进行成熟分裂,过程如下：（1）生发泡破裂前精核只进行轻微增大。（2）生发泡破裂,精核迅速去致密,体积迅速增大。（3）第一次成熟分裂结束,精核扩散速度减慢,核内染色体致密环状结构。（4）第二次成熟分裂结束,精核膨胀到最大程度。（5）两性原核形成,准备进行第一次卵裂。在整个受精过程中,核仁一直存在,其体积逐渐减小;有多精入卵并有多个精原核同时形成的现象。     

长牡蛎(Crassostrea gigas)亲贝培育的代用饵料

传统的牡蛎养殖多采用半人工采苗的方法获得苗种。从８０年代末期，特别是１９９０年以后，牡蛎养殖规模大幅度增加，并且随着单体牡蛎及多倍体牡蛎养殖的兴起，室内人工育苗成了获得苗种的主要途径。亲贝提早入池进行升温促熟．可以使繁殖期提前，获得早苗和大苗，从而充分利用生长适温期，加快生长速度，缩短养殖周期。升温促熟期间，亲贝需要充足的饵料以保证其性腺发育。亲贝的饵料一般为人工培育的单胞藻，但由于温度、光照等各种因素的影响，常造成饵料供应不足，影响亲贝性腺发育。为解决这一问题，作者于１９９４年春季在乳山市海珍…     

黑鲷三倍体的人工诱导研究

分别于1989年3—6月、1990年3—5月在天津和青岛两地采用冷、热休克法对黑鲷进行三倍体的人工诱导研究。结果表明,冷休克法诱导三倍体的效果好于热休克法,其最适诱导条件为卵子在受精后5min,温度为3—4℃的海水中处理10—20min,三倍体诱导率最高可达50.35％;正交试验证明,三倍体率受冷、热休克法的三因素影响程度的顺序由大到小依次为,处理时间、处理时刻、处理温度;黑鲷染色体数目:2n=48,3n=72,它们的染色体组型也同时获得。     

黄海太平洋鲱受精前后卵膜的动态变化

本文使用透射电镜，细胞化学和扫描电镜等方法，在亚微水平上对黄海太平洋鲱鱼（ＣｌｕｐｅａｐａｌａｓｉＣｖｖ，＆Ｖｏｌ．）卵黄膜和受精膜的结构以及皮层小泡在卵黄膜转化为受精膜过程中的作用，受精卵新质膜的形成及其细胞化学变化等进行了研究。观察到，太平洋鲱鱼卵黄膜由５层组成，皮层小泡参与了受精膜的形成，在卵黄膜转化为受精膜的过程中，５层都发生不同程度的形态和糖蛋白及ＰＡＳ阳性物质的变化。另外发现太平洋鲱有３种皮层小泡存在。在皮层反应中，第一种皮层小泡在受精后３ｍｉｎ内迅速破裂，未受精卵尚含有ＰＴＡ染色的小颗粒从小泡中泌出，其界膜形成了质膜的一部份。受精后，此质膜与皮层小泡形成的质膜相同排列构成卵子新的质膜。另外，还发现第一小泡顶部，与卵子质膜相接触的卵子表面有富含糖蛋白的泡状结构。卵子质膜表面糖蛋白及ＰＡＳ阳性物质，随时间推延而不断发生变化     

低温诱导太平洋牡蛎产生三倍体

用低温休克法诱导太平洋牡蛎产生三倍体。实验结果表明,２￣７℃的低温均可获得三倍体,其中４￣５℃的效果较好,最优水平组合的,处理温度为４￣５℃,处理时刻为受精后１５ｍｉｎ,处理持续时间为１５ｍｉｎ,最高三倍体率为３６．８％,影响三倍体诱导率的３因素的顺序为处理持续时间→处理时刻→处理温度。     

太平洋牡蛎多倍体研究

本文综述了太平洋牡蛎多倍体产生的途径、诱导方法、诱导结果、诱导机制、倍性鉴别方法、繁殖、生长、生理指标、抗逆性和口味等。提出：６－ＤＭＡＰ诱导牡蛎三倍体的技术前景广阔;四倍体与二倍体杂交的方法是产生三倍体的最好途径;四倍体是生物方法产生三倍体的中间材料,可以存活,应加大力度地研究和开发;三倍体的性腺能够发育,并可产生具有繁殖力的配子;在良好的环境里,四倍体的生长和抗逆性较二倍体优势;在繁殖季节,三     

5-羟色胺刺激长牡蛎排放精卵在四倍体诱导中的应用

本文报道了用 5 羟色胺催产出的长牡蛎精、卵 ,人工授精后诱导四倍体的实验结果 .结果表明 :在 2 6℃水温条件下 ,受精后 7min ,用 0 .5mg/dm3细胞松弛素B处理2 5min ,获得长牡蛎的胚胎四倍体 ,其诱导率为 1 6.7%,D形幼虫孵化率为 2 7.0 %;诱导效果优于采用常规解剖法 .注射 5 羟色胺刺激长牡蛎亲贝排放精、卵的有效浓度分别为 1× 1 0 -6 ～ 1× 1 0 -2 mol/dm3和 1× 1 0 -5 ～ 1× 1 0 -3mol/dm3.     

Ca2+，Mg2+，K+及胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂对中国对虾卵子激活的影响

对虾成熟卵子的激活都是由海水引起的,海水的刺激引起成熟的卵母细胞发生皮层反应,完成减数分裂,这一过程同有无精子的作用无关(Clark et al.,1977,1980; Lynn et al.,1991; Pillai et al.,1987)。在对锐脊单肢虾(Sicyonia ingentis)的卵子激活研究中发现,其成熟卵子无论受精与否在接触海水以后均具有相同的激活过程,受精卵和未受精卵的皮层反应及减数分裂的恢复没有区别,而海水中刺激卵子发生皮层反应直接因子是Mg2+而不是Ca2+。在无Mg2+人工海水中,锐脊单肢虾的卵子不能激活;而在无Ca2+人工海水中,卵子则可正常激活(Pillai et al.,1987; Lindsay et al.,1992a)。Mg2+对锯额长臂虾(Palaemon serratus)卵子减数分裂的形响的研究表明,锯额长臂虾卵子减数分裂的恢复必须有Mg2+参与,而Ca2+则是非必须的;胞外Mg2+可以诱导卵子的皮层反应,并使卵膜外的微绒毛消失;胞外Mg2+的增加可使卵子内部游离Ca2+浓度发生变化,从而诱导卵子的激活(Goudeau et al.,1986,1991,1996)。 根据前人的报道,胰蛋白酶和胰蛋白抑制剂对对虾精子的顶体反应、卵子的激活都具有明显的影响(Lynn et al.,1987; Griffin et al.,1990; Lindsay et al.,1992b; Chen et al.,1994)。Lynn等(1987)报道褐对虾(Penaeus aztecus)的卵胶前体(jelly procusor)含有约70%-75%的蛋白质及25%-30%的多糖,胰蛋白酶对于人工分离的卵胶前体具有明显的降解作用,胰蛋白酶抑制剂可以抑制卵子在海水中的激活,Griffin等(1990)的研究发现,锐脊单肢虾的卵子内含有类胰蛋白酶的物质,解剖性成熟雌虾获得的卵子置入海水摇匀,上清液-卵水(egg water)可以诱导取自雌虾纳精囊内的精子发生顶体反应,胰蛋白酶也可以诱导对虾精子的顶体反应,而胰蛋白酶抑制剂则完全可以抑制对虾精子在人工海水中发生顶体反应时顶体丝的形成。Lindsay等(1992b)的研究也得出了类似的结果,并对卵水和胰蛋白酶不同浓度及不同作用时间下对对虾精子顶体反应的诱导作用进行比较研究。Chen等(1994)对锐脊单肢虾精子的提取物进行生化分析发现,精子内部也有类胰蛋白酶的物质,并通过免疫电镜技术将其进行定位,精子的提取物可以降解分离的卵黄膜。 激光扫描共聚焦显微镜(Laser scanning confocal microscope)在海洋动物的受精及发育生物学的研究中已有一些报道(Sardet et al.,1992; Stricker et al.,1992; Shen et al.,1993; Jaffe, et al.,1994; Malinda, et al.,1994)。而在对虾的受精及发育生物学方面应用还比较少,只有锐脊单肢虾的卵子激活及早期发育的研究上有一些报道(Hertzler et al., 1992, 1994: Lindsay et al.,1992a)。 海水中的离子成分是影响卵子激活的关键因子,而胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂对对虾受精也有着很大影响,这两方面的工作在国内、外中国对虾的受精生物学研究中均未见报道。 作者对上述两类理化因子对中国对虾卵子激活的影响进行研究,并使用激光扫描共聚焦显微镜对中国对虾卵子受胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂的作用而发生的形态变化进行研究,初步分析了造成异常卵裂的原因。     

太平洋牡蛎多倍体研究

本文综述了太平洋牡蛎多倍体产生的途径、诱导方法、诱导结果、诱导机制、倍性鉴别方法、繁殖、生长、生理指标、抗逆性和口味等。提出。６－ＤＭＡＰ诱导牡蛎三倍体的技术前景广阔;四倍体与二倍体杂交的方法是产生三倍体的最好途径;四倍体是生物方法产生三倍体的中间材料,可以存活,应加大力度地研究和开发;三倍体的性腺能够发育,并可产生具有繁殖力的配子;在良好的环境里,四倍体的生长和抗逆性较二倍体优势;在繁殖季节,三倍体的生化组成等指标比二倍体高,口味较好。