RAPD 分子标记技术用于螺旋藻( Spirulina) 分类的研究

用 1 0 6条随机引物对Sp 1等 7株钝顶螺旋藻进行RAPD分析。结果表明 :(1 )绝大多数引物的PCR扩增结果均相同 ,与它们同属于钝顶螺旋藻种的事实相符。 (2 )筛选出 2 3条具有明显多态性的随机引物 ,扩增出的总条带数为 1 5 1 ,平均每条引物的扩增条带数为6 5 7;其中多态性条带为 1 2 0 ,占总带数的 79 5 %。 (3 ) 7株材料经聚类分析可聚成 2大类 ,Sp 1和Sp 2与Sp 6聚成第Ⅰ类 ,Sp 3、Sp 4及Sp 5与Sp 7聚成第Ⅱ类。 (4)第Ⅰ类和第Ⅱ类之间的遗传距离为 9 76 3 9,而两大类内部各藻株间的遗传距离仅为 2 6 4 5 8— 4 5 82 8,说明两大类间的遗传背景差异较大 ,而两大类内部各藻株间的遗传背景差异相对较小。上述分类结果与 7株材料的某些生理生化和分子生物学特性相吻合 ,但与依据藻丝体形态特征的经典分类结果有较大出入。本研究首次将RAPD分子标记技术用于螺旋藻的分类 ,为在DNA水平建立螺旋藻分类与新品种 (系 )鉴定的技术体系提供理论和技术依据     

钝顶螺旋藻藻蓝蛋白提取纯化新工艺

对钝顶螺旋藻（Spirulina platensis）中藻蓝蛋白的提取和纯化方法进行了改进。用磷酸盐缓冲液循环冻融联合超声波破碎法,50％硫酸铵沉淀获得藻蓝蛋白（phycocyanin,PC）,提取率达到13．1%。粗蛋白提取液再经过两次羟基磷灰石柱（HA）层析和sephacryl-HR-200凝胶层析对其进行纯化,纯度达到4．71％。纯化后的PC在12％十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中得到两条带,分别是α和β两个亚基,分子质量分别为21．4ku和17．0ku。结果表明,通过上述分离纯化过程得到了较高提取率和电泳纯度的藻蓝蛋白。     

大黄鱼高质量基因组DNA的简便提取方法

目前常用的分子标记技术如ＲＡＰＤ、ＡＦＬＰ、微卫星等都是以ＤＮＡ为研究对象 ,而高质量ＤＮＡ的简便快速提取是至关重要的 ［１］。大黄鱼 (Ｐｓｅｕｄｏｓｃｉａｅｎａｃｒｏ ｃｅａ（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）)曾是我国著名的四大海洋渔业对象之一 ,也是目前闽浙两省重要的经济养殖品种。近年来养殖大黄鱼普遍出现生长缓慢、抗病能力弱、性成熟提早、个体小等生物学性状退化的现象［２］。为了从ＤＮＡ水平上研究大黄鱼遗传多样性 ,为养殖大黄鱼种质的改良和养殖业的健康持续发展提供依据 ,我们首先要从大黄鱼组织中提取基因组ＤＮＡ。…     

光照、变性剂和pH对钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)别藻蓝蛋白(APC)抗氧化活性的影响

采用不同光照条件、不同浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)和脲，以及不同pH等条件处理钝顶螺旋藻别藻蓝蛋白(APC)，检测其光谱变化、生成及清除自由基能力的变化，对纯化的钝顶螺旋藻别藻蓝蛋白(APC)在不同条件下的抗氧化活性进行了研究。结果表明，光照下，APC具有生成自由基的能力；黑暗中，APC却表现为清除自由基。SDS是一种很强的变性剂，1mmol／L的SDS即可以使APC完全变性，能量传递功能丧失，光照下，APC生成自由基的能力丧失，自由基清除能力明显增强。1．6mol／L的脲作用后，只使APC部分变性，导致APC能量传递效率降低，光照下，表现为生成自由基的能力下降。随着脲浓度的升高(3．2mol／L、6．4mol／L)，APC的结构逐渐变化，能量传递功能逐渐丧失，表现为生成自由基的能力逐渐下降，清除自由基的功能逐渐增强。APC具有较宽的pH稳定性，在pH为7—10的范围内非常稳定；当pH为11时，APC的结构已经发生变化。在日光灯下，pH为7时，APC具有生成自由基的能力；pH为8时，APC的荧光光谱虽然没有发生变化，但它们表现为清除自由基的能力。随着pH的增加，自由基清除能力也增强。因此，APC具有产生和清除自由基的双重功能，光照是调控自由基清除与产生的关键因素，并且只有APC具有能量吸收和传递功能时，才具有产生自由基的能力。脱辅基蛋白变性后，清除自由基的能力加强。     

钝顶螺旋藻多糖提取工艺的研究——三氯乙酸(TCA)法的正交实验优化

研究了用三氯乙酸(TCA)脱除蛋白质提取钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)多糖的工艺,并以提取率、样品糖含量与蛋白含量为指标,应用正交实验设计优化了提取液pH值、提取温度及提取时间3个因素。结果表明,在提取液pH值为12、提取温度为90℃及提取时间为8h的最佳条件下,所得螺旋藻多糖为白色粉末,提取率为3.10%,糖质量分数为81.79%,蛋白质量分数为0.57%。     

一种提取眼点拟微球藻(Nannochloropisis oculata)DNA的简便方法

用氯化锂法从眼点拟微球藻(Nannochloropisis oculata)中提取DNA并对其提取条件进行了优化。新鲜藻细胞在提取液(0．6mol／L LiCl，0．8％Sakosyl，20mmol／L EDTA(pH8．0)，0．4％PVP，10mmol／L Tris-HCl(pH8．0)，5％β—巯基乙醇)中经过55℃温育30min，每mg鲜藻可提取20—40mg DNA，提取的DNA分子量在23kb左右，可用于PCR、限制性酶切等。     

不同保存条件下中华哲水蚤基因组DNA提取的比较

以采自厦门港的中华哲水蚤(Calanus sinicus)为对象，研究多种保存条件对中华哲水蚤基因组DNA提取的影响。结果表明，除5％福尔马林保存的样品没有提取到DNA之外，其余样品均能成功提取出基因组DNA；以该DNA为模板通过相应引物成功扩增出线粒体DNACOI基因片段。其中无水乙醇保存样品提取可靠的基因组DNA方法的建立，为野外样品保存工作提供了一个简便，经济的途径。     

中华管鞭虾(Solenocera crassicornis)蛋白酶的纯化及其生化特性研究

采用Tris-HCl缓冲液(50mmol/L,pH7.5)抽提、Q-sepharose F.F.阴离子交换层析、Sephacryl S-300凝胶过滤层析、SDS-PAGE等方法,进行中华管鞭虾虾头蛋白酶的分离纯化、酶学性质及其动力学特性的研究。结果表明,中华管鞭虾虾头蛋白酶粗提物经层析后,得到聚丙烯酰胺凝胶电泳纯的一酶组分。该蛋白酶的比活力从359.39U/mg增加到8277.83U/mg,提高了23.03倍,回收率达37.69%,SDS-PAGE显示该蛋白酶只含一条谱带,相对分子量为24.50kDa。以偶氮酪蛋白作为底物,该酶的米氏常数Km值为0.28mg/ml,最适温度为55℃,最适pH为7.5;蛋白酶在60℃以下比较稳定,放置1h后活性仍保持在60%以上,而在60℃以上时蛋白酶活性急剧下降,80℃放置1h后,酶活性只残留21.32%。10mmol/L Cu2 、Zn2 和EDTA对该蛋白酶有较强的抑制作用,抑制率分别约为97%、96%和55%,10mmol/LMg2 能显著促进蛋白酶活性,而10mmol/LFe2 、Ba2 、Ca2 对蛋白酶活性的影响不大。推测中华管鞭虾蛋白酶可能为一种金属蛋白酶。     

彩虹明樱蛤基因组DNA提取及RAPD扩增的初步研究

对采自浙江温岭的彩虹明樱(Moerella iridescens)养殖群体的DNA提取和RAPD扩增条件进行了研究.从38种随机引物中筛选到重复性好的6种引物分别对11个个体的DNA进行扩增,共产生247个DNA条带(300～1 600 bp),总共检测到43个位点,其中多态位点32个,多态位点比例为74.42%.11个个体间的遗传相似系数在0.553～0.884之间,平均为0.691,个体间的平均遗传距离为0.309.表明该群体的遗传多样性比较丰富,种质资源处于良好状态.     

节旋藻(螺旋藻)高分子量DNA的两种制备方法

DNA的简便高效制备方法是研究基因结构、功能及开展其它各项研究的基础。首次报道了针对节旋藻的结构和组成特性而建立的制备节旋藻高分子量DNA的两种方法。其中第一个方法是常规方法，可大量提取纯度较高、分子量达50kb的节旋藻DNA，可用于构建节旋藻质粒库、Southern杂交和PCR操作等；第2种方法是用脉冲电场凝胶电泳分离DNA片段，制备的DNA片段达数百kb，可用于构建节旋藻噬菌体库、粘粒库、BAC库等，从而为构建节旋藻物理图谱，定位克隆基因奠定基础。     

螺旋藻多糖和糖蛋白的提纯及其理化特性研究

采用改进的人螺旋藻中提取多糖和糖蛋白。经恒温加热去蛋白后，用EDAE－52柱层析后得到一种多糖和两种糖蛋白，经Sephadex G-100和凝胶电泳证实所得的多糖和糖蛋白为组的一组分。采用凝胶过滤法测定的多糖近似分子量为19500。由SDS－PAGE测定分子量糖蛋白GS－1的分子量为14900，GS－2的分子量为18400。红外光谱呈现出典型的多糖吸收峰，含有α－型糖苷键。β消去反应初步证明所提取的两种糖蛋白可能是O－连续的糖蛋白。     

钝顶螺旋藻质粒的电镜观察及杂交研究

于１９９２年６月－１９９３年４月，对钝顶螺旋藻质粒进行透射电镜观察及分子杂交研究。结果表明，利用层分子膜展开技术，能够观察到超螺旋以及闭合环形的质粒图象；Ｓ６质粒大小的平均值约为２．０ｋｂ，与电泳检测的结果稍有出科。斑点杂交结果表明，不同形态藻株Ｓ６、Ｆ３、Ｆ３弯与Ｆ３直质粒之间具有一定同源性，与染色体ＤＮＡ之间均显示同源性。对钝顶螺旋藻质粒的进一步研究将推动其基因工程育种的开展。     

钝顶螺旋藻部分原生质体及单细胞的制备与培养

于1992年1月-1994年4月，进行超声波处理方法制备钝顶螺旋藻部分原生质体以作为基因工程受体，以及制备单细胞用于固体平板克隆化培养的研究。研究结果表明：超声波以20kHz频率、15W功率作用30s，可使藻丝体断裂成15．0±1．6个细胞长度；延长作用时间，至2－6个细胞长度时，细胞壁结构遭到破坏，形成部分原生质体；继续作用，可形成少量原生质体和大量单细胞。断裂藻丝体、部分原生质体、单细胞以及原生质体均可涂布于固体培养基上再生或生长。以一定密度涂布单细胞与原生质体，能够形成彼此分开的单个克隆，可用于筛选及遗传分析。本文提供了一种节省溶菌酶的制备螺旋藻透性体的方法，超声波作用利于外源基因的导入，而涂布培养利于进一步的筛选和形成克隆。     

海带中细胞激动素的纯化分离方法

海带样品于 2 0 0 1年采自青岛太平角海湾 ,用三种不同方法处理样品 ,通过对实验方法及条件的筛选 ,确立了提取、纯化和分离海带中细胞激动素的方法步骤和流程。结果表明 ,最佳方法的基本步骤为 :( 1 )用甲醇∶水∶醋酸 ( 70∶ 30∶ 3,V/V/V)从海带组织中提取出细胞激动素 ,再用PVPP柱去除提取液中的酚类和其他杂质 ;( 2 )将提取液通过连在一起的PVPP柱、DEAE柱和C1 8柱 ,以纯化样品并同时从自由基、核苷、核苷酸和葡糖苷型细胞激动素混合物中分离出核苷酸型细胞激动素 ;( 3)用接有氨基柱的正相液相色谱进一步将葡糖苷型细胞激动素分离出来 ;( 4 )用C1 8液相色谱柱分离其他各种细胞激动素     

绿色巴夫藻硒多糖的提取、分离与纯化

于１９９５年３－７月采用本实验室培养的绿色巴夫藻,经沸水提取及去除蛋白,小分子物等杂质后,通过ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０柱层进行分离,纯化实验。结果表明,分离纯化得到的两种多糖－４Ｐ１和４Ｐ２,通过醋酸纤维素薄膜电脉及ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００凝胶过滤检验纯度后,证实其均为单一含硒多糖,且都带负电。两种硒多糖含硒量都较低,分别为７７ｍｇ／ｇ和２２０ｍｇ／ｇ。     

龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)多糖的分离纯化及其组成研究

以龙须菜粗多糖为原料,利用离子交换层析分离纯化,紫外光谱、醋酸纤维薄膜电泳和凝胶过滤层析法鉴定多糖的纯度及其分子量,同时进一步采用气相色谱分析龙须菜多糖的单糖组成.结果表明,利用蒸馏水、0.3mol/L NaCl和1.2mol/L NaCl溶液分步洗脱,DEAE-Sephadex A-25离子交换层析纯化得到龙须菜多糖的三个组分G1、G2和G3,得率分别为3.61%、69.26%、18.70%:G1、G2和G3均显示为单一电泳谱带和单一洗脱峰,无蛋白、核酸杂质,分子量依次为21993、48460、61031U;G2和G3的单糖组成主要为半乳糖、3.6-内醚半乳糖及少量葡萄糖;G2糖链通过1→2键与1→6键方式连接,存在非还原末端基及连三羟基,G3糖链则通过1→3键与1→2键方式连接.     

瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)卵黄蛋白原的纯化、性质鉴定及ELISA检测方法的建立

腹腔注射17β-雌二醇(E2),使瓦氏黄颡鱼雄鱼在7天内产生卵黄蛋白原(Vtg)。采用凝胶过滤和离子交换两种层析技术,从E2诱导的雄性瓦氏黄颡鱼血浆中分离、纯化出Vtg,采用糖、磷、脂蛋白染色技术证明分离、纯化的蛋白为Vtg,该Vtg在非变性条件下分子量约为240kDa,在SDS变性条件下分子量约为143kDa。纯化的瓦氏黄颡鱼Vtg经检测显示可能含有类胡萝卜素,但没有二硫键,对热相对稳定。利用纯化的瓦氏黄颡鱼Vtg,制备了兔抗瓦氏黄颡鱼Vtg多克隆抗血清。用双向免疫扩散法测得抗血清的纯度较高,效价为1︰32;Western blotting检测显示抗血清的特异性较好。以瓦氏黄颡鱼Vtg多克隆抗血清为抗体,以纯化的瓦氏黄颡鱼Vtg为抗原,建立了间接酶联免疫吸附反应(ELISA)方法检测瓦氏黄颡鱼体内Vtg的含量,标准曲线线性部分的线性方程为y=0.099x+0.4529(R2=0.9327),该方法检测的灵敏度为15.6ng/ml,工作范围为31.2—4000ng/ml,在此范围内,标准曲线具有良好的线性。     

假根羽藻Cyt b6 f 蛋白复合体的分离与纯化

提要改进了以往分离纯化Cytb6f的方法,进行了海洋绿藻——假根羽藻(Bryopsiscorticu-lans)Cytb6f蛋白复合体分离纯的研究。结果表明,该Cytb6f制剂由Cytf、Cytb6、Rieske[Fe-s]蛋白和亚基IV四种主要的多肽亚基以及少量的Chl·a和类胡萝卜素组成。4个多肽亚基的表观分子量分别为34·8、24·0、18·7及16·7kD,该Cytb6f制剂的Cytb6/f比值接近2·0,其纯度值为9·9nmolCytf/mg,其催化电子传递的活性(C10-PQH2→PC)为73e/s。上述分析表明,假根羽藻Cytb6f在组成、纯度和催化活性方面均与已报道的高等植物、淡水绿藻和光合细菌的Cytb6f制剂相似。     

两种培养温度下钝顶螺旋藻吸收累积锗的研究

于１９９５年１￣３月将钝顶螺旋藻培养在５￣１５ｍｇ／Ｌ锗浓度的培养基内,研究两种培养温度下藻细胞,蛋白质、脂类和碳水化合物结合锗的量,探讨温度影响螺旋菏吸收累积锗的机理,结果表明,在两种培养温度下钝顶螺旋藻均可吸收累积一定量的猪（２２．４４－５２．１３μｇ／ｇ）并均匀地结合到蛋白质、脂类和碳水化合物中,藻细胞结合锗的理在代温下随外加是浓度增加而增加,在高温下与外加是浓度关系不明显;两种培养温度２下