大黄鱼(Pseudosciaena crocea)转铁蛋白(Tf)基因克隆及序列分析

提要应用RNeasy animal mini试剂盒抽提大黄鱼total RNA,逆转录合成模板cDNA;同时综合分析从GenBank数据库查询到已报道的转铁蛋白(Tf)基因序列,先设计并合成扩增引物扩增出大黄鱼转铁蛋白部分基因序列,再应用RACE技术,克隆出大黄鱼转铁蛋白全长cDNA基因,全长2461个核苷酸,编码661个氨基酸。应用WCG软件包,采用DNADIST和NEIGHBOR分析方法,构建了转铁蛋白系统进化树。树图显示与传统的分类地位大致相符,可以看出转铁蛋白在海水鱼和淡水鱼的进化上的差异,同时也显示大黄鱼Tf与真鲷的同源性最高。     

大黄鱼(Pseudosciaena crocea) leptin和cholecystokinin基因的克隆和表达特性研究

本文克隆了两种大黄鱼(Pseudosciaena crocea)摄食调控因子胆囊收缩素(CCK)、瘦素(LEP)基因的全长序列,并对其表达特性进行了研究。结果表明,克隆得到CCK基因属硬骨鱼类的CCK1亚家族,全长900nt,编码137个氨基酸,与其他鱼类的CCK1相比序列组成非常保守,特别是在20氨基酸的信号肽和8个氨基酸的CCK-8活性结构区域;而克隆得到LEP基因属硬骨鱼类的LEPA亚家族,全长1290nt,编码161个氨基酸,与其他鱼类LEP相比基因同源性较差,但在3D结构上却保留了LEP经典的4个α螺旋特征。两种因子在所检测的所有组织中均有表达,但尤以脑、胃、肠消化道、肝脏等摄食及能量平衡相关组织中表达活性最高。8天的饥饿能使大黄鱼脑、消化道组织的CCK和肝脏、脂肪组织中的LEP表达显著降低(P0.05)。该结果说明CCK和LEP可能在大黄鱼的摄食生理和能量平衡中起着重要的调控作用;本研究将为深入了解鱼类食欲调控的神经内分泌机理提供基础。     

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)养殖群体遗传多样性的降低

采用AFLP技术方法,对福建二个野生及二个养殖大黄鱼群体进行了遗传多样性的研究.实验采用7对引物组合,在四个群体的120个个体中共扩增出472个位点,其中多态位点为220个,多态位点比例为46.61%.结果表明,大黄鱼养殖群体的遗传多样性降低:宁德野生群体和湄州野生群体多态位点比例分别为42.42%和45.14%,Nei遗传多样性指数分别为0.1046和0.1245,shannon多样性指数分别为0.1659和0.1942,平均有效等位基因数(Ne)分别为1.4153和1.4428;宁德养殖群体和连江养殖群体多态位点比例分别为40.83%和40.53%,Nei遗传多样性指数分别为0.1027和0.1039,shannon多样性指数分别为0.1615和0.1633,平均有效等位基因数(Ne)分别为1.3919和1.3856.四个群体间遗传距离为0.0359-0.1465,平均为0.079,群体间基因流为1.0808.     

网箱养殖大黄鱼(Pseudosciaena crocea)疾病与环境因子的关系

根据2001-2005年对舟山市网箱养殖大黄鱼的养殖情况、发病情况、死亡情况和海区环境因子的监测以及收集的气象资料,对疾病与环境因子的关系进行了研究,探索了环境因子及其变化对大黄鱼发病率的影响.结果表明,大黄鱼的发病率和发病类型与气温、风速有关:发病率与水温(>20℃)、悬浮物、化学耗氧量(chemical oxygen depletion,COD)、细菌数均呈显著的正相关,与透明度呈显著的负相关.通径分析显示,对大黄鱼发病率直接效应最大的是水温,其次是风速.通过分析,推测引起舟山市网箱养殖大黄鱼疾病多发的主要原因是网箱养殖本身造成的水体污染,从而提出了舟山市网箱养殖大黄鱼疾病预防的主要措施.     

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)精子冷冻前后的活力及超微结构变化

采用两步降温法超低温冷冻保存大黄鱼精子,并用透射电镜技术研究了精子的超微结构损伤.结果表明,大黄鱼冻精的激活率、运动时间及寿命与鲜精相比无显著差异.鲜精中28.5％的精子形态结构异常,冻精中37％的精子形态结构异常.形态结构正常的精子表现为质膜与核膜结构完整、无膨胀现象,袖套、轴丝及中心粒结构正常,线粒体形态完整、嵴较发达;形态结构异常的精子表现为质膜破裂、脱落,质膜膨胀,核膜破裂、脱落,核局部受损伤,线粒体膨胀、嵴退化或消失,线粒体移位或脱落.结果显示,以Cortland溶液为稀释液,10％ DMSO为抗冻剂,对大黄鱼精子具有较好的抗冻保护作用.     

团头鲂(Megalobrama amblycephala)两种热休克蛋白 70(HSP70s)的原核表达、纯化及鉴定

采用PCR方法扩增团头鲂组成型HSC70和诱导型HSP70基因完整的编码区片段,并分别克隆到原核表达载体pET-22b(+)中,然后转化大肠杆菌BL21(DE3),用1mmol/L IPTG在不同温度及时间下进行诱导表达。采用Ni-NTA His Bind Resins亲和层析和DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱层析对目的蛋白进行纯化,并进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。结果表明,成功构建了团头鲂两种重组表达质粒pET-22b(+)/Ma-HSC70和pET-22b(+)/Ma-HSP70,表达融合蛋白的相对分子量均约为72kDa,并能与兔抗人HSP70多抗进行特异性结合,这两种HSP70s融合蛋白经纯化后的纯度均达到95%以上。本实验选择融合蛋白Ma-HSC70在25℃和Ma-HSP70在30℃下分别诱导7h作为可溶性表达的最佳条件。     

大黄鱼(Larimichthys crocea)白细胞介素10(IL-10)基因克隆及溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)侵染后表达变化分析

白细胞介素10(interleukin10,IL-10)是鱼类先天性免疫因子之一,在炎症反应和免疫调节中有着重要作用。本研究获得大黄鱼(Larimichthys crocea)IL-10基因cDNA序列,由899个核苷酸组成,含1个555bp的开放阅读框、编码184个氨基酸,预测编码蛋白分子量为21.24kDa、N端有22个氨基酸组成的信号肽序列。氨基酸序列多重比对表明大黄鱼IL-10具有IL-10家族特征性序列和构成2对二硫键的4个保守性半胱氨酸,与欧洲鲈(Dicentrarchuslabrax)IL-10序列相似性最高(78.5%);系统进化树分析显示大黄鱼IL-10和其他鱼类IL-10形成一个大簇,与欧洲鲈进化关系最近。荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测结果显示健康大黄鱼IL-10基因在鳃和肠中高表达,肝和头肾中低表达;溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)侵染后大黄鱼肠、脑、脾、肝和头肾中IL-10基因表达量均显著上调(P0.05),其中头肾和肝中上调幅度最大(分别为菌侵染前的10.06倍和8.79倍)。综上,大黄鱼IL-10基因表达与病原菌感染密切相关,为深入研究大黄鱼IL-10的生物学功能及免疫机制提供了基础资料。     

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)源美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)的分离鉴定及致病性研究

于2010年从宁德患病大黄鱼中分离得到一株优势菌NPL1006,经鉴定该菌株为美人鱼发光杆菌。人工感染实验结果显示该菌对大黄鱼的半致死浓度(LD50)为7.96×103CFU/g体重。药敏性实验结果显示NPL1006对头孢唑啉、头孢噻吩和诺氟沙星等9种药物高度敏感。采用纸片法检测得到NPL1006的胞外产物具有蛋白酶、明胶酶和淀粉酶活性。胞外产物感染斑马鱼研究结果显示其LD50为1.20mg蛋白/kg体重。以上结果表明大黄鱼源美人鱼发光杆菌NPL1006胞外产物含有多种毒力因子,与该菌对大黄鱼的致病性密切相关。     

河流弧菌(Vibrio fluvialis)对大黄鱼( Pseudosciaena crocea ) 鳃粘液粘附特性研究

采用间接ELISA法(最低检测值约104cfu)研究不同培养条件、不同培养阶段、抗体处理、营养饥饿等对河流弧菌粘附作用的影响。结果表明,经TSB培养的菌体的粘附作用极显著强于TSA培养的菌体的粘附作用(P<0.01);河流弧菌能很好地粘附于大黄鱼粘液,粘附量随菌浓度升高而增大并符合饱和粘附动力学:y=0.1782ln(x)1.6923(R2=0.9810);不同生长阶段河流弧菌的粘附能力不同,在培养初期阶段细菌的粘附量先是随着培养时间的延长而增大,并在培养24h后粘附量达到最大,而后随着培养时间的延长其粘附量急剧下降;抗体处理后河流弧菌的粘附量显著低于对照组(P<0.05);营养饥饿菌体的粘附量明显降低。以上结果表明:海水中的河流弧菌能很好地粘附于大黄鱼鳃粘液,其粘附作用受细菌培养条件、营养状况等自身因素的显著影响。本研究结果有助于了解河流弧菌的流行病学和致病机理。     

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)Cathepsin L基因cDNA片段的克隆与稳定性研究

采用RACE-PCR和RT-PCR方法获得大黄鱼组织蛋白酶L(Cathepsin L)基因的cDNA中间片段,片段长度为773bp。BLAST分析显示,大黄鱼Cathepsin L基因cDNA片段与鱼的同源性最高达到95%,与斑马鱼同源性为80%。实时定量分析了大黄鱼Cathepsin L基因在宰杀当天和冷藏期间的mRNA水平,结果表明,大黄鱼0℃条件下冷藏0、5、10、15、20d肌肉中mRNA都具有相对稳定性,但是含量水平有差异并且是呈现下降趋势,宰杀当天的大黄鱼肌肉中Cathepsin L基因mRNA含量水平最高,与冷藏5、10、15、20d的Cathepsin L基因mRNA水平差异性极显著(P<0.01),冷藏5d的Cathepsin L基因mRNA水平与15、20d的水平也达到了极显著水平(P<0.01)。同时结果表明,在不同储藏时间Cathepsin L基因的mRNA含量水平与肌肉TPA和pH等也表现了高度的相关性,表明Cathepsin L基因的mRNA含量可以作为评价大黄鱼冷藏期间肉品质指标的可行性和准确性。     

梅氏新贝尼登虫(Neobenedenia melleni)卵黄铁蛋白的cDNA克隆、原核表达及抗血清制备

从cDNA文库中获得了梅氏新贝尼登虫卵黄铁蛋白(NmYF)的编码序列。序列全长739个核苷酸,3′-末端具有polyA尾,单一大开放阅读框编码一个由226个氨基酸组成的分子量为26.1kDa的蛋白。序列比较表明,NmYF与卫氏并殖吸虫卵黄铁蛋白最相似,氨基酸序列同源性为23.7%。系统进化树分析表明,NmYF、卫氏并殖吸虫卵黄铁蛋白和头槽绦虫卵黄铁蛋白形成了一个小的进化簇,而体铁蛋白序列形成了一个大的进化簇,揭示了卵黄铁蛋白和体铁蛋白间的差异以及进化上的相关性。这是梅氏新贝尼登虫卵黄铁蛋白基因序列的首次报道。随后,构建了插入有全长NmYF基因开放阅读框序列的原核表达质粒pET-22b-NmYF,转化大肠杆菌BL21pLysE菌株,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE检测表明预期大小的目的蛋白大量表达。随后制备了目的蛋白的多克隆抗血清,它能与目的蛋白起强的特异性反应,但与细菌自身蛋白不起反应,可用于后续研究。     

浙江枝吻纽虫(Dendrorhynchus zhejiangensis) 热休克蛋白70基因克隆与表达特征研究

采用同源克隆和cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆了浙江枝吻纽虫热休克蛋白70(DzHSP70)基因全长cDNA序列,并利用荧光定量PCR方法,分析了该基因在重金属胁迫下的表达特征。结果表明,DzHSP70cDNA全长2827bp,包括294bp的5’UTR、628bp的3’UTR和编码634个氨基酸残基的1905bp的开放阅读框。HSP70家族的3个签名序列以及细胞质特异性调控基序EEVD等特征元件在DzHSP70中高度保守。重金属离子Fe3+、Pb2+和Cd2+均可上调该基因的表达,其中Pb2+的毒理效应最强。研究结果表明DzHSP70可能参与了机体对于重金属的解毒过程。     

太平洋真宽水蚤(Eurytemora pacifica)热休克蛋白70(HSP70)基因克隆及在金属胁迫下的表达分析

热休克蛋白70(HSP70)是生物体内一种重要的机体与细胞保护性蛋白。本文利用RT-PCR以及RACE技术首次克隆获得太平洋真宽水蚤(Eurytemora pacifica)HSP70简称Ep.HSP70 c DNA的全长序列,序列全长为2252bp(KY807149),开放阅读框(ORF)长1947bp,编码649个氨基酸,5′端99bp,3’端206bp;预测蛋白分子量为70.81k Da,等电点为5.16,为一种亲水性蛋白,不存在信号肽及跨膜区,含有丰富的α螺旋结构(37.60%),β折叠(18.80%)。同源氨基酸序列比对发现,与其他甲壳动物的同源基因保守性较高,尤其是HSP70家族典型的结构位点序列在甲壳类动物中具有高度保守性。系统进化分析表明,太平洋真宽水蚤和安氏伪镖水蚤(Pseudodiaptomus annandalei)进化关系最近;桡足类种内同源性要高于虾蟹类,与虾类同源性高于蟹类。荧光定量数据分析表明,不同浓度铜、镉、锌胁迫下太平洋真宽水蚤HSP70基因表达水平具有显著的时间效应与浓度效应的特征,三种金属对Ep.HSP70抑制效应呈现CuCdZn的趋势。Ep.HSP70基因的成功克隆及金属胁迫下的表达分析为深入研究HSP70蛋白生物学功能具有重要意义。     

魁蚶(Scapharca broughtonii)热休克蛋白90(HSP90)基因的克隆及转录表达分析

热休克蛋白90(HSP90)作为一种研究的常规免疫基因,在许多物种都有过报道。本研究从构建的魁蚶转录组文库中筛选得到的HSP90基因部分序列为基础,通过RACE技术获得其c DNA全长序列(命名为Sb HSP90),以期明确魁蚶HSP90基因的结构特征、组织分布及其对病原菌刺激的免疫变化规律。序列和结构分析表明,该c DNA全长2707bp,编码一个由728个氨基酸组成的多肽,该多肽含有HSP90家族共有的5个签名序列,C端高度保守的MEEVD短肽序列和ATPase结构域;预测蛋白的分子量(Mw)为83.72k Da,理论等电点(p I)为4.85;预测该蛋白无信号肽,具有4个糖基化位点。同源性及系统分析表明,Sb HSP90基因与软体动物的HSP90相似性达到83%以上,其中与长牡蛎(Crassostrea gigas)和海湾扇贝(Argopecten irradians)相似度最高达86%,与甲壳动物HSP90的相似度都在81%左右,与脊椎动物HSP90-α和HSP90-β的同源性都很接近。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)结果表明:Sb HSP90 m RNA在魁蚶血细胞、斧足、鳃、外套膜、闭壳肌和肝胰腺和中均有表达,斧足中的表达量相对较高,而在肝胰腺中的表达量则相对较低;注射鳗弧菌后,相对于对照组,Sb HSP90基因在所检测的每个组织中m RNA水平上的表达量都显著上调(P0.01),而且具有显著的时间依赖性和瞬时表达趋势。     

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)消化道不同部位两种消化酶的活力分布及其受温度、pH的影响

采用改变离体条件下大黄鱼消化道不同器官消化酶的作用温度和pH的方法,对其不同消化器官中的蛋白酶和淀粉酶活力进行测定,研究两种消化酶活力的分布特征以及温度、pH对两种消化酶活力的影响。结果表明,在消化道生理酸碱条件下蛋白酶活力胃>后肠>前肠>肝胰脏(P<0.01);淀粉酶活力肝胰脏、胃>后肠>前肠(P<0.01);在实验设定的条件范围内,胃、肝胰脏、前肠、后肠各部位蛋白酶的最适温度分别为35℃、30℃、40℃、35℃,淀粉酶的最适温度分别为30℃、25℃、30℃、35℃。随着温度由低向高变化,两种酶各部位活力均有从低向高然后逐渐降低的变化趋势;蛋白酶的最适pH值分别为2.2、6.0、7.0、8.0,淀粉酶各部位最适pH值分别为3.9、7.0、7.0、7.0。在设定的实验pH范围内,胃蛋白酶的活力随着pH值的升高而迅速降低,其余各部位酶均有随pH升高酶活力先升而后降的变化趋势。     

鳜(Siniperca chuatsi)生长激素基因克隆和原核表达

采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从鳜脑垂体总RNA中扩增生长激素(GH)成熟肽基因,将成熟生长激素的cDNA定向克隆到表达载体pET-32a(+),并转入大肠杆菌BL21(DE3)中。结果表明,鳜生长激素(GH)基因含开放阅读框(ORF)615个核苷酸,编码204个氨基酸,蛋白分子量为23kDa,等电点为7.07,其中酸性氨基酸占10.78%,碱性氨基酸占12.74%,疏水氨基酸为占44.12%,极性氨基酸占32.35%。在IPTG终浓度1.0mmol/L、温度37℃和培养时间4h的最佳诱导表达条件下,鳜生长激素基因(GH)在大肠杆菌中获得高效表达,重组菌体裂解物经SDS-PAGE可检测到分子量约为43kDa的鳜生长激素与硫氧还蛋白(Thioredoxni,Trx)融合蛋白,其表达量约占菌体总蛋白58%。Western印迹分析也证实含6×His标签的重组融合蛋白能够很好地与抗6×His单抗发生反应。本研究为下一步鳜生长激素基因(GH)的生物学功能及应用奠定了基础。     

宽体沙鳅(Botia reevesae)热休克蛋白70 基因的克隆及表达分析

为深入分析热休克蛋白响应胁迫的分子机制,实验以宽体沙鳅(Botia reevesae)为研究对象,利用同源克隆和cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE) 技术克隆得到宽体沙鳅热休克蛋白70(BR-HSP70) 的cDNA 全长。结果发现,BR-SP70 cDNA全长为2,371bp,包含1,947 bp的开放阅读框(opening reading frame,ORF),102 bp 5’-非编码区(untranslated region,UTR)和322 bp 3’-UTR等。通过序列同源性比对发现,BR-HSP70 cDNA与团头鲂(Megalobrama amblycephala)和猪(Sus scrofa)的同源性分别为98%及83%,且ORF编码的649个氨基酸中含有HSP70家族的家族信号标签、N-糖基化位点及EEVD等能位点等保守序列。上述结果表明,本研究所获的基因为宽体沙鳅 HSP70基因。实时荧光定量PCR 分析发现,氨氮胁迫和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)侵染均会显著上调宽体沙鳅鳃、肝脏及肾脏HSP70 mRNA的表达,表明HSP70基因在宽体沙鳅应对环境胁迫中发挥了重要的抗应激作用。