不良环境对溶藻弧菌胱硫醚-β-合成酶活力及抗氧化系统的影响

研究非适宜的p H、温度和盐度条件,以及抗生素胁迫和添加外源H2S条件下溶藻弧菌胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase,CBS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化物酶(peroxidase,POD)的活力及谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量的变化,分析CBS与抗氧化系统的相关性,探讨不良环境对CBS活性及抗氧化系统的影响。结果表明,在非适宜温度、盐度及抗生素胁迫下,溶藻弧菌的CBS活力均高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。在非适宜温度下,其SOD和POD的活力及GSH含量均有不同程度的提高(P0.05)。在非适宜盐度下,GSH含量上调(P0.05)。在红霉素和壮观霉素胁迫下,SOD和POD活力均上调(P0.05),而庆大霉素和四环素胁迫则分别提高SOD、POD活力(P0.05)。在非适宜p H条件下,低p H上调CBS、SOD和POD的活力及GSH含量(P0.05);高p H条件下CBS活力与对照组差异无统计学意义(P0.05),SOD活力较对照组下降(P0.05)。相关性分析发现,在不同温度、盐度条件下及抗生素胁迫下CBS活力与SOD、POD活力及GSH含量之间具有显著正相关(P0.05),而在不同p H条件以及抗生素+Na HS处理后,CBS活力与SOD、POD活力及GSH含量之间的相关性无统计学意义(P0.05)。溶藻弧菌可通过提高CBS活力以调节其抗氧化系统,从而抵御不良环境,而外源H2S则提高溶藻弧菌SOD活力和GSH水平以维持溶藻弧菌正常生理活动。     

溶藻弧菌dtd基因的克隆及原核表达条件优化

根据NCBI数据库中已发表的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)全基因组序列合成一对特异性引物,应用聚合酶链式反应(PCR技术)扩增溶藻弧菌HY9001菌株dtd基因,将其定向克隆到原核表达载体pET-32a构建重组表达质粒pET-DTD,并对其进行诱导温度、诱导时间、诱导IPTG浓度等条件的优化,最后探究其纯化时最佳咪唑洗脱浓度。结果表明:DTD蛋白成功表达,且其以包涵体的形式存在,在诱导温度37℃、IPTG浓度0.1 mmol/L条件下诱导5 h表达量最高,纯化最佳咪唑洗脱浓度为150 mmol/L。     

哈维氏弧菌PspF基因的克隆及原核表达分析

【目的】对哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)ZJ0603的PspF基因进行克隆与原核表达分析,优化表达条件。【方法】克隆哈维氏弧菌菌株ZJ0603的FspF基因,对其编码蛋白进行理化性质、信号肽、亚细胞定位、二级结构及三级结构分析,构建表达载体pET28a-PspF,经BamHI和XhoI双酶切和测序鉴定正确后转入表达菌株大肠杆菌BL21,对表达重组菌株进行表达条件优化及Western Blot鉴定。【结果与结论】PspF基因的开放阅读框(ORF)全长为1 179 bp,编码336个氨基酸,分子质量为38.04 ku,理论等电点5.27,不稳定系数41.97,总平均亲水性-0.382,PspF蛋白整体表现为亲水性蛋白。成功构建含pET28a-PspF的表达菌株,其最佳诱导条件为37℃下异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)0.2 mmol/L诱导6 h,其表达蛋白为38 ku。Western Blot结果表明PspF重组蛋白成功获得,蛋白同源性高,具有作为抗弧菌病疫苗的潜力。     

溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统注射装置蛋白VscO的原核表达及免疫原性

为探究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)ZJ03株Ⅲ型分泌系统(Type III secretion system,T3SS)注射装置蛋白VscO作为疫苗候选抗原的可能性,根据GeneBank上登陆的溶藻弧菌VscO序列(NO.KJ179947),设计1对带酶切位点的特异性引物,PCR扩增vscO基因,序列分析结果显示,该基因全长462 bp,理论分子质量为18.430ku。将vscO基因定向插入原核表达载体pET-28a(+),构建重组表达质粒pET-vscO。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,可在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达分子质量约为22 ku的VscO融合蛋白,且该蛋白主要以包涵体形式存在。VscO蛋白表达和纯化的最优条件为:0.1 mmol/L IPTG、37℃条件下诱导4 h,咪唑洗脱浓度为400 mmol/L。用纯化后的融合蛋白免疫SPF级小鼠,获得高效多克隆抗体。Western-blotting结果表明,鼠抗VscO血清既能与重组VscO蛋白发生反应,也能与分离自溶藻弧菌约22 ku的天然蛋白发生反应,提示T3SS注射装置蛋白VscO可能是溶藻弧菌的重要保护性抗原之一。     

溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统vscP基因的克隆与生物信息学分析

根据NCBI上登录的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)全基因组序列,设计一对克隆溶藻弧菌HY9901株Ⅲ型分泌系统"分子尺"蛋白VscP全长基因的特异性引物,PCR扩增获得基因的全长片段。结果显示,vsc P(Gen Bank登录号FR780678)开放阅读框ORF为1 206 bp,共编码401个氨基酸残基。根据推导的氨基酸序列预测其分子质量约为44.4 ku,等电点为5.72。Signal 4.1 Server和TMHMM Server 2.0预测结果表明,VscP无信号肽与跨膜结构域。Soft Berry-Psite预测结果显示,VscP含有3个N端糖基化位点,2个cAMP及c GMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点,5个蛋白激酶C磷酸化位点,9个酪蛋白激酶II磷酸化位点,2个N端豆蔻酰基化位点,1个酰胺化位点和3个微体C末端靶信号位点。运用MEGA6.0构建的VscP系统进化树显示,溶藻弧菌VscP与副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)聚为一簇。应用SWISS-MODEL软件构建VscP亚基三维结构模型发现,其与鞭毛Fil K蛋白有相似构型。     

哈维氏弧菌qnr基因的克隆及原核表达条件优化

根据Gen Bank中公布的哈维氏弧菌qnr基因序列设计引物扩增哈维氏弧菌qnr序列,将其插入p ET-32a质粒,构建原核表达载体p ET32-qnr,并对诱导温度、时间、IPTG浓度等条件进行优化。结果表明,哈维氏弧菌qnr全长651 bp,编码216个氨基酸;重组蛋白优化条件为于28℃、IPTG浓度为0.05 mmol/L条件下诱导6 h。     

溶藻弧菌HY9901血红素结合蛋白HutB的原核表达及纯化

为探究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901血红素结合蛋白HutB作为疫苗候选抗原的可能性,采用PCR方法扩增V.alginolyticus HY9901 hutB基因全长序列,克隆到pMD18-T载体,经双酶切、连接后,定向插入到pET-28a(+)中,构建原核表达载体pET-HutB,转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE验证后,优化诱导表达条件和纯化条件,并进行Western-blot分析。结果表明,HutB蛋白在E.coli中诱导表达的最优条件:0.4 mmol/L IPTG,37℃诱导4h,表达的蛋白分子量与预期大小相符,主要以包涵体的形式存在,300 mmol/L咪唑洗脱时效果最佳,能与鼠抗His-tag单抗特异性结合。     

溶藻弧菌二氢硫辛酰胺脱氢酶基因克隆及其生物信息学分析

根据溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)二氢硫辛酰胺脱氢酶(dihydrolipoamide dehydrogenase,DLD)的基因序列设计1对特异性引物。PCR扩增结果显示,DLD(GenBank登录号AGK62253)全长1 428 bp,共编码475个氨基酸残基。根据推导的氨基酸序列预测其分子质量约为50.998 ku,等电点为5.51。细胞定位、SignalP 4.0、TMHMM Server 2.0和SoftBerry-Psite预测结果显示,DLD位于细胞质中,在第29至30个氨基酸之间存在信号肽,不存在跨膜区,氨基酸序列含有1个Asn-糖基化位点、5个蛋白激酶C磷酸化位点、6个酪蛋白激酶II磷酸化位点等多个活性位点。系统进化树结果显示,溶藻弧菌DLD与副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)聚为一簇。用Kyte-Doolittle亲水性参数、Karplus-Schulz柔韧性参数、Emini表面可及性参数和Jameson-Wolf抗原性参数分别预测,DLD可能的B细胞抗原优势表位分别是第5~10、106~110、120~125、158~163和175~180区段。利用SWISS-MODEL软件,模拟DLD亚基三维结构模型,结果显示其与大肠杆菌(Escherichia coli)DLD蛋白有相似构型。Kegg分析发现,其涉及糖酵解和糖异生等9条信号通路。从生物信息学角度验证了DLD作为弧菌共同抗原的可行性。     

溶藻弧菌asp基因在大肠杆菌中表达活性研究及条件优化

为进一步研究溶藻弧菌碱性丝氨酸蛋白酶(ASP)蛋白生物学活性和功能,将构建的pET23d-asp在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,对表达产物进行纯化分析,并优化表达条件。结果表明:在咪唑洗脱缓冲液浓度为100 mmol/L时,表达的可溶性ASP被大量洗脱,纯化的ASP相对分子质量约为42 000,具有蛋白活性;在诱导温度28℃、异丙基-β-D硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)浓度1 mmol/L及诱导时间16 h时,表达的活性ASP蛋白最多。     

溶藻弧菌双组分调控系统PhoR/PhoB的基因克隆及生物信息学分析

双组分调控系统（Two-component Regulatory System）在致病菌的生长及毒力调控中起重要作用.克隆溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）HY9901 株组氨酸激酶PhoR 和反应调控因子PhoB 的全长基因,并对其进行生物信息学分析.序列分析结果显示,phoR（GenBank 登录号：KJ958404）全长1 299 bp,共编码432 个氨基酸;phoB（GenBank 登录号：KJ863646）全长690 bp,编码229 个氨基酸.构建PhoR/PhoB 的系统进化树,结果显示,溶藻弧菌PhoR/PhoB 与副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、哈氏弧菌（Vibrio harveyi）有较近亲缘关系.利用SWISS-MODEL 软件,对PhoR/PhoB 中两个相对保守的功能域HATPase_c 和REC 进行同源建模,发现HATPase_c具有1 个ATP 结合位点,REC 具有4 个天冬氨酸活性位点.     

无乳链球菌sodA基因的克隆、序列分析及原核表达载体构建

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)是引起我国南方罗非鱼链球菌病的主要病原之一,SodA是无乳链球菌重要的毒力因子之一。根据链球菌sod A基因保守区设计引物,采用PCR扩增sod A基因部分序列,反向PCR和巢式PCR扩增其侧翼序列,成功获得无乳链球菌sod A基因。无乳链球菌sod A基因序列全长为699 bp,含开放阅读框609 bp,可编码202个氨基酸,演绎的SodA蛋白主要由α螺旋和不规则卷曲构成。BLAST分析表明,该蛋白氨基酸序列与犬链球菌(S.canis)及副乳房链球菌(S.parauberis)相应蛋白的氨基酸序列相似性分别高达80%和79%。将sodA基因克隆至原核表达载体pET28a上成功构建了重组质粒p ET28a-sod A,导入Escherichia coli BL21(DE3),诱导表达的重组蛋白质分子质量约为24 ku,主要以包涵体形式存在于表达菌中。     

红笛鲷α-珠蛋白和β-珠蛋白基因的克隆及序列分析

应用已知的标签序列通过RACE-PCR和RT-PCR方法成功克隆红笛鲷(Lutjanus sanguineus)α-珠蛋白和β-珠蛋白基因的全长cDNA序列。α-珠蛋白和β-珠蛋白基因的cDNA全长分别为560和563 bp,开放阅读框分别为429和444 bp,各编码143和148个氨基酸,理论相对分子质量分别为15690和16400,理论等电点为7.79和6.61。氨基酸序列BLAST结果表明,红笛鲷α-珠蛋白基因和β-珠蛋白基因编码的氨基酸序列与其他鱼类的相似性分别在59%~79%和55%~80%之间。用邻接法(Neighbor-Joining)构建的α-珠蛋白基因和β-珠蛋白基因的系统发育树表明,红笛鲷与真鲷(Pagrus major)、金头鲷(Sparus aurata)和鰤(Seriola quinqueradiata)等亲缘关系较近。     

鲤JAK2基因分子克隆及组织表达分析

采用同源克隆策略和RACE-PCR技术,克隆得到可能的鲤(Cyprinus carpio)两面神激酶2(JAK2)基因的c DNA全长序列,包括3 378 bp的开放阅读框,732 bp的5'-非编码区,529 bp的3'-非编码区,总长度达4 639bp。开放阅读框可编码1 125个氨基酸,推测分子质量和理论等电点分别为129.33 ku和6.99。同源性分析显示,克隆的鲤鱼基因与斑马鱼(Danio rerio)JAK2同源性最高,其氨基酸序列同一性和相似度分别达89%和95%。结构域预测表明,所编码氨基酸序列包含FERM、SH2及两个酪氨酸激酶结构域,这4个结构域也保守地存在于其他脊椎动物的JAK分子中。高级结构预测显示,鲤JAK2主要包括α-螺旋(α-helix)、β-折叠(β-sheet)和连接环(loop)等3类结构元件。脊椎动物JAK分子系统进化树显示,JAK1、JAK2、JAK3和TYK2等4类JAK分子分别聚类,鲤JAK2处于JAK2支系中,与所有其他的鱼类JAK2聚为一大支,并与两栖类和哺乳类组成的另一大支构成姊妹群,表明它们具有共同的祖先基因,为直系同源关系。实时荧光定量PCR检测结果表明,鲤JAK2在皮肤中表达量最高,其次是肠、血液和脑,而在肌肉、鳃、头肾、心、肝、脾中表达量较低;鲤JAK3在脾中表达量最高,在其他组织中表达量均很低,甚至未检出。     

溶藻弧菌肽聚糖对凡纳滨对虾虾青素、免疫指标及保护率的影响

从溶藻弧菌中提取肽聚糖,以0.05、0.1、0.15 mg/mL 3种浓度为注射凡纳滨对虾后,测定血淋巴中的血细胞数目、酚氧化酶(PO)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮合成酶(NOS)的活性和虾青素的含量,探讨溶藻弧菌肽聚糖对凡纳滨对虾虾青素含量、免疫指标、免疫保护率的影响。结果表明:注射不同质量浓度的溶藻弧菌肽聚糖都对血清中的血细胞数目、PO、SOD、NOS活性影响显著(p值﹤0.05),对虾青素的含量影响极显著(p值﹤0.01);虾青素的含量与血细胞数目、PO、NOS活性变化趋势无明显的相似性,与SOD活性变化有相似的变化趋势;0.05 mg/mL组的免疫保护率为40%,0.1 mg/mL组为53.33%,0.15 mg/mL组为66.67%。溶藻弧菌肽聚糖可有效地增强凡纳滨对虾非特异免疫力,提高对溶藻弧菌的抗病力,虾青素含量与SOD活性的高低变化趋势相似。     

尼罗罗非鱼Galectin-3基因的原核表达与条件优化

【目的】对Galectin-3蛋白进行纯化,优化诱导相关表达条件,为大量获取罗非鱼Galectin-3蛋白提供方案。【方法】根据NCBI上已公布的罗非鱼(Oreochromismossambicus)Galectin-3基因序列,设计多对带Eco RI和Xhol酶切位点的引物,筛选出良性扩增引物,对罗非鱼cDNA经进行聚合酶链式反应(PCR)扩增、限制性快切酶双酶切、T4连接酶连接等步骤,构建罗非鱼Galectin-3基因的原核表达质粒pGEX-4T-Galectin-3,将重组质粒导入大肠杆菌BL21中,进行Galectin-3重组蛋白的表达。并比较不同的诱导温度、诱导时间、IPTG浓度条件下的表达效果,对Galectin-3蛋白表达最优条件进行筛选。【结果】构建了罗非鱼Galectin-3原核表达质粒,进行Galectin-3重组蛋白后发现37℃下,0.4 mmol/L浓度的IPTG诱导5 h即可诱导Galectin-3重组蛋白高效表达。免疫印迹结果显示,经蛋白纯化柱纯化后的pGEX-4T-Galectin-3重组蛋白可与GST-Tag单克隆抗体发生特异性反应,进而表明表达的重组蛋白是罗非鱼的Galectin-3蛋白。【结论】本研究成功构建了罗非鱼Galectin-3基因的原核表达载体,并确定了Galectin-3融合蛋白最适的表达条件:37℃下,0.4 mmol/L浓度的IPTG诱导5 h。     

马氏珠母贝热休克蛋白HSP60基因的克隆与表达分析

运用cDNA末端快速扩增（RACE）技术,克隆马氏珠母贝（Pinctadamαrtensii）热休克蛋白HSP60基因 cDNA全序列。序列全长2495坤,开放阅读框（ORF） 1734坤,编码577个氨基酸,预测的分子量约为61.79阳, 理论等电点为5.4905＇非翻译区（ 5＇UTR）长150坤, 3＇非翻译区（3＇UTR）长611 bp。同源性比对分析结果,马 氏珠母贝HSP60基因与与太平洋长牡妨（Crωsos仰a gIgω）和光滑双蹄螺（Biomphalaria glabrata）的同源性较 高,达到75%。氨基酸序列分析显示,马氏珠母贝HSP60氨基酸序列具有典型的rnt-HSP60特征序列、C-末端典型的GGM重复基序和一个ATP结合结构域。荧光定量数据分析发现,该基因在闭壳肌、外套腹、血淋巴、肝膜腺、性腺、躁、等6个组织中具有表达,在肝膜腺中表达量最高,腮中次之,而在血液和闭壳肌中仅有少量表达;在脂多糖剌激后,该基因表达水平上调,12 h后达到最大值,之后又逐渐下调,均高于对照组,差异具统计学意 义（P〈0.05）。     

尼罗罗非鱼补体3基因片段的原核表达及条件优化

【目的】补体3(Complement3,C3)在罗非鱼的抗病感染中有重要作用,研究C3基因判断原核表达及表达条件。【方法】根据NCBI中已公布罗非鱼补体C3的基因序列,选取C3基因片段,设计一对带有酶切位点的特异性引物,经连接、转化等后,使用限制性核酸内切酶EcoRI和XhoI对克隆成功的C3基因片段以及原核表达载体pGEX-4T进行双酶切,构建重组质粒pGEX-4T-C3,导入大肠杆菌进行原核表达,并优化表达条件,并对纯化目的蛋白进行Western Blot鉴定。【结果】C3基因片段的重组质粒pGEX-4T-C3构建成功。罗非鱼C3基因片段编码区长度为1 341 bp。获得的目的蛋白分子质量为75 ku,与预期结果相符。最佳诱导时间、浓度以及温度分别为4 h、0.2 mmol/L以及37℃;目的蛋白主要以包涵体的形似存在。重组蛋白可以与GST-Tag单克隆抗体特异性结合,说明成功获得罗非鱼C3片段的重组蛋白。     

马氏珠母贝PmFAMeT基因的克隆及表达

【目的】克隆马氏珠母贝(Pinctada martensii)法尼酸甲基转移酶(FAMe T)基因,并分析其在各组织中的表达。【方法】利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得马氏珠母贝FAMeT(PmFAMeT)基因的cDNA全长序列,利用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析PmFAMeT在马氏珠母贝不同组织中的表达模式。【结果与结论】PmFAMeT包含5′非编码区120 bp,3′非编码区968 bp和开放阅读框(ORF)1 536 bp,编码511个氨基酸。序列分析表明,PmFAMeT含有信号肽序列和跨膜结构域,并有WSC结构域、TSP1结构域和2个Methyltransf_FA结构域。将推导的PmFAMeT氨基酸序列与其他物种的FAMeT序列进行比对发现,不同物种的Methyltransf_FA序列同源性较高。PmFAMeT在马氏珠母贝的各个组织中均有表达,且在边缘膜、肝胰腺和性腺中的表达量显著高于其他组织。     

草鱼NEDD4结合蛋白基因1原核表达条件的优化及纯化

通过PCR方法克隆草鱼(Ctenopharyngodon idellus)NEDD4结合蛋白基因1(简称CiN4BP1)的开放阅读框(ORF)序列,将扩增产物与pET-32a(+)表达载体相连接,构建原核表达载体pET-N4BP1,对重组质粒进行酶切和测序鉴定,然后将其导入大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,检测该蛋白表达情况。SDS-PAGE分析表明,在温度为37℃,IPTG浓度为0.06 mmol/L,诱导时间为4 h时,N4BP1重组融合蛋白的表达量最高,蛋白分子质量为40.2 ku,与软件预测值大小相符,该蛋白主要以包涵体形式表达。利用His Trap HP亲和柱纯化目的蛋白;Western blot分析表明,N4BP1融合蛋白能与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性反应,说明该表达的蛋白为目的蛋白。