融合蛋白IL6-OmpW的质粒构建及表达纯化

以重组质粒pMD18-T/IL6和pMD18-T/OmpW为模板,分别扩增红笛鲷IL-6基因和哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因,运用PCR重叠延伸剪切技术,将IL-6和OmpW基因融合,将融合基因定向克隆到原核表达载体pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白高效表达,融合蛋白分子质量约为66.6 ku。优化后表达条件为温度37℃,IPTG浓度0.2 mmol·L-1,诱导时间5 h。用HisTrap HP亲和柱纯化重组蛋白,最佳咪唑洗脱浓度为400 mmol·L-1,纯化蛋白的质量浓度为480μg·mL-1。Western-blot分析显示,该融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异反应,表明目的蛋白得以正确表达。     

溶藻弧菌dtd基因的克隆及原核表达条件优化

根据NCBI数据库中已发表的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)全基因组序列合成一对特异性引物,应用聚合酶链式反应(PCR技术)扩增溶藻弧菌HY9001菌株dtd基因,将其定向克隆到原核表达载体pET-32a构建重组表达质粒pET-DTD,并对其进行诱导温度、诱导时间、诱导IPTG浓度等条件的优化,最后探究其纯化时最佳咪唑洗脱浓度。结果表明:DTD蛋白成功表达,且其以包涵体的形式存在,在诱导温度37℃、IPTG浓度0.1 mmol/L条件下诱导5 h表达量最高,纯化最佳咪唑洗脱浓度为150 mmol/L。     

哈维氏弧菌PspF基因的克隆及原核表达分析

【目的】对哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)ZJ0603的PspF基因进行克隆与原核表达分析,优化表达条件。【方法】克隆哈维氏弧菌菌株ZJ0603的FspF基因,对其编码蛋白进行理化性质、信号肽、亚细胞定位、二级结构及三级结构分析,构建表达载体pET28a-PspF,经BamHI和XhoI双酶切和测序鉴定正确后转入表达菌株大肠杆菌BL21,对表达重组菌株进行表达条件优化及Western Blot鉴定。【结果与结论】PspF基因的开放阅读框(ORF)全长为1 179 bp,编码336个氨基酸,分子质量为38.04 ku,理论等电点5.27,不稳定系数41.97,总平均亲水性-0.382,PspF蛋白整体表现为亲水性蛋白。成功构建含pET28a-PspF的表达菌株,其最佳诱导条件为37℃下异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)0.2 mmol/L诱导6 h,其表达蛋白为38 ku。Western Blot结果表明PspF重组蛋白成功获得,蛋白同源性高,具有作为抗弧菌病疫苗的潜力。     

哈维氏弧菌可视化LAMP快速检测方法的建立及应用

【目的】为加强对哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）的早期快速诊断和筛查,探究一种快速检测方法。【方法】以哈维氏弧菌外膜通道蛋白基因Toic为靶基因,以钙黄绿素为检测结果指示剂,通过对反应体系、反应时间和温度进行优化,并检测其特异性和灵敏度,建立一种针对哈维氏弧菌的可视化环介导等温基因扩增（LAMP）检测方法。【结果】该方法的检测时间最快为35 min,灵敏度为100 fg/mL,特异性强,与8种弧菌及金黄色葡萄球菌均无交叉反应。实用性检测结果显示,该方法可准确并特异性地检测到鱼体组织中感染的哈维氏弧菌。【结论】建立一种设备简单、操作简单、反应快速、特异性强、灵敏度高、结果可视化的哈维氏弧菌LAMP快速检测方法,且适用于石斑鱼（Epinephelus）感染哈维氏弧菌的早期快速诊断,为进一步推广该技术在石斑鱼及其他水生动物哈维氏弧菌感染监测中的现场大规模应用提供技术支撑。     

罗氏沼虾雌激素相关受体(ERR)基因原核表达与纯化

根据已知罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)雌激素相关受体基因序列(Gen Bank登录号KU899089),设计含有酶切位点的特异性引物,PCR扩增得1 374 bp的开放阅读框序列,构建原核表达载体p ET-32a-ERR,并优化诱导浓度、诱导时间、诱导温度等表达条件。结果表明,ERR蛋白在温度35℃、IPTG浓度0.1 mmol/L条件下,诱导4 h时表达量较佳。     

凡纳滨对虾烂尾病病原的分离鉴定及药敏分析

【目的】研究广东湛江地区凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)烂尾病主要病原及其药敏特征。【方法】从对虾病灶部位分离纯化细菌,用2株代表菌株对健康虾进行创伤浸浴感染试验,分析菌株形态特征、生理生化特征以及16S rRNA和HSP60基因序列,以哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)和坎氏弧菌(V. campbelli)溶血素基因特异引物扩增菌株基因组DNA,通过纸片扩散法测试菌株对17种药物的敏感性。【结果】从患病亲虾和养殖对虾分别分离获得编号2018B22和2018MZ1的代表菌,两株菌16Sr RNA和HSP60基因序列均与哈维氏弧菌最相似,且均可被哈维氏弧菌溶血素基因引物特异扩增,表型特征亦与哈维氏弧菌相近;两株菌均可引起凡纳滨对虾烂尾病,其中菌株2018B22的致病力较2018MZ1更强,而后者的耐药谱更广。【结论】湛江地区凡纳滨对虾烂尾病主要病原为哈维氏弧菌。     

溶藻弧菌胱硫醚-β-合成酶基因cbs的克隆、生物学信息分析及原核表达

提取溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的总DNA,克隆溶藻弧菌胱硫醚-β-合成酶基因cbs,对其进行生物信息学分析。结果表明,所克隆溶藻弧菌cbs基因的开放阅读框为1 095 bp,编码364个氨基酸。氨基酸序列比对发现,溶藻弧菌的CBS蛋白与其他弧菌的CBS相似性极高,与副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)CBS氨基酸序列相似性达98%;CBS蛋白质的二级结构为典型的"α+β"折叠模式,无跨膜结构及信号肽。构建cbs基因表达载体(p GEX-cbs)以表达重组蛋白,结果显示,cbs基因在大肠杆菌BL21中高效表达,可表达出分子质量约为66.4 ku的融合蛋白。对表达条件进行优化,发现在37℃、IPTG浓度0.6 mmol/L的条件下诱导5 h后,CBS蛋白的表达量较多,该蛋白主要以包涵体形式存在。     

红笛鲷CD40和去除信号肽CD40的原核表达

根据红笛鲷(Lutjanus sanguineus)CD40基因cDNA全长序列设计2对特异性引物,利用RT-PCR技术从红笛鲷头肾组织中扩增出CD40 ORF序列和去信号肽序列,分别与原核表达载体pET-32a(+)相连,构建原核重组表达质粒,命名为pET32-CD40和pET32-△CD40,并分别转化至大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导后,分别于54 ku和53 ku处有清晰的目的蛋白条带。融合蛋白的表达效率最佳的表达条件,pET32-CD40是诱导温度37℃,起始D(600nm)为0.4,IPTG浓度为0.08 mmol/L,诱导5 h;pET32-△CD40是诱导温度37℃,起始D(600nm)为0.6,IPTG浓度为0.10 mmol/L,诱导6 h。在各自优化的表达条件下,pET32-△CD40融合蛋白表达量较pET32-CD40融合蛋白高。RNAstructure软件分析发现,CD40的mRNA 5′端序列形成复杂且较为稳定的二级结构,不利于翻译的起始,表明信号肽序列的存在可能对CD40基因在原核细胞中的表达有一定的影响。     

溶藻弧菌asp基因在大肠杆菌中表达活性研究及条件优化

为进一步研究溶藻弧菌碱性丝氨酸蛋白酶(ASP)蛋白生物学活性和功能,将构建的pET23d-asp在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,对表达产物进行纯化分析,并优化表达条件。结果表明:在咪唑洗脱缓冲液浓度为100 mmol/L时,表达的可溶性ASP被大量洗脱,纯化的ASP相对分子质量约为42 000,具有蛋白活性;在诱导温度28℃、异丙基-β-D硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)浓度1 mmol/L及诱导时间16 h时,表达的活性ASP蛋白最多。     

眼斑拟石首鱼烂尾病病原菌的分离鉴定及灭活疫苗的免疫效果

从患烂尾病眼斑拟石首鱼(Sciaenops ocellatus)的溃疡处分离到一株优势菌So GZ1401,回归感染试验证实该菌是引起烂尾病的病原菌,对眼斑拟石首鱼的半致死量(LD50)为8.6×103 CFU·g~(-1);结合其形态学和生理生化特征及HSP60测序分析,鉴定为哈维氏弧菌(Vibrio harveyi);利用杯碟法研究其胞外产物性质,结果表明:其胞外产物具有淀粉酶、明胶酶、酪蛋白酶、卵磷脂酶、脂酶活性以及溶血活性,但无脲酶活性。药敏试验表明,该菌株对氟哌酸、恩诺沙星、氟苯尼考和复方新诺明等抗菌药有较高的敏感性。制备哈维氏弧菌灭活疫苗,采用注射和浸泡2种途径免疫眼斑拟石首鱼,测定受免疫鱼的血清抗体效价和疫苗对眼斑拟石首鱼的免疫保护率。结果显示,免疫组血清中的抗体效价水平均高于对照组,差异有统计学意义(P0.05),注射组和浸泡组的抗体效价最高值分别达718.4和128,哈维氏弧菌攻毒后免疫保护率分别为75.0%~86.7%和46.4%~56.7%。哈维氏弧菌灭活疫苗对眼斑拟石首鱼具有较好的免疫保护性。     

无单放货的表现形式及责任

无单放货频频发生 ,导致对承运人提出的索赔案件不断发生。文章拟从无单放货的表现形式入手 ,分析每一种形式中无单放货人的法律责任     

浅析湖南省第二次土地调查省级挂图编制方法

湖南省第二次土地调查工作先后历时3年,积累的数据成果能为相应专题地图编制提供数据基础。采用人工综合与计算机自动提取土地利用图斑,多种计算机自动综合相结合缩编基本农田要素,GIS空间分析方法进行耕地图斑坡度分级等关键技术,在多种专业制图软件相互配合下,将大比例尺的湖南省土地利用数据、基本农田数据、耕地坡度数据编绘成1∶80万湖南省土地利用现状图、湖南省基本农田分布图和湖南省耕地坡度分级图,能宏观、直观展示湖南省土地利用情况、基本农田分布情况和耕地坡度分级情况,更好为国土部门土地利用规划、基本农田保护与耕地潜力评价提供决策依据。     

应用AOP实现中间件的动态Reflection

结合AOP和元架构技术给出了一种对象动态自适应的解决方案，该方案基于分离关注原理并分两阶段。首先，确保系统需要动态自适应关注点被清晰的分离；然后使各自分离的关注点能够动态自适应。最后，给出了一个原型系统的初级框架。     

地理信息系统在物联网发展中的机遇

温家宝总理于2009年11月3日在人民大会堂向首都科技界发表了题为<让科技引领中国可持续发展>的讲话.温家宝总理指出:"使中华民族跻身于世界民族之林,必须依靠科学技术.历史告诉我们,科学技术决定民族兴衰和国家命运.信息网络产业是世界经济复苏的重要驱动力.全球互联网正在向下一代升级,传感网和物联网方兴未艾.     

THEORETICAL CALCULATION OF THE COEFFICIENT OF VISCOSITY OF WATER BY NONEQUILIBRIUM STATISTICAL MECHANICS OF SIMPLE LIQUID

The liquid state, especially water, has long been regarded as the most formidable problem in the field of statistical mechanics. The coefficient of viscosity of water is calculated using a simplified model based on the microstructure of water and methods similar to that used by Rice et al. (1961) who studied the non-equilibrium statistical mechanics of simple liquids, such as liquid argon. derived From the Liouville equation. This work's singlet and doublet equations are somewhat different From those derived by Rice et al. (1961) and solutions were obtained by the perturbation method. The calculated coefficient of viscosity of water at different temperature. using this method agree well with standard values.     

湖北省气象局网络安全系统设计

通过介绍湖北省气象局网络安全需求，分析了现有网络系统存在的安全弱点，利用目前主要的网络安全防御技术，设计了一个整体的网络安全系统，为湖北省气象局网络安全系统的后续建设和实施提供了具体的思路。     

中国省级行政区边界形状的GIS分析

本文借助GIS软件支持,计算了我国32个省的平面轮廓形状的分维、形状指数和紧凑度。结果表明,形状复杂(边缘复杂程度高,破碎度较大)的省(区)主要集中在东部及沿海地区;形状较紧凑的省(区)主要集中在西部地区,东部省与西部省的形状特征有较大差异。另探讨了各地区的地理气候环境和历史人文特征所致的主要原因,并初步分析了各特征对交通等组织的影响。     

ANALYSIS OF THE EXPANSION OF THE BUILT-UP AREA OF DALIAN CITY

With the astounding development and gradual improvement of remote sensing technology, as an advancedscience technology, it is used to provide multi-temporal, large scope real-time information for land-use dynamic change,and also is one of the best efficient methods for studying the earth resources and environment. Remote sensing image hasits characteristics of ample information and reflecting the objective realities. The paper uses multi-temporal TM images in1986, 1996 and 2000, and relevant statistic data to analyze land-use changes of Dalian City in Liaoning Province of Chi-na over ten years by means of the correlation analysis method. The results have shown that two methods could con-formably reflect the present land-use change. Urbanization is closely correlative to natural factors and economic develop-ment. Especially in recent 20 years, under the influence of the reform and open-up policy, Dalian, as a specific coastcity, is becoming an international metropolis.     

关于广元生态经济可持续发展的思考

对广元市经济发展和生态环境保护所面临的问题进行反思，从可持续发展的角度，提出了广元市经济发展的新模式－生态经济，对广元市实现经济与环境的双赢和跨越式发展提供有益的建议。     

断层相互作用的模拟研究

以库仑破裂应力变化计算为基础,研究断层的相互作用。从震源断层和投影断层两个角度出发,研究5种地震断层模型分别描述地震断层和投影断层时库仑破裂应力变化的分布特征,分析震源断层以及投影断层的不同滑动机制对库仑破裂应力变化分布的影响。分析发现,断层的相互作用与断层的滑动机制关系密切;走滑断层还与其左右旋有一定关系;除斜滑断层外,其他断层之间的相互作用呈现一定的对称关系。