雨生红球藻中crtO基因存在3个5’上游侧翼序列

在本研究中,我们首次通过基因组上游第一次步移克隆到了雨生红球藻中crtO基因的3个不同大小的5’上游侧翼序列1．1kb,1．9kb和2．2kb。利用生物信息学方法分别预测并比较了这3个不同大小的5’上游侧翼序列,结果发现,三者具有与高等植物相类似的顺式作用元件,如脱落酸反应元件（ABRE）、干燥或低温反应元件（DRE／C-repeat）、几种光反应元件（G1-box,GAG-motif,l-boxand ATC—motif）、热激反应元件（HSE）、机械伤害反应元件（WUN-motif）、生长素反应元件（TGA-element）、茉莉酸甲酯反应元件（TGACG-element）和反式作用因子MYB蛋白的结合位点（MBSandMRE）等等,但是三者并不具有典型的TATA框和CCAAT框。上述研究预示了雨生红球藻虾青素合成中crtO基因调控方式的多样化。     

玉米素和水杨酸对雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)生长及虾青素积累的影响

虾青素是一种具有强抗氧化活性的类胡萝卜素,而雨生红球藻是天然虾青素的主要来源。本文以雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)为材料,研究了植物激素玉米素和水杨酸对雨生红球藻的生长、虾青素含量及相关基因表达的影响。分别添加5种浓度的玉米素或水杨酸,结果发现0.05mg/L玉米素或25mg/L水杨酸处理5d后雨生红球藻虾青素积累最多。该浓度玉米素或水杨酸可显著提高光胁迫下藻细胞密度,最高分别达到3.4×10~5cell/mL和3.0×10~5cell/mL;同时玉米素与水杨酸组中虾青素含量显著上升,分别为1.7%和1.6%,比对照组分别增加29.2%和25.6%。玉米素缓解了高光逆境条件下光合作用基因——Rubisco大亚基(rbcL)及其活化酶(rca)、碳酸酐酶(ca)的下调表达,但对虾青素合成途径β-胡萝卜素酮化酶基因(bkt)的表达量没有显著影响;而水杨酸则相反,在胁迫后期不能缓解光合作用相关基因的下调表达,但可使bkt基因显著上调,最高可达对照组的2.5倍。本研究首次比较了玉米素和水杨酸对雨生红球藻生长和虾青素积累的影响,发现玉米素比水杨酸具有更好的促进雨生红球藻中虾青素积累的效果。     

microRNA介导雨生红球藻在高光胁迫下次级细胞壁形成和虾青素积累的分子机制

雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)是天然虾青素的最佳来源,它可以在高光胁迫等不利条件下转变成厚壁细胞并积累大量虾青素。然而,目前从微小RNA (microRNA, miRNA)层面来揭示在高光胁迫下雨生红球藻次级细胞壁形成和虾青素合成的机理研究尚未见报道。对高光处理下三个时间点的雨生红球藻样品进行microRNA测序,共鉴定出342个已知miRNA和283个新miRNA。在这625个miRNA中,其中有206个miRNA的表达量受高光影响,这些差异表达的miRNA的靶基因参与了淀粉与蔗糖代谢、甘露糖与果糖代谢、糖酵解和萜类骨架生物合成等重要代谢通路。结合转录组结果发现,高光胁迫下有6个miRNA调控了3个和次级细胞壁形成相关靶基因的表达,有5个miRNA调控了5个和虾青素生物合成相关靶基因的表达。以上结果揭示了雨生红球藻在高光下miRNA调控次级细胞壁形成和虾青素生物合成的潜在机制,为雨生红球藻虾青素的代谢工程奠定了理论基础。     

雨生红球藻cDNA表达文库的构建与初步分析

为了筛选雨生红球藻虾青素合成过程中的关键酶基因的反式调节因子基因,以雨生红球藻的绿细胞为材料,提取了高质量的总RNA,并分离纯化了mRNA,经过反转录后的得到cDNA,构建了以λ-ZAPExpress为载体的表达型cDNA文库。经检测,所构建的文库的滴度为5.1×105,重组率为100%。用PCR方法对文库的质量进行了鉴定,文库的平均插入片断的大小为1.7kb。雨生红球藻cDNA表达文库的构建为研究虾青素的代谢工程奠定了基础。     

雨生红球藻八氢番茄红素脱氢酶pds基因上游序列的分离和分析

在某些蓝藻、绿藻和高等植物中,八氢番茄红素脱氢酶是β-胡萝卜素合成过程中的一个关键酶之一,应用巢式PCR方法从雨生红球藻中克隆了八氢番茄红素脱氢酶基因约1kb的5’上游序列。通过生物信息学方法进行序列分析,发现pds基因上游序列中包含了一些可能的顺式元件,如ABRE调控元件、C-repeat/DRE调控元件等。同时,构建了由pds-启动子控制报告基因的重组载体,并转化到雨生红球藻细胞中,进行了报告基因瞬间表达的检测。结果表明,克隆的pds启动子区域具有启动子活性,可以驱使报告基因进行瞬间表达。     

褪黑素对雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)生理和虾青素积累的影响

本实验初步研究了不同浓度褪黑素(melatonin,MLT)对胁迫条件下雨生红球藻Haematococcus pluvialis LUGU生长、虾青素、相关生理指标及基因表达的影响。结果表明,10μmol/LMLT可显著提高藻细胞中虾青素产量(31.32mg/g),是对照组(13.27mg/g)的2.36倍;碳水化合物和蛋白含量同比提高了1.36、1.37倍。此外,虾青素合成相关基因pds和bkt的表达水平分别提高了5.79和12.16倍。研究表明,MLT可显著促进雨生红球藻中虾青素的积累,为利用微藻生产虾青素提供了一种有效的策略。     

不同碳氮浓度对雨生红球藻生长及虾青素累积的影响

研究了不同二氧化碳浓度和硝酸钾浓度对雨生红球藻生长及虾青素累积的影响。结果表明,较高浓度的CO2(600×10-6)能够显著促进雨生红球藻的生长、光合作用的进行和虾青素的累积。红球藻单个细胞内的虾青素含量随着培养液中硝酸钾浓度的降低而增加,绿色游动藻种和绿色不动藻种培养12 d后获得的最大虾青素值分别为10.93 pg/个和12.64 pg/个。连续通气是促进雨生红球藻生长及虾青素累积的一种有效碳源提供方式。     

IPP异构酶基因遗传转化对雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)虾青素含量的影响

采用RT-PCR技术, 从雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)中克隆出IPP异构酶基因(ipiHp1), 构建双元载体pCAMBIA3300-egfp-ipiHp1和基因枪转化载体pBlueScript SKⅡ-bar-egfp-ipiHp1, 利用根癌农杆菌侵染法和基因枪转化法, 将目的基因导入雨生红球藻中, 经过含50?g/mL草丁膦BBM培养基筛选得到阳性转化子。通过荧光观察报告基因egfp和PCR扩增分析, 证明ipiHp1基因整合到转化子的基因组中。生物量测定结果表明大部分转化子的生物量与野生型相似。虾青素含量测定发现, 农杆菌侵染法转化的转化子A3虾青素含量与野生型相比有显著变化, 平均值达到16.49mg/g, 与野生型相比提高了5.16%, 而基因枪转化法转化的转化子虾青素含量与野生型无显著性差异。     

LED灯的光照对雨生红球藻细胞生长及虾青素积累的影响

为提高雨生红球藻的生物量以及细胞内虾青素的积累量,通过不同光源、不同光照强度照射培养藻细胞。研究表明,在总光强为2500lx,红光与白光的强度比例为2:1时,雨生红球藻干重可以达到0.98g/L,比单独使用白光和红光照射下分别提高了36.11%和15.91%。在雨生红球藻转化产虾青素阶段,对比蓝光LED、目光灯以及两者的组合光源照射转化的结果,发现在总光强为7000lx,蓝光与白光的强度比例为3:1时,雨生红球藻中虾青素的积累量为39.79mg/L,明显高于单独使用白光与蓝光转化下的产量。     

稀土元素Ce对雨生红球藻生长及虾青素积累影响的研究

采用反相高效液相色谱分析法（RP-HPLC）研究了稀土元素铈（Ce^3＋）对雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）生长及虾青素积累的影响。结果表明,低质量浓度的Ce^3＋对微藻生长和虾青素积累均具有明显的促进作用,当Ce^3＋的质量浓度为0．1mgm时,对藻生长的促进效果最佳,细胞密度较对照组提高34％;当Ce^3＋的质量浓度为1mg/L时,虾青素质量分数可达到细胞干质量的3．2％,较对照组提高167％。此外,高质量浓度Ce^3＋的对雨生红球藻有抑制作用,当Ce^3＋的质量浓度高于40mgm时,红球藻的生长完全被抑制,虾青素质量分数也明显降低。     

利用雨生红球藻生产虾青素的研究进展

作为天然虾青素的最佳生物来源，雨生红球藻已成为近年来国内外微藻研究的热点之一．本文综述了国内外雨生红球藻培养及虾青素积累的研究进展，介绍了国外天然虾青素商业生产的现状，并对现存的主要问题和发展方向做出阐述，以期推动国内利用雨生红球藻生产虾青素的商业化进程。     

雨生红球藻和虾青素研究述评

虾青系作为食品和饲料色素添加剂有着广阔的应用前景,单细胞绿藻雨生红球藻在特定条件下可双大量积累虾青素,有可能成为该色素的良好天然资源,受到微藻学界的重视。但目前雨生红球藻培养还处于实验室阶段,大规模生产尚存在许多问题有待解决,我国这方面的研究处于起步阶段。为此通过微机查阅１９８１￣１９９７年的国内外发表的有关文献,结合我们的实验结果,从该藻的基础生物学特性、虾青素累积的机制、养殖现状进行了综述,并     

雨生红球藻的细胞周期初探

于１９９７年在青岛利用显微镜连续观察技术研究了雨生红球藻的细胞繁殖方式和动力学。结果表明,该藻细胞周期分为流动和不动２个阶段。每一阶段主要以无性生殖产生孢子的方式完成增殖。正常条件下游动细胞主要产生２、４个,偶尔产生２、４个,偶尔产生８个游动孢子,游孢子从孢子囊释放后为游动细胞。环境不适时流动细胞以及流动孢子失去鞭毛转入不动阶段。不动细胞主要形成４、８个,偶尔也能形成２０多个不动孢子,该过程不一定     

雨生红球藻脂肪酸组成和含量的气相色谱分析

以正十九碳酸(C19：0)为内标,用HCI-CH3OH溶液提酯化雨生红球藻后进行毛细管气相色谱分析。通过正交实验确定抽提和酯化雨生红球藻脂肪酸的最佳酯化酸度、超声破碎时间和水浴时间。该法对雨生红球藻游动细胞脂肪酸含量测定的相对偏差为0．4％～9．5％;对雨生红球藻孢子为3．0％～11．8％。仪器的检测限为0．942μg。结果表明,雨生红球藻绿色游动细胞的饱和脂肪酸组分主要是C16：0,含量为2．22％;不饱和脂肪酸主要有C16：1,C18：2,C18：1和C18：3,含量在0.764％～3．28％。雨生红球藻孢子中的饱和脂肪酸主要有C16：0和C18：0,含量分别为4．34％和0．477％;不饱和脂肪酸主要为C16：1,C18：2,C18：1和C18：3;含量在0．901％～8．20％。     

雨生红球藻铁型超氧化物酶基因的克隆与序列分析

利用已报道的FeSOD保守区域,设计简并引物,通过简并PCR的方法获得了雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)FeSOD(HpFeSOD)cDNA的部分序列,然后采用RACE方法分别克隆到5′端和3′端。拼接后得到HpFeSOD cDNA全长,该基因全长为1 138 bp,ORF为684 bp,编码227个氨基酸。把已经得到的HpFeSOD序列推导成氨基酸序列与一些已知物种的FeSOD氨基酸序列相比较,雨生红球藻FeSOD与杜氏藻、衣藻、团藻、石莼、颤藻的同源性为89%、83%、78%、70%和63%。分子系统学分析表明,雨生红球藻FeSOD与杜氏藻FeSOD聚在一起,介于真菌与高等植物之间并且真核微藻FeSOD与高等植物的同源性更高,推测其在进化上与高等植物的亲源关系更近。     

雨生红球藻细胞转化、虾青素积累与光照强度的关系及不同品系间的差异性

于2004年利用3个品系的雨生红球藻(H0、H2和H3)和以去除营养物质的藻液为实验对象,探讨了光强对细胞转化和虾青素积累的影响。结果表明,光照强度对红球藻虾青素积累和细胞转化有显著影响,并在品系间存在一定差异性。其中:品系H0在光强≤25000lx时虾青素积累量随光强的增加而增加,光强在20000～35000lx时虾青素积累量处于较高水平,而光照强度>35000lx时,虾青素积累量随光强的升高而下降;H2品系在光强≤25000lx时虾青素积累量随光强的增加而增加,光强在25000lx左右时虾青素积累量较高,当光强≥35000lx时,虾青素积累大幅度下降;H3品系在≤35000lx时虾青素积累量随光强的升高而增加,20000~45000lx为虾青素积累较适宜的光强,高于45000lx时虾青素积累量则明显下降。进一步分析得出,弱光导致红球藻虾青素含量较低是光照强度不足、细胞内虾青素含量少的结果,而强光下虾青素含量下降则是细胞受到损伤、细胞数量减少导致的。对比研究发现:在较低光强下(20000~25000lx)H2单个细胞内虾青素积累量略低于H0,但其积累虾青素总量却最高,这是由于此时H2不动细胞增长速率比其它品系高造成的,不过适宜H2积累虾青素的光照范围最窄,它对高光强的耐受性也最差;而H3在较低光强下虾青素积累总量及单个细胞内的积累速率均最低,但是它的适宜光照范围最宽,即对高光强的耐受性最强,在较大的光强波动范围内都可以保证较高的安全转化量,这就使得它在较高的光强下虽然单个细胞积累虾青素的速率仍然最低,积累总量反而显著高于其它两个品系。