一种甲壳动物血细胞分化因子性质的初步分析

血细胞是甲壳动物的免疫细胞,负责抵御和清除入侵的病原。虽然血细胞在甲壳动物的整个生命周期中都需要不断更新,但人们对甲壳动物造血机制的了解却十分有限。前期研究发现利用红螯螯虾的肌肉提取液可以诱导体外培养的造血组织细胞定向分化为颗粒细胞,但其中起到诱导分化作用的因子尚未明确。本研究对该未知血细胞分化因子的基本性质进行了分析。首先,我们制备了红螯螯虾（Cherax quadricarinatus）、中华绒螯蟹(Erinocheir sinensis)、东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis)、红石斑鱼(Epinephelus goreensis)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)和疣荔枝螺(Reishia clavigera)的肌肉提取液,测试其诱导螯虾造血组织细胞分化的能力。结果表明,以上各种动物的肌肉提取液均可诱导原代培养的螯虾造血组织细胞向颗粒细胞分化,说明该血细胞分化因子普遍存在于这些动物的肌肉组织中。进一步我们以螯虾肌肉提取液为实验对象,分析了血细胞分化因子的热稳定性、溶解性、带电性、对蛋白酶的耐受性以及分子量大小。结果发现该血细胞分化因子易溶于甲醇,呈电中性,具有良好的热稳定性,且可耐受蛋白酶处理,分子量小于1 kDa。因此,螯虾肌肉提取液中可诱导造血组织细胞分化为颗粒细胞的血细胞分化因子是一种广泛存在的小分子类物质。本研究结果有助于后续对该因子的分离纯化和鉴定。     

白斑症病毒(WSSV)对克氏原螯虾血细胞的感染规律

用WSSV粗提液注射感染克氏原螯虾,感染后每24 h采集螯虾血细胞。血细胞经与抗WSSV单克隆抗体及FITC标记的羊抗鼠抗体结合反应后,应用流式细胞仪检测WSSV对血细胞的感染,同时记录螯虾累积死亡率及血细胞密度。结果表明,感染WSSV后螯虾1~7 d的累积死亡率分别为3.3%,13.3%,16.7%,36.7%,70.0%,90%和100%;1~5 d血细胞被感染比例分别为6.47%,6.93%,10.65%,26.08%和4.94%;1~5 d被感染细胞的平均荧光强度分别为10.7,10.89,11.71,13.77和15.47;1~6 d血细胞密度分别为(7.56±0.30),(5.60±0.24),(4.21±0.30),(1.45±0.26),(1.21±0.21)和(1.14±0.18)×106个/mL,阴性对照组螯虾血细胞密度为(5.34±0.22)×106个/mL。可见,感染WSSV后螯虾血细胞密度呈现先升后降的趋势,至感染后第6天血细胞密度仅为对照组的21.3%;被感染血细胞内的病毒量始终呈上升趋势、达到最高感染率时螯虾处于濒死状态,表明血细胞的WSSV感染与螯虾死亡密切相关。     

白斑综合症病毒(WSSV)的宿主调查

用地高辛 (DIG)标记的WSSVDNA探针斑点杂交与原位杂交技术 ,在中国对虾、斑节对虾、南美白对虾、刀额新对虾、脊尾白虾、天津厚蟹、日本大眼蟹体内检测到了WSSV ,它们是WSSV的天然宿主 ;在经人工感染的哈氏美人虾、短脊鼓虾、克氏原螯虾、肉球近方蟹、滕壶体内检测到了WSSV ;在球形侧腕水母、病虾池的桡足类等浮游生物、卤虫无节幼体以及人工浸泡感染卤虫成体体内没有检测到WSSV。经原位杂交检测 ,虾类的甲壳下上皮、胃上皮、附肢、造血组织、鳃等组织器官均可被WSSV侵染 ,其中甲壳下上皮和鳃对WSSV敏感 ;蟹类的甲壳下上皮和鳃对WSSV敏感 ;在中国对虾、南美白对虾、脊尾白虾、注射感染的克氏原螯虾的精巢中 ,精荚的结缔组织细胞和血细胞呈阳性 ,在中国对虾、脊尾白虾以及注射感染的短脊鼓虾的卵巢中 ,结缔组织细胞和滤泡细胞被WSSV感染。     

红螯螯虾虹彩病毒在两种螃蟹内的研究

最近报道从患病的红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)中分离出一种新的虹彩病毒,被暂时命名为红螯螯虾虹彩病毒.它还能感染克氏原螯虾(Procambarus clarkii)和凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei),为了探究红螯螯虾虹彩病毒是否能够感染同属于甲壳纲、十足目的螃蟹.选取中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)和粗腿厚纹蟹(Pachygrapsus crassipes)作为实验对象,应用实时荧光定量PCR技术和透射电子显微镜技术,结论证明了红螯螯虾虹彩病毒能够感染中华绒鳌蟹和粗腿厚纹蟹.推测其他蟹类也可能是其潜在的宿主,这暗示着红螯螯虾虹彩病毒对螃蟹的养殖是一种潜在的威胁.     

对虾WSSV人工感染螯虾及其检测

用对虾白斑综合症病毒（WSSV）人工感染淡水克氏原螯虾（Procambarus clarkii),感染组螯虾3-6d内全部死亡,核酸探针点杂交两次检测感染螯虾的鳃、胃、血淋巴,阳性检出率分别为92%（92%）,89%（86%）,81%（75%）,对照为11%（3%）,3%（5%）,0（0）;光镜下可观察到感染螯虾的胃、鳃组织的靶细胞核肿大,嗜酸性着染,电镜下病变组织细胞核可见形态大小与WSSV一致的病毒粒子;病毒核酸原位杂交两次检测感染螯虾的胃、鳃、阳性检出率均为100%,对照阳性检出率均为0。结果表明：对虾WSSV可感染淡水克氏原螯虾,病毒核酸原位杂交是一种敏感特异的病毒检测方法。     

基于图像识别的5个不同产地克氏原螯虾(Procambarus clarkii)形态差异分析

为了解江苏、江西、湖北、上海、河南5个地区克氏原螯虾（Procambarus clarkii）的形态差异和获取快速、有效的形态鉴别方法,本研究采用传统形态测量法和地标点法来分析各产地形态差异。结果显示：（1）克氏原螯虾雌雄群体相对扭曲主成分分析,前三个主成分累计贡献率分别为79.96%、67.21%,传统形态测量法前三个主成分累计贡献率分别为76.77%、82.70%,两种方法均表明其形态差异主要体现在头胸甲及腹部部位;（2）聚类分析将克氏原螯虾5群体聚为两支,上海、河南、江西、湖北群体聚为一支,江苏群体单独聚为一支。（3）地标点法雌雄群体综合判别准确率分别为100%、94%,传统形态测量法综合判别准确率均为56%。以上研究结果表明不同产地间克氏原螯虾具有一定的形态差异,且地标点法区分不同产地克氏原螯虾群体差异性效果显著,这将有利于克氏原螯虾生产和选育过程中群体的鉴别及外形特征的快速获取。     

利用实时荧光定量PCR法测算红螯螯虾实体组织的细胞数量

螯虾是重要的水产养殖动物,也是研究甲壳动物疾病与免疫的一个良好模型.在研究不同组织的功能及受病原感染的影响时,需要了解组织内的细胞数量.但是,目前常用的细胞计数方法仅适用于单细胞悬液,无法用于实体组织.本研究以红螯螯虾( Cherax quadricarinatus)为对象,建立了基于基因拷贝数定量分析的实体组织细胞数...     

甲壳动物JAK/STAT信号通路在免疫应答中的功能与调控机制

先天免疫是宿主抵抗病原感染的第一道防线,在病原的传播和疾病的发展过程中发挥重要的作用。甲壳动物属于无脊椎动物,仅具有先天免疫,而不具备适应性免疫,其主要依靠细胞免疫和体液免疫来实现免疫防御功能,抑制病原体增殖。JAK/STAT途径是调节无脊椎动物免疫反应的主要途径之一,本文主要从细胞因子受体(Dome)、JAK酪氨酸激酶(JAK)、信号传导及转录激活因子(STAT)、调节因子的结构、在宿主体内的表达及发挥的功能等来综述在养殖甲壳动物中JAK/STAT信号通路的研究现状。目前已在对虾、螯虾和蟹等近十种甲壳动物中报道了此通路的元件,而且各元件均具有保守的典型结构域,同类元件在不同种类甲壳生物中的结构有所差异,但是功能基本相似。这些元件均被证实通过调节JAK/STAT通路的信号转导来影响抗病能力。目前仅在凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）中鉴定出JAK/STAT信号通路的所有元件,对其他甲壳动物中剩余元件的鉴定仍有必要,并且甲壳动物JAK/STAT信号通路对其他信号通路的影响还有待深入研究。通过本文希望能为该通路在甲壳动物中调控机制研究提供理论基础和参考。     

流式细胞术检测对虾白斑症病毒(WSSV)对克氏原螯虾血细胞的感染

用WSSV粗提液人工感染克氏原螯虾,感染后分别在6,12,18,24 h采血分离血细胞,通过WSSV的混合单抗和FITC标记的羊抗鼠二抗的间接免疫荧光染色,应用流式细胞仪检测病毒对克氏原螯虾血细胞的感染并分析感染强度.结果表明:分离获得的血细胞形态完好,感染后血细胞内的病毒被标记上了绿色荧光;流式检测发现,随感染时间延长,被感染细胞的百分率及平均荧光强度均逐渐升高,反映血细胞的病毒感染程度逐渐加深;PCR检测同时证实人工感染后各采样点血细胞样品均为WSSV阳性.     

凡纳滨对虾对东北碳酸盐型盐碱水域的适应能力

通过急性毒性实验,研究碳酸盐碱度对淡化凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)幼虾的毒性效应及其在碳酸盐型盐碱水域的生存能力。结果表明,在pH为7.12~8.14时,碳酸盐碱度对幼虾的24 h半有效浓度(EC50)为2.73 mmol/L。在pH为8.11~8.72时,碳酸盐碱度对幼虾的24,48和96 h的半致死浓度(LC50)分别为12.40,11.24和10.49 mmol/L,安全浓度(CS)为2.77 mmol/L。幼虾在碳酸盐型盐碱水域存活时间近9 h。高碱度K 的质量浓度低、Na 与K 的质量浓度比较高是碳酸盐型盐碱水域养殖凡纳滨对虾的主要障碍。     

感染溶藻弧菌及白斑综合症病毒后凡纳滨对虾不同组织的Toll样受体基因表达变化研究

为研究不同类型Toll样受体基因在凡纳滨对虾免疫调控机制中的作用,实验首先通过荧光定量PCR方法检测了凡纳滨对虾3种Toll样受体基因在不同组织中的表达情况。结果表明凡纳滨对虾3种Toll样受体基因m RNA在各组织中均有表达。其中,Toll1基因在肌肉,血淋巴,心脏和鳃均有较高表达,心脏表达量最高;Toll2基因在血淋巴,心脏和鳃均有较高表达,其中在鳃表达量最高;Toll3基因在鳃和心脏有较高表达,其中在鳃表达量最高。实验还对人工感染溶藻弧菌及白斑综合症病毒后凡纳滨对虾3种Toll样受体基因在不同免疫组织的表达变化差异进行研究。感染白斑综合症病毒后凡纳滨对虾血淋巴及鳃中3种Toll样受体基因表达量均显著提高,并在各自达到表达峰值后逐渐下降直至恢复到感染前水平。感染溶藻弧菌后凡纳滨对虾血淋巴中3种Toll样受体基因表达量均显著提高;鳃中Toll1及Toll3表达量分别于感染后3h和12h有显著提高,而Toll2表达量无显著提高。由此推测3种Toll样受体基因均可能参与白斑综合症病毒感染所引起的免疫调控;而在溶藻弧菌感染所引起的免疫调控中,除了Toll1,Toll3参与鳃的免疫调控外,Toll2基因还参与血淋巴中的先天性免疫调控。长期感染白斑综合症病毒或溶藻弧菌后,凡纳滨对虾3种Toll样受体基因在血淋巴与鳃中的表达量均显著升高,这可能与虾体在长期感染过程中,需要不断保持较高免疫水平有关。     

钻井液特征污染物的毒性评估和海洋测试生物的适用性比较

随着海上钻井数量的逐年增加、钻井液的使用量迅速增加,与之相关的环境危害引起了广泛关注,因此有必要筛选合适的毒性测试生物和开发环境友好的钻井液。本研究中,按照ISO11348-1(2007)、GB/T21805-2008和GB/T18420.2-2009的毒性测试方法,采用标准的海洋测试生物:发光细菌(Vibrio fischeri)、牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)、诸氏鲻虾虎鱼(Mugilogobius chulae)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、卤虫(Artemia)、蒙古裸腹溞(Moina mongolica),研究了钻井废液特征污染物(苯酚、七水硫酸锌、氯化汞)以及参比毒物十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate, SDS)的急性毒性效应。结果表明,钻井液特征污染物对6种海洋生物的急性毒性效应有所不同:Hg²⁺对海洋生物表现为极高毒性, Zn²⁺、SDS表现为中、高毒性,苯酚表现为中、低毒性; 6种海洋生物对4种特征污染物的敏感性顺序为:蒙古裸腹溞>诸氏鲻虾虎...     

基于三代测序技术的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)高通量候选基因关联分析方法的建立

凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)是世界也是我国的主导对虾养殖品种,产业的发展离不开良种的支撑,分子育种被认为是加快良种选育的最有效途径,而目标性状相关分子标记的开发是发展分子育种的基础。研究主要目的是建立一种适用于凡纳滨对虾等水产经济物种的高通量候选基因关联分析方法,并在抗弧菌相关标记筛选中进行应用。首次将三代靶向测序技术用于对虾候选基因的基因分型,在抗弧菌性状候选基因LvPI3K的全长序列上发掘到91个SNP位点,通过关联分析鉴定到21个与抗弧菌性状显著相关的SNP标记(P0.05),利用Sanger测序证实了三代靶向测序技术分型结果准确可靠。所建立的基于三代测序的靶向分型方法为凡纳滨对虾等水产动物提供了一种高效、低成本的基因分型方法,所发掘的抗弧菌性状相关位点对开展凡纳滨对虾抗弧菌性状分子育种具有一定指导意义。     

水产品主要过敏原的模拟胃液消化实验的条件优化

采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western blot）方法,通过体外模拟消化实验分析水产品主要过敏原原肌球蛋白（Tropomyosin,TM）和小清蛋白（Parvalbumin,PV）的消化特性,主要研究酶/蛋白的比值、pH值对模拟胃液（SGF）消化过敏蛋白稳定性的影响。结果表...     

福建漳浦凡纳滨对虾海水养殖中后期水体细菌群落多样性分析

为分析凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）海水养殖过程中水体细菌群落多样性变化,本研究采用Illumina测序技术对福建漳浦县凡纳滨对虾海水养殖中后期水体样品进行16S rRNA基因高通量测序,同时进行水质参数测定。结果表明,养殖过程中,氨氮（NH₄+-N）、化学需氧量（COD）值波动较大,其他水质参数值波动较小。检测到的细菌种群归属于19个门、35个纲、80个目、135个科、254个属,说明该养殖水体中细菌群落具有高度的多样性。变形菌门和拟杆菌门是养殖期间主要优势类群,不同养殖时期细菌组成存在一定的波动,但没有明显的变化规律。蓝细菌在第67天、115天表现出高丰度,且其丰度在养殖期间变化较大（比例变化为0.7%~63.9%）。此外,益生菌和潜在致病菌丰度在养殖期间很低。冗余分析（Redundancy analysis,RDA）表明,对细菌群落影响最大的水质因子是化学需氧量与硝酸盐浓度比值（COD/NO₃-）和COD;降低溶氧可以增加细菌丰富度。总之,本研究初步揭示了对虾养殖中后期水体微生物的演替规律,发现水质因子对养殖水体微生物组成具有显著影响,研究结果为凡纳滨对虾健康养殖提供一定的参考意义。     

短角异剑水蚤对克氏双锯鱼稚鱼成活、生长和脂肪酸组成的影响

为评估短角异剑水蚤(Apocyclops royi)作为海水鱼类仔稚鱼的饵料价值和投喂效果,比较分析了其与卤虫无节幼体(Artemia nauplii)的脂肪酸组成及2种生物饵料对克氏双锯鱼(Amphiprion clarkii)稚鱼存活、生长和脂肪酸组成的影响。结果显示,短角异剑水蚤DHA、EPA和ARA含量分别达21.185%、11.088%和3.250%,海水仔稚鱼必需脂肪酸(EFA)总含量高达37.417%,均显著高于卤虫无节幼体。投喂短角异剑水蚤的克氏双锯鱼稚鱼(5~20 d)成活率(80.71%±8.23%)与投喂卤虫无节幼体组(76.30%±7.00%)差异不显著;稚鱼体长(7.75 mm±1.18 mm)、体重(0.0163 g±0.0080 g)和体长特定生长率(3.46%±0.75%)均显著高于卤虫无节幼体投喂组;稚鱼体内DHA(21.843%)、EPA(6.914%)和ARA(2.725%)含量也均显著高于后者。研究表明,短角异剑水蚤适于作为海水鱼类仔稚鱼的生物饵料,在水产养殖中具有广阔的应用前景。     

不同光源及光照时间对凡纳滨对虾生长的影响

以黑暗条件作为对照,研究了白炽灯、日光灯、金卤灯作为照明光源及不同光照时间对凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)生长的影响。实验对虾初始平均质量为2.108g±0.036g(均值±标准误),投喂的饲料为海跃牌全价人工配合饲料,实验持续50d。结果表明:(1)凡纳滨对虾在金卤灯照明的条件下生长最快(P<0.05),在日光灯的连续照明下生长最慢(P<0.05),在其他的光照条件下与黑暗对照的情况下其生长没有显著差异(P>0.05)。其中,金卤灯照明条件下凡纳滨对虾的特定生长率比日光灯连续照明时要快55.89%。(2)具昼夜节律日光灯、15W白炽灯照明及15W连续照明的条件下,凡纳滨对虾的摄食率与黑暗对照组无显著差异(P>0.05),在日光灯连续照明时其摄食率显著低于黑暗对照组(P<0.05),在200W白炽灯及金卤灯照明时凡纳滨对虾摄食率显著高于黑暗对照组(P<0.05),但黑暗对照组的摄食率并不是零;说明视觉虽不是凡纳滨对虾主要觅食手段,但视觉是其辅助觅食手段。(3)在具昼夜节律低功率白炽灯照明、高功率白炽灯及日光灯持续照明的条件下,凡纳滨对虾的食物转化率较低(P<0.05)。其他光照条件下凡纳滨对虾的食物转化率与黑暗对照无显著差异(P>0.05),但以金卤灯照明条件下食物转化率最高。(4)研究表明,凡纳滨对虾在金卤灯照明时具有较高的生长速度缘于其较高的摄食率和食物转化率;在日光灯持续照明的条件下,凡纳滨对虾的摄食率和食物转化率均较低,因而此条件下凡纳滨对虾生长得较慢。因此,进行对虾室内养殖时,金卤灯是首先的照明光源,而日光灯作为照明光源是不适宜的。     

翡翠贻贝幼体附着和变态的离子控制

于１９９３年５－１２月在厦门大学海滨实验场,以人工培养的悲翠贻贝幼体作为实验材料,在人工海水中添加３－１５ｍｍｏｌ／Ｌ     

酸性电解水的减菌化参数对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肌肉生化特性的影响

以肌动球蛋白含量、Ca2+-ATPase酶活性、总巯基活性(T-SH)和活性巯基(A-SH)含量为考察指标,研究了用不同pH的酸性电解水、以不同的时间对凡纳滨对虾进行减菌化处理后,对虾肌肉的生理特性及肌肉品质的变化。结果表明:电解水的酸性越强、处理时间越长,对虾的肌动球蛋白、T-SH和A-SH的含量越低,Ca2+-ATPase的酶活越小。当对虾在pH分别为2.62、3.18、4.06的酸性电解水中处理60min后,肌动球蛋白含量分别损失了98.7%、90.0%、73.7%,Ca2+-ATPase的失活率分别为93.4%、87.8%、84.3%,T-SH含量分别减少了57.8%、42.3%、40.3%,A-SH含量分别减少了77.8%、65.9%、30.7%。说明酸性电解水的减菌化条件对虾肉的生化指标影响显著。