对虾白斑综合症病毒极早期基因启动子筛选文库的构建

对虾白斑综合症病毒（white spot syndrome virus,WSSV）是危害对虾养殖业的主要病原,而WSSV极早期基因对病毒功能基因的转录翻译和调控起着至关重要的作用.本研究将WSSV基因组以超声法随机断裂至400～900bp DNA片段,并插入启动子缺失且多克隆位点下游具有报告基因的载体来构建文库,转染昆虫细胞Hi5.倒置荧光显微镜观察发现部分转染后的细胞有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的表达,表明这部分细胞中的DNA片段可能具有极早期启动子活性.流式细胞仪分析显示,这部分荧光细胞占总细胞的比例为0.35%.由于转染效率为50%,可认为占比0.7%的WSSV基因组随机片段能在Hi5细胞中激发下游报告基因的转录翻译,可能具有极早期基因启动子活性.这对于进一步筛选和鉴定WSSV极早期基因及开展极早期启动子研究具有重要的意义.     

对虾白斑综合症病毒核衣壳蛋白WSV308的鉴定

结合SDS—PAGE电泳和质谱分析，发现了一分子量为51kDa的蛋白，它是对虾白斑综合症病毒基因ORFwsv308的表达产物．将wsv308克隆到pET—His表达载体，以E．coliBL2l为宿主菌，成功表达并纯化目的蛋白后制备抗体。Western blot实验中蛋白特异抗体只与完整的病毒和核衣壳裂解蛋白中的WSV308反应，而不和膜蛋白反应，证明wsv308所编码的蛋白在完整病毒颗粒上定位于核衣壳．免疫电镜定位中金颗粒只特异地标记在核衣壳表面上，不存在于完整病毒表面上．     

白斑综合症病毒的生物学特性

白斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）是第一个测得基因组序列的海洋生物病毒 ,也是迄今已知的最大动物病毒［１］。该病毒遍及亚洲主要对虾养殖国家和地区 ,并已传播到中美洲和南美洲 ,给对虾养殖造成了巨大的损失。自１９９３年以来随着病毒学的发展以及现代分子生物学技术在对虾病毒研究领域的广泛应用 ,国内外学者对白斑综合症病毒的研究和认识也愈来愈深入 ,取得了一些突破性的进展。根据近１０ａ的文献资料 ,本文对白斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）的生物学特性进行综述 ,以期为深入开展白斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）的研究提供参考。１白斑综合症病毒…     

对虾白斑综合症病毒透射电镜分析中病毒固定条件的优化

电镜观察是研究对虾白斑综合症病毒(WSSV)形态和结构的重要手段.本研究采用不同浓度的多聚甲醛和戊二醛对纯化的WSSV粒子进行固定,从中寻找最优的固定条件用于病毒的透射电镜(TEM)分析.实验结果显示,经过多聚甲醛或者戊二醛固定的WSSV粒子对吸附、染色等实验操作的耐受性较未固定样品有显著提高,在制样过程中没有发生明显的结构破坏.其中1.00％ (V/V)多聚甲醛常温固定20 min对WSSV粒子的结构保持得最好.进一步地分析表明,1.00％多聚甲醛固定后的病毒粒子更有利于金标免疫电镜的研究.     

温度影响对虾白斑综合症病毒增殖机制的研究

已有文献报道温度是影响虾类感染对虾白斑综合症病毒(WSSV)的重要因素但并不清楚其机制.在本实验中我们通过定量检测病毒拷贝数后发现环境温度与病毒增殖速度有相关性.当温度在21～30℃之间时病毒增殖速度最快,病虾于感染后6～8d全部死亡而高温(33℃)及较低温度(15 ～ 18℃)对病毒的增殖均具有一定的抑制作用,虾存活时间超过了14 d;当温度降至12℃或8℃时病毒增殖受到明显抑制,虾存活时间长达40 d.通过激光共聚焦显微镜观察进一步发现病毒进入宿主细胞的能力与温度密切相关,高温(33℃)和低温(12℃)下病毒进入细胞的数量明显比27℃时少;而通过对病毒iel和up28基因的转录分析发现与27℃相比,高温(33℃)和低温(12℃)明显改变了病毒基因的转录.本实验结果表明温度影响WSSV基因组的复制、转录及病毒入侵细胞的能力从而导致了病虾死亡时间上的差异.     

白斑综合症病毒(WSSV)感染对虾的途径及滴度研究

本研究利用荧光定量PCR技术,开展了白斑综合征病毒(WSSV)感染途径及染病最低病毒浓度的研究.用病毒分别感染对虾的口腔、鳃、背部甲壳和腹部软壳24 h后,利用qPCR测定血液中的病毒拷贝数,结果显示病毒主要通过口腔和鳃入侵宿主,并通过血液循环进行全身感染,但病毒不能穿过对虾的体表引起感染.此外,将对虾分别放在含不同病毒粒子浓度(101、102、103、104、105个/dm3)或含核衣壳的海水中培养,发现当海水中病毒粒子浓度低于102个/dm3时,对虾没有感染病毒,当浓度达到103个/dm3以上时能引起对虾感染.结果暗示103个/dm3是引起对虾感染的最低病毒粒子浓度,而核衣壳则不具有感染性.     

对虾白斑综合症病毒基因组同源重复区结合蛋白的筛选

对对虾白斑综合症病毒（WSSV）基因组序列分析发现，基因组3％的区域均匀分布有与昆虫杆状病毒类似的9个同源重复区，很可能具有昆虫杆状病毒同源重复区参与病毒复制起始或转录调控的功能．以WSSV基因组同源重复区中一个包含高度保守结构域的小重复片断DNA（210bp）作为配体，利用WSSV基因组噬菌体展示库，经过5轮淘选出一个可与DNA特异结合的重组噬菌体克隆，包含的外源DNA片断长度为306bp．通过与WSSV基因组序列对比，发现该序列为WSSV的ORFs中wsv 021的5’端部分．推测wsv 021是一个可能与病毒复制或调控相关的重要功能基因．     

对虾白斑综合症病毒膜蛋白VP41A的功能研究

对虾白斑综合症病毒（WSSV）是对虾养殖的主要病害之一,在虾养殖业中造成了严重的损失．本研究从WSSV基因组中克隆到vp41a基因,大小约为900bp,发现该基因编码蛋白VP41A．通过构建重组质粒pET．His一卅J0表达了重组蛋白VP41A,大小约为43kDa．并通过Ni一琼脂糖珠交联下拉实验,在虾血细胞中找到一个能与VP41A相互作用蛋白,质谱分析发现该蛋白为细胞粘连蛋白,说明在WSSV感染宿主细胞的过程中蛋白VP41A可能发挥重要作用．本研究结果推动了WSSV与宿主对虾相互作用的研究,有利于探索病毒复制或转录的关键蛋白,为最终的病毒防治及快诛诊断提供科学依据．     

白斑综合症病毒(WSSV)的宿主调查

用地高辛 (DIG)标记的WSSVDNA探针斑点杂交与原位杂交技术 ,在中国对虾、斑节对虾、南美白对虾、刀额新对虾、脊尾白虾、天津厚蟹、日本大眼蟹体内检测到了WSSV ,它们是WSSV的天然宿主 ;在经人工感染的哈氏美人虾、短脊鼓虾、克氏原螯虾、肉球近方蟹、滕壶体内检测到了WSSV ;在球形侧腕水母、病虾池的桡足类等浮游生物、卤虫无节幼体以及人工浸泡感染卤虫成体体内没有检测到WSSV。经原位杂交检测 ,虾类的甲壳下上皮、胃上皮、附肢、造血组织、鳃等组织器官均可被WSSV侵染 ,其中甲壳下上皮和鳃对WSSV敏感 ;蟹类的甲壳下上皮和鳃对WSSV敏感 ;在中国对虾、南美白对虾、脊尾白虾、注射感染的克氏原螯虾的精巢中 ,精荚的结缔组织细胞和血细胞呈阳性 ,在中国对虾、脊尾白虾以及注射感染的短脊鼓虾的卵巢中 ,结缔组织细胞和滤泡细胞被WSSV感染。     

高位池养殖对虾携带白斑综合症病毒变化

采用实时荧光定量 PCR 技术研究6口高位池塘斑节对虾和凡纳滨对虾携带WSSV变化,结果表明:养殖过程中凡纳滨对虾WSSV携带量最高为9.7×105拷贝/g;斑节对虾最高携带量为9.5×105拷贝/g.凡纳滨对虾WSSV感染率分别为:苗种没有携带WSSV;30d为80.0%;60 d为90.O%;90 d为90.0%;120 d为93.3%,斑节对虾潜伏感染率分别为:苗种没有携带WSSV;30d为73.3%;60d为83.3%;90d为90.O%:120d为96.7%.     

白斑综合症病毒囊膜蛋白VP28单链抗体的酵母表面展示及其抗病毒特性的初步研究

白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是对虾养殖业中危害最大的病原微生物之一,对对虾养殖业造成了巨大的经济损失,但目前尚无有效防治手段.本研究从WSSV囊膜蛋白VP28免疫的小鼠细胞中分别扩增到重链可变区基因和轻链可变区基因,大小为351 bp和342 bp.两基因序列通过Linker序列连接后,构建到酵母表面载体pYD1中,得到重组质粒pYD1-vp28scfv.将该重组质粒在酿酒酵母EBY100中诱导表达,通过免疫荧光实验发现,重组蛋白VP28scFv在酿酒酵母EBY100表面实现展示.进一步通过结合实验表明该展示蛋白具有WSSV的结合活性.本研究在结合酿酒酵母可作为饲料添加剂的特性基础上,对WSSV囊膜蛋白VP28单链抗体的抗病毒特性进行了应用,从而为WSSV的防治提供了新思路.     

套式PCR检测斑节对虾白斑症病毒(WSSV)

解剖患白斑症斑节对虾的鳃组织 ,制备成不同稀释倍数的模板 ,对其进行白斑症病毒 (WSSV)的 PCR扩增 ,结果显示所建立的套式 PCR的灵敏度大约为一步 PCR的 10 4 倍 ;对感染病毒后不同时期的斑节对虾进行 PCR检测 ,发现感染早期经一步 PCR检测为 WSSV阴性的样品 ,套式 PCR的检测结果为阳性 ;对发病虾塘中的几种甲壳类动物进行 PCR检测 ,发现经一步 PCR检测为阴性的长臂虾、秉氏厚蟹和褶痕相手蟹等宿主 ,套式 PCR的检测结果为阳性。表明所建立的 WSSV套式 PCR检测法较普通的一步 PCR有更大的应用价值和意义     

白斑综合症病毒基因组同源重复区结合蛋白WSSV021的鉴定

利用噬菌体展示技术,发现wssv021是与病毒基因组同源重复区中一个包含高度保守结构域的小重复片断DNA结合的蛋白质的编码基因,可能参与病毒复制或调控.时相转录分析发现,wssv021属于病毒感染的早期基因.将wssv021基因克隆到pQE-30表达载体,在E.coliXL1-Blue中进行融合表达.凝胶阻滞分析显示,体外表达的（His）6-WSSV021蛋白可以和同源重复区中小重复片断DNA特异性相互作用.     

对虾白斑综合征病毒(WSSV)宿主研究进展

对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)自1992年暴发以来,已在世界范围内传播开来,每年给对虾养殖业造成巨大经济损失,至今仍未得到完全控制。本文根据1995～2005年的有关文献资料,综述了对虾白斑综合征病毒宿主方面的研究进展。     

Construction of white spot syndrome virus (WSSV) whole genome phage display library

A rebuilt vector pCANTAB 5 EE was obtained by inserting a 34 bp double-stranded oligonucleotide which contained a EcoRV recognition sequence into pCANTAB 5 E. White spot syndrome virus (WSSV) genome DNA was fragmented by sonication to isolate fragments mainly in the range of 0.8~2.0 kb, then the fragments were blunt-ended with T4 DNA polymerase and cloned into the EcoRV site of pCANTAB 5 EE. The primary recombinant clone of the library was 3.0×105. Colony PCR of random selected recombinants showed that the size of the inserts was 0.12~1.77 kb. After the whole library recombinant phages infected Escherichia coli HB2151 cells, the extracellular and periplasmic extracts were dropped on PVDF membranes to perform dot blot, using polyclonal mouse anti-VP24 serum, anti-WSV026 serum, anti-WSV063 serum, anti-WSV069 serum, anti-WSV112 serum, anti-WSV238 serum, anti-WSV303 serum and anti-VP26 serum as the primary antibody, respectively. The results showed that the display library could express the viral proteins.     

虾池中桡足类及其休眠卵携带对虾白斑综合症病毒的初步调查研究

探讨对虾白斑综合症(White Spot Syndrome WSS)与虾池中桡足类之间的关系,于2003年5~10月份,在暴发过对虾白斑综合症的池塘中采集桡足类样品共128个,并从冬季底泥样品分离出桡足类休眠卵样品20个,以及此种休眠卵孵化得来的桡足类幼体样品5个。利用PCR斑点杂交法以及巢式PCR法检测样品中对虾白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus WSSV)携带情况。结果表明,5~10月份桡足类样品中均能检测到阳性样品,总的阳性率为56.3%;其中,5月份样品阳性率为37.5%,6,8,9,10月份各取样1次,每次样品中的阳性率均在60%以上。在20例桡足类休眠卵样品中有1例为阳性,阳性率为5%;并且实验室中孵化此种休眠卵得来的桡足类幼体样品中检测到阳性,阳性率为40%。本研究初步表明,桡足类是WSSV的携带者或传播媒介之一,且冬季池塘底泥中携带WSSV的桡足类休眠卵可萌发出带病毒的桡足类。     

中国对虾(Penaeus chinensis)的白点综合征病毒(WSSV)的提纯和核酸提取

作者从发生白点综合征的中国对虾中,提取了一株白点综合征病毒,用电镜对纯化的病毒进行了形态学观察,并对病毒纯化过程中蛋白酶抑制剂的使用及离心速度的选择进行了探讨。经蔗糖密度梯度离心,分取各带负染后电镜观察,病毒条带位于４０％～５０％蔗糖梯度之间,其完整毒粒长２２５～２７０ｎｍ,直径７５～８８ｎｍ,有的完整毒粒带有很长的尾,病毒衣壳长２５０～３２０ｎｍ,直径６０～８０ｎｍ。在匀浆使用的缓冲液中加入蛋白酶抑制剂ＰＭＳＦ,可得到完整的带包膜的病毒颗粒,比不使用ＰＭＳＦ的提纯效果要好。经３０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ,５０００ｒ／ｍｉｎ离心２５ｍｉｎ,去除大部分的组织碎片,经１００００ｒ／ｍｉｎ离心１ｈ,可使大部分病毒沉淀。并采用传统的方法对病毒核酸进行了提取,其基因组经初步分析为ｄｓＤＮＡ。