大菱鲆两种转基因方法的比较研究

对外源基因导入大菱鲆(Scophthat musmaximus)的两种方法进行了研究,采用经过改进的电脉冲方法以及哺乳动物细胞中常用的转染法导入外源基因,并对两种方法进行比较。电脉冲最佳导入条件为:脉冲电压为300V/cm,脉冲次数为5,外源DNA质量浓度为20mg/L;转染法的最佳操作时间为受精后50min。应用上述两种方法进行批量转基因鱼实验,得到外源基因的导入率分别为20%～28%和60%～70%。实验表明利用转染试剂jetPEI处理单细胞期的大菱鲆受精卵能得到较高的孵化率及较高的转基因效率。     

大菱鲆mIgD重链基因的克隆与表达分析

利用RACE技术克隆获得大菱鲆(Scophthalmus maximus)膜结合型免疫球蛋白D(Membrane-bounded Ig,mIgD)重链基因的cDNA序列全长,该基因全长3 357bp,包含1个2 997bp的开放阅读框,编码999个氨基酸,基因结构为VDJ-μ1-δ1-δ2-δ3-δ4-δ5-δ6-δ7-TM。重链恒定区δ1~δ7氨基酸序列同源比对结果显示,其与庸鲽(78%)、鳜(71%)、牙鲆(68%)具有较高的同源性;多序列比对结果显示,大菱鲆mIgD的每个δ恒定区内均存在色氨酸与半胱氨酸保守位点。利用邻位相连法构建硬骨鱼类免疫球蛋白系统发育树,结果显示,鱼类IgD聚为一大支,大菱鲆IgD与庸鲽及牙鲆聚为一支。利用RT-PCR分析了大菱鲆IgD重链基因的组织差异表达,结果显示,其在外周血白细胞、脾脏、前肾及中肾组织中具有较高的表达。将大菱鲆腹腔注射福尔马林灭活鳗弧菌后,实时荧光定量PCR检测其前肾组织中mIgD重链基因应答表达量,结果显示,mIgD重链基因在注射鳗弧菌后呈显著下调趋势,在注射后8h时降至最低值,其相对表达量约为对照组的1/28,然后呈逐渐恢复上调趋势,在48h时mIgD相对表达量与对照组无显著差异。     

养殖大菱鲆腹水病病原的研究

从患腹水病的大菱鲆(Scophthalmus maximus)肝和腹水中分离得到优势菌株CW-7,人工感染证实该菌株对大菱鲆幼苗有较强的致病性,腹腔注射1.4×103cfu/尾,即可引起感染鱼100%的死亡,症状与自然发病鱼相似;病原菌为革兰氏染色阴性,直杆状(0.4~0.8)×(0.6~2.0)μm,周生鞭毛运动,氧化酶阴性,兼性厌氧菌,兼具葡萄糖氧化和发酵(O/F)2种代谢途径,其生理生化特征与迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)一致;对该菌的16SrDNA序列克隆、测序后在GenBank中进行了序列对比分析,结果与迟缓爱德华氏菌的序列高度一致(99.92%),进化树分析表明属于同一类群,确定该菌株为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)。该菌株对庆大霉素、卡那霉素、多粘菌素B等14种抗生素敏感,而对青霉素、萘啶酸、复方新诺明等14种药物均具有抗性。     

大菱鲆免疫球蛋白轻链IgL全长cDNA的分离、鉴定及表达分析

实验采用末端快速扩增(RACE)技术从大菱鲆脾脏cDNA文库中筛选得到了免疫球蛋白轻链IgL的全长cD-NA片段。该序列包含47 bp的5′末端非编码区(5′UTR),738 bp的开放阅读框(ORF)和202 bp 3′UTR,整个开放阅读框编码246个氨基酸。系统发生分析表明大菱鲆IgL基因与五条鰤的IgL基因起源关系最近。RT-PCR分析表明,大菱鲆IgL基因只在正常脾脏、肾脏和头肾组织中表达;IgL在大菱鲆胚胎发育细胞期就已开始表达,在大菱鲆胚胎尾芽期和体节期表达持续增强;在鳗弧菌感染大菱鲆脾脏和头肾早期均检测到IgL基因强烈表达,后期表达逐渐减弱;大菱鲆胚胎细胞(TEC)在用鳗弧菌感染48h后,IgL开始表达。这些结果均表明IgL基因在大菱鲆免疫应答中起着重要作用。     

连续降温对大菱鲆成鱼代谢机能的影响

为了探寻连续降温对大菱鲆成鱼血清、肝脏及肌肉能量代谢等指标的影响,将大菱鲆从正常养殖水温18℃快速连续降温至1℃,并在18℃、13℃、8℃、5℃、3℃和1℃共计6个温度点取血采样,分别测定血清中的总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、总胆红素(TBIL)、血糖(GLU)以及肝脏中的糖原和肌肉中的乳酸等指标,实验数据采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析。结果发现,随着温度降低,大菱鲆的血清TP浓度呈先下降后升高的趋势,且在13℃和3℃时出现显著性差异(P<0.05);血清ALB浓度则呈现升高趋势,在3℃时显著高于1℃(P<0.05);血清TC浓度呈现升高趋势,且3℃时显著高于18℃(P<0.05); GLU浓度呈先降低后升高趋势,且8℃时显著高于13℃(P<0.05);尿素浓度呈先降低后升高再降低趋势,且8℃时显著高于1℃(P<0.05);肝糖原浓度在各温度之间无显著差异(P>0.05);肌肉中乳酸含量呈先升高后降低趋势,且5℃时显著高于18℃(P<0.05);其余指标则无显著性差异(P>0.05)。结果表明：当温度在18℃～8℃时,降温对大菱鲆体内代谢影响不大;当温度降到8℃～3℃时,大菱鲆体内开始出现应激反应;当温度继续降低至1℃时,大菱鲆体内的各种代谢基本处于停滞状态。     

养殖大菱鲆烂鳍病病原菌的鉴定及系统发育学研究

从山东半岛3个养殖场各分离到一株大菱鲆烂鳍病的病原菌,均为革兰氏阴性,短杆状,极生鞭毛,有运动能力,菌落半透明。经常规生理生化特征测试和16SrRNA基因序列对比,表明它们都是同一种细菌。理化特征的结果显示这3株菌均与V．anguillarum的表性特征非常相似。对其16SrRNA基因序列进行分析,并构建了系统发育树,结果表明这些菌株与V．anguillarum亲缘关系最近。综合上述研究结果,将该菌鉴定为V．anguillarum.     

产胞外多糖极地微生物的筛选及其胞外多糖对大菱鲆免疫活力的初步研究

采用苯酚硫酸法和醇沉淀法,从600余株南极微生物中筛选得到10株胞外多糖产量较高的菌株.分子鉴定与系统发育分析表明,9株菌株属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas),1株属于嗜冷杆菌属(Psych robacter).对10株菌株进行发酵培养,发酵液经醇沉、除蛋白、冷冻干燥后得到粗胞外多糖.其中菌株3-3-1-2的胞外多糖产量达0.6 g/L.对粗多糖产量较高的4株菌所产的胞外多糖进行免疫活性试验,粗胞外多糖20#3在注射3d时,实验组AKP活性比对照组增加了39％,CAT活性比对照组增加了24％,二者均差异显著(P＜0.05),注射5d时,ACP活性比对照组增加了20％,差异显著(P＜0.05),总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性比对照组增加了14％,差异极显著(P＜0.01);粗胞外多糖33-1-2在注射3d时,实验组AKP活性比对照组增加了12％,差异不显著(P＞0.05),注射5d时,酸性磷酸酶(ACP)活性比对照组增加了24％,过氧化氢酶(CAT)活性比阳性对照组增加了5％,二者均差异显著(P＜0.05).研究结果表明,菌株20#3与3-3-12产生的胞外多糖对大菱鲆(Scophthalmus maxoimus)具有显著的免疫促进作用.由此可知,筛选出的极地细菌胞外多糖20#3和3-31-2可显著提高大菱鲆非特异性免疫力,可作为水产饲料添加剂应用于大菱鲆的生产养殖.