应用单克隆抗体检测牙鲆血清中抗淋巴囊肿病毒的特异性抗体

应用杂交瘤单克隆抗体技术制备10株分泌抗牙鲆免疫球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。利用单抗2H4,通过间接酶联免疫法(ELISA)对牙鲆血清中抗淋巴囊肿病毒(LCDV)特异性抗体进行了检测。结果表明:无外观症状的牙鲆血清中特异性抗体水平很低(平均OD值为0.092),个别鱼体偏高,证明已感染LCDV,处于潜伏期;患淋巴囊肿病且症状显现的牙鲆血清中特异性抗体水平升高(平均OD值为0.165),患淋巴囊肿病后处于恢复期的牙鲆抗体水平最高(平均OD值为0.231);健康牙鲆接种LCDV灭活疫苗后,特异性抗体水平显著升高。     

中国对虾肝胰腺细小病毒感染的免疫病理学研究

于１９９２－１９９３年,用兔抗对虾肝胰腺细小病毒ＩｇＧ和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔ＩｇＧ建立免疫组织病理检测技术,并用来肝胰腺小病毒感染和中国对虾肝胰腺组织作病理学分析,该方法利用抗原－抗体之间特异性结合的特点,首先令兔抗肝胰腺细小病毒抗体与相应的病毒成分结合,然后以酶标记的羊抗兔免疫球蛋白抗体与已结合到病毒上的抗体作用,并通过酶显色反应,揭示病毒和相应病变结构的存在,结果显示,免疫酶染色技术将病     

应用单克隆抗体检测牙鲆血清中抗淋巴囊肿病毒

应用杂交瘤单克隆抗体技术制备10株分泌抗牙鲆免疫球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。利用单抗2H4，通过间接酶联免疫法（ELISA）对牙鲆血清中抗淋巴囊肿病毒（LCDV）特异性抗体进行了检测。结果表明：无外观症状的牙鲆血清中特异性抗体水平很低（平均OD值为0．092），个别鱼体偏高，证明已感染LCDV，处于潜伏期；患淋巴囊肿病且症状显现的牙鲆血清中特异性抗体水平升高（平均OD值为0．165），患淋巴囊肿病后处于恢复期的牙鲆抗体水平最高（平均OD值为0．231）；健康牙鲆接种LCDV灭活疫苗后，特异性抗体水平显著升高。．     

大黄鱼病原副溶血弧菌单克隆抗体制备及其应用

用甲醛灭活副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和溶藻弧菌(V.alginolyticus)制成免疫原免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,获得1株特异的针对副溶血弧菌的单克隆抗体,命名为D6F3H5。腹水及培养上清液抗体的ELISA效价分别为:1∶5 120和1∶1 280,该单克隆抗体与其它细菌没有明显的交叉反应。利用该单克隆抗体和兔抗副溶血弧菌多克隆抗体,建立了检测副溶血弧菌的双抗体夹心ELISA方法。该方法对副溶血弧菌的最小检出量为5×104个/mL。用双抗体夹心ELISA检测大黄鱼(Pseudosciaena crocea)样品,14尾患病大黄鱼中有11尾检出副溶血弧菌,而10尾健康大黄鱼都没有检出副溶血弧菌。由此可见,本试验制备的高特异性的抗副溶血弧菌单克隆抗体,可以用于患病大黄鱼副溶血弧菌的快速诊断。     

养殖大黄鱼副溶血弧菌的酶联免疫吸附法研究

本文建立了网箱养殖大黄鱼病原菌--副溶血弧菌酶联免疫吸附法,也即间接ELISA快速检测方法.用0.5×10-3(V/V)甲醛、30℃作用8h灭活病原菌制成菌苗.用该菌苗免疫新西兰兔获得特异性抗血清,以辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG为标记第二抗体,对副溶血弧菌进行间接ELISA快速检测,其最低检测极限为5×104CFU/cm3.现埸检测养殖水体中没有副溶血弧菌检出,患病大黄鱼肝脏副溶血弧菌的检出率为70%,外观健康大黄鱼肝脏副溶血弧菌的检出率为20%.现埸检测结果表明间接ELISA检测法不仅可以用于患病大黄鱼病原菌的快速检测,而且能够检测出无病症带菌大黄鱼.     

运用抗原芯片原理与竞争免疫层析技术制备鱼类病原性溶藻弧菌快速检测试纸

本文将抗原芯片法原理与竞争免疫层析技术相结合,利用兔抗溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)多克隆抗体标记20nm胶体金颗粒后制得金标垫,将溶藻弧菌的外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外产物和全菌破碎蛋白4种抗原组分以及羊抗兔IgG喷涂在硝酸纤维素膜上,分别作为4条检测线和1条质控线,制备溶藻弧菌胶体金免疫层析快速检测试纸,并确定检测结果的判定方法。使用该试纸同时对溶藻弧菌、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、鳗弧菌(V.anguillarum)和鱼肠弧菌(V.ichthyoenteri)进行检测,检查结果显示其能够准确区分溶藻弧菌感染与其他弧菌的交叉反应,排除了交叉反应对结果判定的干扰。溶藻弧菌快速检测试纸的最低检测限为5×10~5cfu·mL~(-1),检测时间为10~15min。该试纸具有操作简便、快速、准确、特异性强的优点,适用于普通人员在养殖现场对鱼类溶藻弧菌的快速检测。     

利用核酸适配体的竞争置换作用检测溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是水产养殖中致病性较强的一种条件致病菌,为更灵敏、高效地对其进行检测,研发出一种基于核酸适配体竞争置换作用的检测方法。首先设计并制备出磁珠-核酸适配体-荧光报告探针的检测复合物(MAP检测复合物),然后利用溶藻弧菌与其核酸适配体有较好的亲和特异性,在对样品进行检测时,样品中的溶藻弧菌就会竞争MAP检测复合物中的核酸适配体,从而置换出与该核酸适配体结合的荧光报告探针,再通过检测置换出的报告探针的荧光强度来表征溶藻弧菌的浓度,从而实现对溶藻弧菌的定量检测。结果表明,该方法对溶藻弧菌的检测限可达到1CFU/mL,与嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、大肠杆菌(Escherichia coli)等水产养殖中的常见致病微生物没有交叉反应,并在1~20、20~100和100~1000 CFU/mL范围内都表现出较好的线性关系。另外还对MAP检测复合物的制备条件进行了优化,较为理想的制备条件为:100nmol/L核酸适配体与100nmol/L荧光报告探针按体积比1︰1混合结合30 min,制备出50 nmol/L的核酸适配体-荧光报告探针复合物,然后该复合物再与25μg/mL的磁珠按体积比1︰1混合结合60 min,制备出相应的MAP检测复合物。利用核酸适配体的竞争置换作用检测溶藻弧菌有较好的灵敏度和特异性,展现了较好的应用前景。     

对虾病毒IHHNV衣壳蛋白的克隆表达及新型双抗夹心ELISA的高效检测

通过利用分子生物学手段克隆IHHNV衣壳蛋白基因并构建原核表达载体,筛选抗原特性好的多肽免疫兔以制备高效的特异性IHHNV多克隆抗体,最终建立高效的检测对虾IHHNV的新型双抗夹心ELISA方法.实验结果表明该方法成功表达了对虾病毒IHHNV衣壳蛋白基因的抗原多肽,并制备出了高灵敏性的多克隆抗体.将抗原多肽及多克隆抗体用于ELISA的检测,抗体的效价在1∶12 800以上,最低可检测到1 pg的抗原蛋白,表明已成功建立高效的双抗夹心ELISA方法,对于对虾的海水养殖及IHHNV病毒性疾病的防控具有重要的参考价值.     

降低交叉反应的鱼类病原菌检测抗体芯片初步研究

采用菌体吸附法对海豚链球菌(Streptococcus iniae)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、荧光假单胞菌(Psedomonas fluo-rescens)和海洋分支杆菌(Mycobacterium marinum)6种养殖鱼类病原菌的兔抗血清进行吸附,以减小抗血清与其它菌株的交叉反应;吸附纯化后的抗体作为捕获抗体构建了病原菌检测抗体芯片。实验结果显示,与未经过吸附的纯化抗血清构建的抗体芯片相比,血清吸附实验能有效减少交叉反应,降低抗体的非特异性吸附,提高细菌检测的特异性。同时,以迟缓爱德华氏菌为例,采用吸附纯化后抗体制备的抗体芯片检测人工感染迟缓爱德华氏菌和自然发病的牙鲆,均观察到迟缓爱德华氏菌的特异性显色反应,得到了较理想的检测结果。本文结果说明优化后的病原菌检测抗体芯片可用于水产养殖鱼类常见的上述6种细菌性疾病的有效检测。     

抗杂交鳢(Channa argus×C. maculate)弹状病毒卵黄抗体制备及ELISA检测方法的建立

为确定杂交鳢(Channa argus×C. maculate)弹状病毒卵黄抗体效价水平消减规律并验证抗体对病毒的中和能力,采用杂交鳢弹状病毒灭活疫苗免疫蛋鸡,使用醋酸-醋酸钠-辛酸法制备卵黄抗体,建立间接ELISA检测方法以监测卵黄抗体产生过程抗体水平消减情况,以中和试验评估卵黄抗体中和杂交鳢弹状病毒效果。结果显示, ELISA检测方法 最佳条件为抗原包被浓度0.5×10^5.8 TCID₅₀/0.1 mL, 37℃包被2 h, 37℃封闭2 h。与大口黑鲈蛙虹彩病毒卵黄抗体、SPF蛋黄提取物、免疫前蛋黄提取物以及MBC空细胞均无交叉反应。以S/N(sample/negative)>2.1且敏感性最高为标准确定阳性、阴性样品。卵黄抗体于首免后28 d产生效价,四免后达到最高水平,效价为1︰25 600,平台期可持续40～60 d,通过中和抗体检测结果证明平台期内抗体中和效价在免疫周期内最高,约为46.3。通过ELISA检测方法对卵黄抗体产生规律进行监测,通过中和检测方法评估卵黄抗体中和病毒效果。高滴度卵黄抗体具有被开发为新型抗杂交鳢弹状...     

草鱼出血病病毒的研究进展

根据８０－９０年代中国关于草鱼出血病病毒研究的进展,就草鱼出血病病毒的发现、形态结构特征、理论特性、基因组结构及其所编码的多肽、基因组的转录和翻译过程,病毒的繁殖动态、体外细胞培养特性,病毒对鱼体的致病机理和宿主范围,草鱼出血病的诊断和防治等问题进行综合评述,总结概括了草鱼出血病病毒的研究现状以及研究中需要亟待解决的问题,并提出该领域以后的重点研究方向。     

疑患EMS/AHPNS对虾中检出黄头病毒的一种新株型

对2012—2013年从河北、福建和广东3个对虾养殖场采集的12份发生疑似早期死亡综合征/急性肝胰腺坏死综合征(EMS/AHPNS)的样品,采用组织病理学方法、套式RT-PCR检测方法以及快速灵敏检测试剂盒进行了检测。三地来源的养殖对虾样品症状均表现为肝胰腺颜色变淡,部分出现萎缩,空肠空胃,腹节肌肉略微白浊;组织病理切片结果表明,患病对虾肝胰腺血细胞浸润,肝胰腺盲管上皮细胞脱落,继发性细菌感染,淋巴器官和血淋巴细胞内存在核固缩、破裂和细胞质包涵体。按世界动物卫生组织(OIE)手册的套式RT-PCR方法检测,结果显示,黄头病毒(Yellow head virus,YHV)目的产物的阳性样品检出率为66.7%,该方法对这些样品的灵敏度可能很低。目的产物测序后经NCBI Blast,与已报道的YHV相似性为76.5%—89%;系统发育树显示这3个来源的样品位于同一个分支,与已知的YHV/鳃联病毒(gill-associated virus,GAV)株均不相同,其亲缘关系与YHV较近,而与GAV较远。用新研发的YHV快速高灵敏检测试剂盒检测,结果表明,所有样品均为YHV强阳性。以上表明患AHPNS的养殖对虾中存在一种YHV的新株型的感染,这也是我国首次检测到YHV的感染。     

中国对虾淋巴器官中球形病毒的电镜观察

应用光镜和电镜对中国对虾淋巴器官的显微结构和超微结构进行观察,结果表明,淋巴器官的盲管主要由内皮细胞和基质细胞构成,细胞间隙内充满着大量的以颗粒细胞为主的血细胞,     

虾蟹混养塘中WSSV对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)致死效应的定量研究

采用实时荧光定量PCR法,在对白斑综合症多发的虾蟹混养塘内三疣梭子蟹体内病毒含量进行定量跟踪检测的基础上,结合电子显微镜及病理切片,对室内经口服、注射两种回感模式处理已感染白斑综合症病毒的濒死三疣梭子蟹体内病毒含量进行实验验证,并观察其体内主要器官组织的病理改变。结果表明,受白斑综合症病毒感染的三疣梭子蟹存活与死亡取决于蟹体内病毒含量,当病毒含量≥109拷贝/ml时均进入濒死或死亡阶段,其主要器官组织均有明显的病理改变。     

用逆转录聚合酶链式反应检测草鱼出血病病毒的研究

于1994年5月-1995年7月，根据已克隆的草鱼出血病病毒GCHV-861株cDNA的部分序列，设计合成了两对PCR引物，采用RT-PCR技术对GCHV-861及GCHV-873两病毒株的dsRNA进行扩增。结果表明，两对引物仅能特异地检测出GCHV-861病毒株核酸的存在，而不能对GCHV-873病毒株的核酸进行特异扩增，该方法最小可检测出0.1Pg纯化的GCHV-861病毒dsRNA;采用该方法对GCHV-861人工感染的草鱼和稀有鲫组织进行RT-PCR检测，不仅能检测到发病期显症病鱼中GCHV-861病毒的存在，还能检测发病前期及愈后无出血病症状的病毒携带者中病毒的存在;利用该方法还从本所关桥实验场出血病流行季节收集的发病草鱼体内检测出GCHV的存在，说明所设计的引物具有一定的实际意义;利用该法还能检测出感染病毒的组织培养细胞系GCK和CIK上清液中GCHV的存在。还建立了简易的模板制备方法，采用该方法整个检测过程只需3-4h，可大大缩短检测时间。由此可见，RT-PCR技术是检测GCHV的快速、灵敏而特异的方法，发展和完善该技术对草鱼出血病的早期诊断和防治、抗病育种具有重要意义。     

福建省连江县养殖对虾病毒性疾病的调查研究

对福建省连江县养殖对虾的虾病流行情况和发病规律及流行过程中水环境化学、浮游植物、微生物等的动态变化进行了调查，研究了对虾疾病的传染性、传播途径，以及病原与各因子的相互关系。结果表明：不同的对虾种类发病症状基本一致，典型症状为甲壳白斑，甲壳下水肿。该疾病的流行过程可分为三个阶段：发病前期（１－７ｄ）；发病中期（持续时间约１０—１５ｄ）；发病晚期（对虾暴发性死亡时间仅为２—５ｄ）。该流行病是杆状病毒引起并发细菌性传染病，可借海水和病虾尸体为媒介，通过消化道和体表面在不同种虾体间迅速传播。     

两种围栏养殖模式防白斑综合征病毒(WSSV)效果的比较

2003年在乳山养殖场采用两种围栏养殖模式养殖了凡纳滨对虾,并对其防白斑综合征病毒(WSSV)效果进行了比较。结果表明,凡纳滨对虾在养殖过程中WSSV阳性率有下降趋势,浮游动物WSSV阳性率较低,布围隔的防病毒效果好于网围隔。     

中国对虾育苗期球形病毒的感染及垂直传播途径的初步探讨

１９９４－１９９５年山东文登市高岛盐厂对虾育苗池和养虾池,随机和定点采集中国对虾的卵,无节幼体,蚤状幼体,糠虾幼体,仔虾及幼虾,成虾样品,利用透射电子显微镜对其进行病毒的检测。结果表明,卵细胞中含有大量的卵黄,没有明显的细胞分化,卵细胞质中有球形病毒感染;无节幼体的肝胰腺和上皮细胞的分化程度较低,有大量球形病毒分布;糠虾幼体已有明显的肝胰腺和上皮细胞的分化,肝胰腺上皮细胞的胞质中发现有球形病毒包涵     

海藻硫酸多糖911抗乙脑病毒作用的观察

采用体外微量细胞病变抑制实验及体内半数致死量LD_(50)测定法,分别观察海藻硫酸多糖911对乙型脑炎病毒的作用。结果表明,海藻硫酸多糖911在体外适宜的浓度条件下,对乙型脑炎病毒有一定的抑制作用,但对病毒无中和作用。体内给药,911对乙型脑炎病毒无明显抑制作用。     

海洋沉积物病毒荧光计数法的优化

病毒在海洋生态系统的物质循环和能流中起着重要作用,对其进行有效定量是研究其数量变动和生态功能的前提。现行的海洋沉积物病毒定量主要采用荧光染色计数法,但对技术流程中一些处理方法的定量效能尚待验证。本研究利用不同类型海洋沉积物对荧光计数法进行了效能评估和条件优化。结果表明:将沉积物采样后染色封片直接计数或-20°C保存为最佳,保存3个月后未见丰度降低。而不同类型的沉积物经液氮闪冻后于-80°C冷冻保存后的定量效能不同:沙质沉积物保存1个月后病毒丰度下降1个数量级;泥沙质沉积物保存1个月后丰度降低了约27%,2个月后则下降了60%。对焦磷酸钠最优终浓度实验结果显示,使用3mmol/L终浓度获得的病毒计数定量效能优于目前普遍使用的5mmol/L终浓度。水浴超声分离在常温下的定量效果更优,在水浴中添加冰块导致获取的沙质沉积物中的病毒丰度下降约37%。研究发现:处理中用稀释替代离心不仅可降低沉积物颗粒的干扰,而且定量效能更高;离心处理获取的沙质和泥沙质沉积物中的病毒丰度较稀释处理低约40%。对海洋沉积物中原核生物的定量效能与病毒有相似的结果。据此,本文提出了改进的沉积物病毒荧光计数法的操作流程。