合浦珠母贝丝氨酸蛋白酶抑制因子基因pfser1克隆与表达

【目的】克隆合浦珠母贝(Pinctada fucata)丝氨酸蛋白酶抑制因子pfser1基因,探讨该基因的组织表达及其在天然免疫过程中的作用,以及与生物矿化过程的关系。【方法】通过RACE技术获得pfser1基因的全长,通过生物信息学分析其序列结构特征,利用实时荧光定量PCR方法检测pfser1基因在不同组织中的表达,检测健康合浦珠母贝在被大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655刺激后和在贝壳损伤修复实验中pfser1基因表达量的变化。【结果】合浦珠母贝pfser1基因cDNA全长为1240 bp,包含1035 bp的开放阅读框(ORF),编码344个氨基酸,氨基酸序列的功能结构域含有丝氨酸蛋白酶抑制因子Serpin家族保守结构域。pfser1基因在合浦珠母贝各个组织中均有表达,在外套膜边缘膜中表达量最高;大肠杆菌MG1655刺激后,该基因表达量显著升高;在贝壳损伤修复过程中,pfser1基因表达先升高后受到抑制。【结论】pfser1基因所表达的蛋白参与了合浦珠母贝的天然免疫应答过程,并与生物矿化过程有一定关系。     

转录因子CREB对合浦珠母贝无定型碳酸钙结合蛋白启动子的调节作用

【目的】研究无定型碳酸钙结合蛋白(ACCBP)基因的上游调控机制。【方法】以合浦珠母贝(Pinctada fucata)为研究对象,利用基因组步移技术克隆合浦珠母贝ACCBP基因(PfACCBP)的启动子。设计启动子截短实验,通过双荧光素酶标记法确定启动子与转录因子CREB的结合位点,定位启动子中的功能元件。克隆转录因子环腺苷效应元件结合蛋白(CREB),并通过共转染实验和凝胶迁移率分析检测启动子的相对转录活性。【结果】获得合浦珠母贝ACCBP基因的启动子序列,ACCBP启动子在HEK-293T细胞系中转录活性较高;该启动子上存在CRE元件,该元件可在转录过程中与CREB蛋白直接结合,大幅上调ACCBP启动子的转录效率。【结论】转录因子CREB可通过与ACCBP启动子上的CRE元件结合而增强转录活性的调控作用。     

三种笛鲷属鱼类的随机扩增多态性DNA初步研究

RAPD技术是由 Williams[1]和 Welsh[2 ]领导的两个科研小组于 1 990年几乎同时独立创立的一种 DNA多态性分析技术 ,它的原理是利用一系列随机排列的寡核苷酸单链引物 ,以研究对象的基因组 DNA为模板进行 PCR扩增 ,通过扩增产物 DNA片段的多态性来检测基因组 DNA的多态性。该技术已被广泛地应用于种质鉴定、遗传多样性、亲缘关系及系统分类研究 [3～ 6]。但对海水鱼类RAPD研究报道较少。红鳍笛鲷 (L utjanus erythopterus Bloch)、紫红笛鲷 (L utjanus argentimaculatus Forskal)和勒氏笛鲷 (L utjanus russelli Bleeker)具有…     

马氏珠母贝DNA甲基化转移酶Dnmt1的克隆及表达

【目的】对马氏珠母贝(Pinctada martensii)DNA甲基化转移酶1(DNA methyltransferase 1,Dnmt1)的基因全长及组织表达作分析,探究马氏珠母贝甲基转移酶Dnmt1(PmDnmt1)参与贝壳矿化调控机理。【方法】利用RACE技术获得PmDnmt1的c DNA序列全长,并对PmDnmt1的序列特征进行分析,同时利用逆转录-聚合酶链反应RT-PCR技术检测马氏珠母贝不同组织中PmDnmt1的表达情况。【结果与结论】PmDnmt1基因c DNA长4 818 bp,其中,开放阅读框为4 623 bp,编码1 540个氨基酸。预测分子质量约为174.55 ku、理论等电点为5.89。结构域分析显示,PmDnmt1具有DMAP结合结构域、DNMT1-RFD结构域、锌指结构、BAH结构域和C5胞嘧啶DNA甲基化酶结构域等。多序列比对结果发现,Dnmt1在不同物种间具有较高保守性。实时荧光定量PCR分析显示PmDnmt1在所有检测组织中均有表达,在外套膜中央膜部分的表达量最高(P 0.05)。PmDnmt1可通过调控外套膜的DNA甲基化修饰参与贝壳的形成。     

马氏珠母贝Perlucin基因序列特征及其SNP与耐低温性状的关系

【目的】克隆马氏珠母贝（Pinctada fucata martensii）新的凝集素分子基因,命名为Perlucin,研究在低温胁迫下马氏珠母贝Perlucin的表达以及与抗低温性状相关的单核苷酸多态性（SNP）位点。【方法】根据马氏珠母贝基因组中Perlucin基因序列设计引物,克隆Perlucin基因全长;用生物信息学方法分析Perlucin的结构和理化特征;设计17和22℃（对照）2个温度组,对马氏珠母贝进行低温胁迫实验,用实时荧光定量PCR检测低温胁迫下Perlucin表达量的变化;筛选和比较分析马氏珠母贝耐低温选育系（R）F3和北部湾野生群体（W）的Perlucin外显子区的SNP位点和单倍型。【结果】马氏珠母贝Perlucin全长631 bp,编码152个氨基酸;包含1个信号肽和1个C型凝集素结构域。同源分析表明,马氏珠母贝Perlucin与紫贻贝（Mytilus galloprovincialis）Perlucin的亲缘性最近。Perlucin在鳃中表达量最高,其次为足和肝胰腺。低温胁迫时,鳃组织中Perlucin基因在17℃低温组的表达量呈先升高后降低的趋势,在12 ...     

钻井泥浆和消油剂对合浦珠母贝稚贝的急性毒性试验

以合浦珠母贝稚贝为测试对象 ,比较了三种钻井泥浆和消油剂的 96h急性毒性效应。实验结果表明 ,钻井泥浆对合浦珠母贝稚贝的半致死浓度大于 10 5mg/ L;三种消油剂的半致死浓度分别为12 58mg/ L ,4 4 69mg/ L和 2 545mg/ L。     

钻井泥浆和消油剂对合浦珠母贝稚贝的急性毒性试验

以合浦珠母贝稚贝为测试对象,比较了三种钻井泥浆和消油剂的96h急性毒性效应。实验结果表明,钻井泥浆对合浦珠母贝稚的半致死浓度大于10^5mg/L;三种消油剂的半致死浓度分别为1258mg/L,4469mg/L和2545mg/L。     

马氏珠母贝接头蛋白CIKS的基因克隆与组织表达分析

【目的】探究马氏珠母贝接头蛋白CIKS(PmCIKS)在马氏珠母贝免疫反应中的作用。【方法】采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得PmCIKS基因cDNA全长序列,运用生物信息学手段分析该序列,用实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测PmCIKS基因在马氏珠母贝7个组织中的表达模式。【结果】PmCIKS基因cDNA全长为1 987 bp,其中5′UTR长为228 bp,3′UTR长为148 bp,包含24 bp的ploy A,开放阅读框(ORF)为1 611 bp,编码536个氨基酸,预测其分子质量约为61.3 ku,等电点为7.01。物种间CIKS有较高的保守性。PmCIKS在马氏珠母贝肝胰腺、性腺、闭壳肌、鳃、血细胞、外套膜和足中均有表达,其中在血细胞中表达量最高。     

脂多糖刺激对马氏珠母贝血细胞DNA甲基化修饰的影响

【目的】研究马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)血细胞基因组DNA的甲基化修饰情况及其在脂多糖(LPS)刺激后的变化,为探究甲基化修饰在珍珠贝免疫防御中的作用提供理论基础。【方法】运用甲基化敏感扩增多态性法(MSAP)分析马氏珠母贝血细胞(正常养殖贝)以及注射LPS后(6、12、24 h)基因组CCGG位点甲基化的修饰水平变化,并对甲基化修饰位点进行回收测序。【结果】共获得1 102个清晰可辨的DNA条带,其中全甲基化位点条带215个,半甲基化位点条带127个,非甲基化位点条带760个。对照组血细胞基因组CCGG位点的甲基化修饰比例为23.76%,注射LPS后,甲基化比例为28.10%～48.25%,注射6 h时最低,12 h时最高;对特异性片段测序后,经Blast比对,得到5条存在甲基化修饰的基因序列,其中2条具有注释信息,分别是干扰素调控因子(Interferon regulatory factor)和磷脂酶BL2(Putative phospholipase B-like 2)。【结论】马氏珠母贝血细胞基因组CCGG位点的甲基化修饰参与调控LPS诱导的免疫反应,在免疫防御中发挥重要作用。     

3种珍珠贝精子发生及其超微结构的比较研究

在透射电子显微镜下观察合浦珠母贝（Ｐｉｎｃｔａｄａｆｕｃａｔａ）、大珠母贝（Ｐｉｎｃｔａｄａｍａｘｉｍａ）和企鹅珍珠贝（Ｐｔｅｒｉａｐｅｎｇｕｉｎ）的精子发生及精子形态．结果表明．大珠母贝从精原细胞到精子，核内都有数量不等的板层小体（ｎｕｃｌｅａｒｌａｍｅｌｌａｒｂｏｄｙ）；企鹦珍珠贝从精原细胞的晚期直到精子细胞早期，大多数细胞出现核内包含体（ｎｕｃｌｅａｒｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）；而合浦珠母贝的生精细胞核无特殊结构．合浦珠母贝在初级精母细胞时由高尔基体分泌形成前顶体粒；企鹅珍珠贝的前顶体粒主要在次级精母细胞和早期精子细胞阶段形成。虽然大珠母贝的各级生精细胞中都没有出现典型的高尔基体，但前顶体粒仍在精母细胞时期形成。三种贝的精子结构均为典型的原生型，由头部、中段和尾部构成．合浦珠母贝精子的顶体最长，中段的线粒体数有变异；大珠母贝的精子核最高，其中含有板层小体；而企鹅珍珠贝精子中段的体积是最大的．     

三种笛鲷属鱼类的随机扩增多态性DNA初步研究

RAPD技术是由Williams和Welsh领导的两个科研小组于1990年几乎同时独立创立的一种DNA多态性分析技术，它的原理是利用一系列随机排列的寡核苷酸单链引物，以研究对象的基因组DNA为模板进行PCR扩增，通过扩增产物DNA片段的多态性来检测基因组DNA的多态性。     

马氏珠母贝黄壳色选系F1和养殖群体形态性状比较

<正>马氏珠母贝(Pinctada martensii)是我国南方养殖的一种重要经济贝类,长期以来一直是我国主要的海水育珠的主要贝类,用马氏珠母贝育珠是广东、广西和海南沿海部分地区经济发展的支柱性产业。近年来,我国海水珍珠的质量出现明显滑坡,严重地削弱了在国际市场上的竞争力。为提高海水珍珠质量和在国际市场上的竞争力,国内科技工作者已经进行了大量的研究工作,这些工作主要包括对马氏珠母贝养殖群体性状的改良、育珠技术的优化和海水珍珠形成机理的研究[1-5]。     

马氏珠母贝TRADD基因克隆与组织表达分析

【目的】克隆马氏珠母贝(Pinctada martensii)肿瘤坏死因子受体相关死亡域蛋白(TRADD)基因,并分析其在各组织中的表达。【方法】利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得马氏珠母贝PmTRADD基因的c DNA全长序列,利用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析PmTRADD基因在马氏珠母贝不同组织中的表达模式。【结果与结论】PmTRADD包含5′非编码区101 bp,3′非编码区144 bp和开放阅读框(ORF)591 bp,编码196个氨基酸。序列分析表明,PmTRADD没有信号肽和跨膜结构域,C端含有一个死亡结构域(DEATH)。将PmTRADD死亡结构域的氨基酸序列与其他物种的TRADD死亡结构域序列进行比对,发现不同物种的TRADD死亡结构域序列同源性较低。PmTRADD在马氏珠母贝各组织中均有不同程度表达,在鳃组织中表达最高,肝胰腺次之,闭壳肌中基本无表达。     

马氏珠母贝近交与杂交家系的DNA甲基化多态性比较

采用甲基化敏感多态性扩增技术(MSAP)检测马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)近交(F1)与杂交(Z1)家系闭壳肌的DNA甲基化修饰水平,对部分甲基化修饰片段进行回收、测序和注释分析。结果表明:使用20对引物进行选扩增PCR,最终F1和Z1分别获得(632.20±22.58)和(588.60±25.09)条条带,差异显著(P0.05);F1和Z1之间的组织甲基化水平分别为(9.93±1.60)%和(8.04±1.25)%,差异显著(P0.05)。对回收片段进行注释,F1家系共获得9条甲基化修饰片段,其中8条为功能蛋白,分别为E3泛素连接酶、逆转录病毒多聚蛋白、神经肽受体、交叉结点核酸内切酶、磷酸糖器、苯丙氨酸解氨酶、隐花色素蛋白、脆性位点相关蛋白;Z1家系共获得5条甲基化修饰片段且均为功能蛋白,分别为脆性位点相关蛋白、神经元乙酰胆碱受体α亚基、无调性的同源蛋白、麦芽糖酶、甲基胞嘧啶双加氧酶。初步阐明马氏珠母贝近交家系F1与杂交家系Z1间的DNA甲基化修饰水平和部分具甲基化修饰位点。     

防御藤壶附着合浦珠母贝的试验报告

位于流沙湾的徐闻珍珠养殖场，所养殖的合浦珠母贝Pincfata martensii(Dunker)，每年从6月至10月都有大量的网纹藤壶(Balanus reticunlatus)、糊斑藤壶(Balanus cirratus)及自脊藤壶(Balanus albicostatus)附着，     

防御藤壶附着合浦珠母贝的试验报告

位于流沙湾的徐闻珍珠养殖场,所养殖的合浦珠母贝Pincfata martensii(Dunker),每年从6月至10月都有大量的网纹藤壶(Balanus reticunlatus)、糊斑藤壶(Balanus cirratus)及白脊藤壶(Balanus albicostatus)附着,尤其是7、8月,藤壶附着数量及生长速度     

马氏珠母贝PmFAMeT基因的克隆及表达

【目的】克隆马氏珠母贝(Pinctada martensii)法尼酸甲基转移酶(FAMe T)基因,并分析其在各组织中的表达。【方法】利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得马氏珠母贝FAMeT(PmFAMeT)基因的cDNA全长序列,利用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析PmFAMeT在马氏珠母贝不同组织中的表达模式。【结果与结论】PmFAMeT包含5′非编码区120 bp,3′非编码区968 bp和开放阅读框(ORF)1 536 bp,编码511个氨基酸。序列分析表明,PmFAMeT含有信号肽序列和跨膜结构域,并有WSC结构域、TSP1结构域和2个Methyltransf_FA结构域。将推导的PmFAMeT氨基酸序列与其他物种的FAMeT序列进行比对发现,不同物种的Methyltransf_FA序列同源性较高。PmFAMeT在马氏珠母贝的各个组织中均有表达,且在边缘膜、肝胰腺和性腺中的表达量显著高于其他组织。     

不同温度下马氏珠母贝干露耐受能力及其免疫相关基因表达的变化

【目的】探究马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)对干露胁迫的响应,为马氏珠母贝健康养殖和遗传育种提供基础资料。【方法】在不同温度下对马氏珠母贝进行干露胁迫,探究温度对马氏珠母贝干露耐受的影响;筛选出马氏珠母贝干露胁迫敏感组和耐受组,比较两组的免疫相关基因表达量和植核后休养期存活率。【结果】(1)22~34℃条件下,马氏珠母贝干露耐受能力随温度升高及干露时间延长而降低;(2)22℃下,S组和T组的脯氨酸羟化酶(PHD)、葡萄糖转运蛋白(GLUT)、髓样分化因子(MYD88)、热休克蛋白(Hsp70、Hsp20)和凋亡抑制因子(cIAP)6个基因在干露过程中表达量基本呈上升趋势,组间差异显著(P<0.05);(3)植核试验结果表明耐受组植核后休养期的存活率显著高于敏感组(P<0.05)。【结论】马氏珠母贝在高温环境下干露耐受能力降低,在适温条件下耐受组比敏感组表现出较高的存活率。     

温度、盐度对马氏珠母贝外套膜Hsp70基因表达量的联合影响

设定温度范围16～40°C,盐度范围10～50,采用复合设计和响应曲面分析法在实验室条件下研究不同温度、盐度对马氏珠母贝(P.fucata)外套膜Hsp70基因表达量的综合效应并建立模型。采用方差分析(ANOVA)、决定系数等对实验所得回归方程模型进行显著性及拟合度检验。结果表明,温度的一次、二次效应对马氏珠母贝外套膜Hsp70基因表达量影响显著(p值<0.05);盐度的一次效应对马氏珠母贝外套膜Hsp70基因表达量无显著影响(p值>0.05),二次效应对马氏珠母贝外套膜Hsp70基因表达量影响极显著(p值<0.05);温度、盐度之间的互作效应对马氏珠母贝外套膜Hsp70基因表达量无显著影响(p值>0.05)且温度的效应大于盐度的效应。经响应曲面分析法和优化,得到马氏珠母贝外套膜Hsp70基因表达量在适宜的温度、盐度范围内呈峰值变化,在温度26.85°C、盐度29.39时,马氏珠母贝外套膜Hsp70基因表达量达到最小值0.95,满意度达到99.36%。建立了马氏珠母贝外套膜Hsp70基因表达量模型方程,其决定系数98.69%,矫正决定系数97.38%,预测决定系数91.42%,模型的拟合度极高,可用于预测马氏珠母贝外套膜Hsp70基因表达量。     

合浦珠母贝超氧物歧化酶组织表达的特异性

采用聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳技术，对合浦珠母贝4种组织（肝脏、外套膜、闭壳肌、鳃）中的超氧物坡化酶（SOD）电泳图谱进行分析。结果表明：SOD具有明显的组织特异性。在肝脏中SOD由3个位点编码，其中Sod-2、Sod-3座位具有多态性；外套膜中SOD由3个位点编码，其中Sod-2、Sod-4座位具有多态性；闭壳肌中SOD由4个座位编码，其中Sod-2、Sod-2、Sod-4座位具有多态性，肝脏Sod-3座位及壳肌Sod-1座位分别具有一“0”等位基因；鳃中SOD至少由7个以上位点编码，并出现三等位基因编码的SOD同工酶谱。