基于转录组数据的大菱鲆(Scophthalmus maximus)SNP标记开发及多态性分析

大菱鲆(Scophthalmus maximus)是最具商业价值和养殖前途的海水鱼类之一,雌雄间生长有一定的差异。其高通量雌雄转录组测序的完成为大规模鉴定和开发SNP标记提供了参考序列。本研究基于大菱鲆雌雄转录组测序数据,选择其中45个SNP位点,设计引物63组,其中21个位点(46.7%)应用小片段高分辨率熔解曲线(HRM)技术分型成功。对其进行多态性检测,21个位点均具有二个单倍型。观测杂合度Ho的分布范围为0.256—1.000,期望杂合度He的范围为0.276—0.518,19个位点符合Hardy-Weinberg平衡。14个SNP位点位于基因编码区,其中3个属于非同义突变。含有这些SNP位点的基因大多与信号转导和转录翻译相关。本研究结果表明,高通量转录组测序和小片段HRM适合大规模SNP标记开发,为大菱鲆的分子遗传育种提供了候选标记资源。     

应用高分辨率熔解曲线(HRM)开发大菱鲆(Scophthalmus maximus)SNP标记的研究

利用Vector NTI Advance 11软件分析了NCBI数据库中大菱鲆的12428条EST序列,筛出候选SNP位点;应用高分辨率熔解曲线(HRM)对大菱鲆不同性状群体进行基因分型。结果表明,522个重叠群中共筛出160多个候选SNP位点;设计56对引物用于实验,能扩增出目的片段的引物有37条,合45个位点,成功率为66.1%;设计探针,能与候选SNP位点杂交的探针有13条,杂交率为28.9%。本实验中能成功进行基因分型的位点共有8个,占杂交位点的61.5%,其中有6个为碱基替换型位点,即G-A和C-T各占3个,2个为碱基颠换型位点,即T-G和A-T各占1个。     

马氏珠母贝(Pinctada fucata)血细胞转录组测序数据中SNP标记的开发及其功能注释分析

本文基于马氏珠母贝(Pinctada fucata)血细胞比较转录组学数据进行单核苷酸多态性标记(SNP)的开发和关联基因的功能注释分析,以期为SNP标记的利用提供有效信息。在转录组测序获得的67632条SNP-unigenes中共获得962995个SNP位点,位点平均发生频率约为1个SNP/100bp;转换SNP数目与颠换SNP数目比值约为0.5,与理论比率相符;而6种单核苷酸变异类型中,以A/T颠换SNP最多。SNP-unigene功能注释分析表明,30376条unigenes(44.91%)匹配到GO分类条目;18150条unigenes(26.84%)获得COG注释信息,并以"一般功能预测"类最多;10981条unigenes(16.24%)富集到32条KEGG子集,其中以"信号转导"子集中富集的SNP-unigene最多。进一步富集分析显示629个SNP-unigenes注释到"Platelet activation"等多条免疫防御相关信号通路中;同时,根据SNP位点分布情况筛选到123个溶藻弧菌感染前、后转录组中特异分布的免疫防御相关候选SNP位点。基于标准化的基因表达水平分析,在17个差异表达免疫防御相关基因中共检测到1594个SNP位点。     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)微卫星序列的开发与分析

采用FIASCO (Fast Isolation by AFLP of Sequences Containing repeats)法和标记初步筛选法, 进行了大菱鲆(Scophthalmus maximus)微卫星标记开发的研究, 分析了大菱鲆基因组中微卫星DNA序列的特征, 并进行了拟作图标记的初步筛选。结果表明, FIASCO法的富集效率为78.56%, 二次筛选出655个阳性克隆, 测序后经分析有469条含有微卫星位点的单一序列, 共得到597个微卫星位点。其中完美型占51.76%, 非完美型占34.67%, 复合型占13.57%; 核心序列的重复次数在3—96次之间, 平均重复数为13.39次; 重复单元类别最多的是(CA/GT)n, 占77.6%。利用Primer Premier 5.0共设计413对引物, 其中有360对能够得到稳定表达的产物; 再经标记初筛试验得知, 183对引物(50.8%)的PCR产物有多态性, 其中110个微卫星位点(30.6%)符合遗传连锁图谱作图标准。     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)生长性状相关的微卫星标记筛选

采用分群分离分析法,以同一批受精卵孵化的同池养殖大菱鲆生长性状发生分离的群体为材料,进行微卫星DNA遗传分析,以揭示影响大菱鲆生长发育速度方面的遗传信息。30个多态性微卫星位点对生长高值组(F组)和生长低值组(S组)各10个样本建立的DNA混合池进行扩增时,在两池间出现了7个差异片段。通过对两组大菱鲆个体PCR扩增出的差异条带进行统计,分析微卫星位点与大菱鲆生长性状的相关性。结果表明,有1个微卫星位点(SmaC10)在355bp的等位基因片段与大菱鲆生长性状存在一定的负相关性;有4个微卫星位点(SmaC02、SmaC06、SmaC09、B11-I12/6/3)分别在258bp、182bp、226bp、175bp的等位基因片段与大菱鲆生长性状存在正相关性,其中位点Smac09在226bp的等位基因片段与生长性状的正相关性极显著,相关系数达到0.354。位点SmaC09所扩增出的等位基因片段可作为具有良好生长特性人工选育群体的分子标记,指导大菱鲆的辅助育种。     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)种业发展及相关前沿技术应用

大菱鲆(Scophthalmus maximus)是原产于欧洲的重要的特有名贵鱼类之一, 于1992 年被引 入中国。由于大菱鲆大规模人工繁育技术的突破, 使其成为中国沿海重要的经济鱼类。然而, 在繁育 过程中, 由于缺乏有效的亲鱼管理, 导致出现亲鱼近交, 结果造成严重的种质衰退。因此, 为了维持 大菱鲆产业健康、稳定、持续的发展, 自大菱鲆规模化养殖以来又开展了大菱鲆的遗传改良工作。 本文从繁育和选育两个方面回顾了近年来国内外大菱鲆种业的发展历程及现状, 总结了大菱鲆种业 发展的前沿技术及应用, 并对大菱鲆种业发展所需的技术研发趋势进行了展望。     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)耐高温品系选育及耐温性能评估

采用家系选育方法,进行了大菱鲆耐高温性状选育研究,对两代家系耐温性能进行测定,并利用bCOX回归分析了各家系的耐温性优势比。结果表明:各家系耐温性差异达到了显著水平(P<0.05),并且耐高温能力的优势比也存在显著差异,这反映出在大菱鲆耐高温选育中家系选择的高效性;经过一代选育,获得4个耐高温家系,并据此构建选育二代家系。耐温性能评估,选育二代比一代有显著提高,在27℃高温条件下,选育一代的平均死亡率为49%,选育二代的平均死亡率为10.26%;28℃条件下,选育二代耐高温子代的平均死亡率为32.83%,对照组的平均死亡率为88.9%;经过筛选后,选育二代的耐温性比选育一代提高了1—2℃左右。     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼鱼生长性状的遗传力及其相关性分析

以4种不同地理群体大菱鲆为亲本,采用巢式设计方法和人工采卵授精技术,按照1雄配2雌的原则,构建了28个父系半同胞家系和56个母系全同胞家系,分别测定了每个母系生长到6月龄的全同胞个体60个后代的体长、全长、体高、体重,应用数量遗传学原理,利用全同胞资料,采用方差、协方差分析的方法,研究了大菱鲆6月龄生长性状的遗传力及性状间的遗传相关和表型相关。对性状遗传力研究结果表明,雌性遗传方差组分均大于雄性遗传方差组分,雌性遗传方差组分存在显著的母性效应。基于父系半同胞组内相关法估计的遗传力是大菱鲆体长、全长、体高、体重遗传力的无偏估计值,估计的遗传力准确可靠,估计值分别为0．282、0．251、0．283、0．450,为中高等遗传力,显示对大菱鲆生长性状进行选择育种具有很大的潜力。对性状间相关性分析结果表明,依据父系半同胞遗传协方差组分和表型协方差分别估计体长．全长、体长一体高、体长．体重、全长。体高、全长一体重、体高一体重间的遗传相关和表型相关,遗传相关在0．888-0．985,表型相关在0．864—0．957,各性状间遗传相关和表型相关经t检验均达到极显著水平（P〈0．01）。     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)病原鳗利斯顿氏菌的鉴定

采用表观分类学及分子生物学方法,对从大菱鲆细菌性败血感染症的病(死)鱼中分离到的相应病原菌,进行了形态特征、理化特性等较系统的鉴定及代表菌株DNA中G Cmol%的测定;同时,择代表菌株进行了16SrRNA基因的分子鉴定,测定了16SrRNA基因序列、分析了相关细菌相应序列的同源性、构建了系统发生树。结果表明,所检30株菌均为利斯顿氏菌属(ListonellaMacDonellandColwell1986)的鳗利斯顿氏菌[L·anguillarum(Bergeman1909)MacDonellandColwell1986],择S010610-1株、S010610-3株及S010623-1株作为代表菌株进行的16SrRNA基因序列测定,不包括引物结合区,所扩增的16SrRNA基因序列长度,S010610-1株为1466bp(GenBank登录号:AY963630)、S010610-3株为1416bp(GenBank登录号:AY963631)、S010623-1株为1424bp(GenBank登录号:AY963632),与GenBank数据库中弧菌属细菌的同源性在97%—99%。     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)四个不同地理群体数量形态特征比较

采用聚类分析、单因子方差分析和主成分分析方法,对4个不同地理群体大菱鲆进行了12项形态性状的测定,比较了4个群体的外部形态特征。聚类分析结果表明,4种大菱鲆群体中,丹麦和挪威之间及英国和法国之间的差异较小,丹麦、挪威和英国、法国之间的差异较大。方差分析多重比较结果表明,4个群体在部分形态特征上表现出明显差异,其中,英国和法国群体、挪威和丹麦群体之间形态特征差异显著指标较少,丹麦群体和英国群体、丹麦群体和法国群体、挪成群体和英国群体、挪威群体和法国群体之间差异显著指标较多。主成分分析构建了3个反映形态特征信息的综合性指标——主成分1、主成分2和主成分3,三者的贡献率分别为38.663%、14.117%和8.976%,三个主成分的累积贡献率为61.756%.分析结果显示,英国和法国群体、挪威和丹麦群体之间形态差异不显著,丹麦群体和英国群体、丹麦群体和法国群体、挪威群体和英国群体、挪威群体和法国群体之间形态差异显著,且差异主要来源于主成分1,而主成分1主要由经方差分析多重比较差异显著的指标组成,显然,主成分分析与聚类分析、方差分析的结论基本上是类似的,它们从不同的角度反映了群体间的形态学差异.     

超低温保存后大菱鲆(Scophthalmus maximus)精子的生理活性及其超微结构研究

采用计算机辅助分析和电子显微镜方法, 对大菱鲆(Scophthalmus maximus)精子生理活性(运动率、运动速度和寿命)和超微结构进行观察, 研究其精子经超低温保存后质量变化情况, 得到了新鲜精子的路径速度[(101.91±9.30)?m/s]、运动率(88.30%±2.62%)和寿命[(368.00±111.50)h], 以及冷冻精子的路径速度[(76.78±8.49)?m/s]、运动率(65.60%±4.76%)和寿命[(120.00±12.00)h]。结果表明, 新鲜精子的生理特性好于冷冻精子。同时通过电镜去进行超微结构分析, 发现大菱鲆精子经过超低温保存后, 40%—60%的精子基本保持正常的形态结构, 其余精子遭受不同程度的机械损伤。其中膜损伤为主要损伤, 损伤精子中60%—70%带有膜损伤。推测大菱鲆精子在冷冻解冻过程中遭受到的机械损伤可能是导致冻精生理活性显著下降的主要原因。     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)蛋白质二硫键异构酶SmPDIA3的表达分析和功能验证

本研究利用SMART-RACE技术克隆了大菱鲆SmPDIA3基因。SmPDIA3基因cDNA序列全长2083bp,包括1479bp的开放阅读框,编码492个氨基酸,GenBank登录号：MG765516。组织表达分析发现：SmPDIA3基因在肠、鳃、肝脏等组织中均有表达,其中在肝脏中表达量最高,脑中最低。进一步研究了温度胁迫后SmPDIA3基因在肠和肝脏组织中的表达变化规律,发现随着胁迫温度的升高,SmPDIA3基因的相对表达量总体上升,并在28℃时达到最大。利用原核表达技术,构建了pET-28a-PDIA3原核表达载体,IPTG诱导后融合蛋白主要在上清中表达。将上清中的蛋白分离纯化后,利用Western blot技术验证了目的蛋白的准确性。将纯化后的目的蛋白浓缩后,利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测得蛋白浓度为243.18μg/mL。最后设计变性溶菌酶的复性实验,验证了SmPDIA3蛋白具有分子伴侣功能,能够辅助变性蛋白的正确折叠。     

母源免疫对大菱鲆(Scophthalmus maximus)子代抗体IgM水平的影响

采用鳗弧菌灭活疫苗对大菱鲆(Scophthalmus maximus)雌性亲鱼免疫方法, 进行了母源免疫对子代抗体水平、变化规律的影响及卵子中抗体蛋白空间分布特征的研究。结果表明, 免疫亲鱼产出的卵子中IgM抗体水平显著高于对照组。胚胎发育过程中, 抗体水平整体呈下降趋势, 且48h前下降迅速, 免疫组抗体水平显著高于对照组(P<0.05); 48h以后, 免疫组和对照组间无显著差异。卵子中抗体蛋白免疫组化定位结果表明, 未受精卵中IgM抗体集中分布在卵膜内侧边缘, 卵黄部分分布不明显。研究还发现, 卵巢液中抗体水平显著高于卵子匀浆液, 且免疫亲鱼组卵巢液中抗体水平显著高于对照组(P<0.05)。本实验验证了大菱鲆特异性抗体的母源传递性, 并揭示了在本免疫条件下的传递时效, 为进一步开展通过母源免疫对育苗早期疾病防控途径的探索奠定了基础。     

大菱鲆（Scophthalmus maximus）胚胎发育的形态学和组织学研究

采用显微镜和连续切片技术,观察了大菱鲆胚胎发育阶段的形态学和组织学特征。结果表明,大菱鲆胚胎发育主要经历6个时期;在14℃,胚体经108h即可孵化出膜。胚胎在64细胞期出现纬裂,分裂球分化为外层的包被层和内部的深层细胞;多细胞期形成卵黄合胞体层;低囊胚期形成囊胚腔。受精后26h30min胚盾出现。胚盘下包65%时,头突...     

不同铁水平饲养对大菱鲆(Scophthalmus maximus)生长及耐低氧能力影响的研究

铁元素作为细胞色素的重要成分参与鱼类细胞内的氧化还原供能过程,在鱼类应对低氧胁迫时发挥重要作用。以硫酸亚铁为铁源,研究不同铁水平饲养对大菱鲆(Scophthalmus maximus)生长及耐低氧能力的影响。在含铁量为463 mg/kg的基础饲料中添加0(A组)、75(B组)、150(C组)、225(D组)和300(E组)mg/kg铁离子,探究不同铁水平饲喂对大菱鲆常氧下的生长、血清生理生化指标以及抗低氧胁迫的影响。结果显示,常氧情况下,随着饲料中铁含量的增加,上述指标呈先增加后下降的趋势(P<0.05),且C、D组均为峰值显著高于A、B、E三组(P<0.05)。低氧胁迫及耐受实验结果显示,随着低氧胁迫的加剧,C、D两组抗氧化酶活性(SOD,GSH-PX)、低氧[DO=(2.0±0.5) mg/L]死亡率均显著高于或低于其他三组(P<0.05)。铁作为重要的氧载体和电子传递体影响着生物体的物质代谢和能量代谢。研究表明饲料铁水平613~688mg/kg的饲养对大菱鲆生长性能、抗氧化系统的增强和提高低氧耐受能力具有促进作用,研究结果可为鱼类健康养殖和功能性饵料研制提供新数据支撑。     

免疫增强剂紫锥菊(Echinacea purpurea)提取物对大菱鲆(Scophthalmus maximus)头肾内非特异性免疫基因表达量的影响

通过给大菱鲆(Scophthalmus maximus)注射不同浓度的紫锥菊(Echinacea purpurea)提取物,测定其非特异性免疫指标的变化水平,研究其对大菱鲆的头肾内非特异性免疫分子基因相对表达量的影响,进而为其在大菱鲆养殖生产过程中推广应用提供科学依据。试验选取体重(250±20)g的大菱鲆作为试验动物,分别注射10、20、40mg/m L浓度的紫锥菊提取物,试验共进行28d,注射试验结束后,分别从高、中、低剂量组及空白对照组选出6尾大菱鲆,分别取出大菱鲆的头肾并提取总RNA。采用?Ct法进行目标基因的荧光定量分析,再应用SPSS17.0软件对获得的实验数据进行单因素方差分析。研究结果表明,紫锥菊提取物能够不同程度地提高大菱鲆头肾内非特异性免疫分子基因相对表达量。注射紫锥菊提取物28d后对大菱鲆头肾中Lysozyme基因相对表达量的影响显著(P0.05),对C3补体基因相对表达量的影响极显著(P0.01),对Transferrin基因相对表达量的影响显著(P0.05),对TGF-β1基因相对表达量的影响极显著(P0.01),对IL-1h基因相对表达量的影响极显著(P0.01),本试验研究表明,紫锥菊提取物能够显著提高大菱鲆头肾内非特异性免疫分子基因的相对表达量。     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)不同发育阶段视蛋白基因表达特征研究

视网膜视蛋白组成是动物识别光强与颜色视觉的基础,其会随着不同生长环境和发育阶段而发生变化。大菱鲆(Scophthalmus maximus)为重要的海水养殖鱼种,在发育过程中经历了从浮游生活到底栖生活的转变;生活习性的转变伴随着生存环境的变化,尤其是光照环境的变化。我们推测大菱鲆光照感知功能包括视蛋白种类及表达模式等,在不同阶段应有所不同,目前未见相关研究报道。本研究以1、4和9月龄大菱鲆为研究对象,通过qRT-PCR探查了不同阶段大菱鲆视蛋白基因表达的特征规律,通过分析三个发育阶段的视蛋白基因表达比例,推测鱼体光谱敏感性变化规律。结果表明,红视蛋白(LWS)基因表达量随鱼体发育逐渐降低,视紫红质(RH1)、紫外视蛋白(SWS1)和蓝视蛋白(SWS2)随鱼体发育表达量逐渐升高,而绿视蛋白(RH2)中高表达的RH2b1无显著变化。LWS表达比例由1月龄57.2%降至九月龄11.4%,RH2b1表达比例由1月龄29.9%升至九月龄73.3%。随着大菱鲆由早期浮游生活转入底栖生活,表达占主导地位的视蛋白,逐渐由LWS转变为RH2b1,其光谱敏感性可能由红色敏感向绿色敏感转变。大菱鲆视蛋白在不同发育阶段表达的特征变化引发的光谱敏感性变化,可认为是其对不同光环境的适应策略。     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)、星斑川鲽(Platichthys stellatus)及其杂交种的形态学分析

利用方差分析、聚类分析、判别分析和主成分分析等多元分析方法,对大菱鲆、星斑川鲽及其杂交种(大菱鲆♀×星斑川鲽♂)的可数性状和可量性状进行了分析。结果表明:(1)可数性状中,除腹鳍鳍条数外,杂交种与母本大菱鲆差异不显著,而与父本星斑川鲽差异极显著。(2)可量性状中,杂交种和大菱鲆差异不显著的性状占可量性状的45%,而与星斑川鲽都为显著差异。可量性状的杂种指数平均值为15.56,显示杂交种可量性状总体属于偏母本。(3)聚类分析表明,杂交种与大菱鲆形态较为接近,先聚为一支,再与星斑川鲽聚为一支。(4)主成分分析表明,共获得了4个主成分,其累积总变异的贡献率为73.49%。主成分散点图表明杂交种在形态差异上独立于大菱鲆和星斑川鲽。(5)判别分析表明,利用10个对结果影响贡献率较大的参数分别构建了其判别函数,对大菱鲆、星斑川鲽和杂交种的综合判别准确率达到98.9%,判别效果非常显著。研究认为,杂交种的形态与母本比较相似,但可以通过形态判别分析将三者进行区分判别。