利用酵母双杂交系统筛选草鱼呼肠孤病毒NS38相互作用蛋白

采用酵母双杂交技术,对草鱼呼肠孤病毒096(GCRV096)非结构蛋白NS38相互作用的蛋白进行了筛选,并对阳性克隆中的插入序列进行测序与生物信息学分析。结果表明,含有重组质粒pGBKT7-NS38的酵母菌Y2HGold与含有草鱼肾脏细胞(CIK)cDNA文库质粒的酵母菌Y187融合成功,并筛选得到3株阳性克隆;发现两条不同的插入序列,其中一条序列编码的蛋白与40S核糖体蛋白S16亚基的同源性高达99%,而另一序列相应的蛋白不存在匹配的蛋白。该结果为进一步深入研究NS38蛋白在GCRV096复制过程中的生物学功能奠定了基础。     

酵母双杂交系统用于WSSV结构蛋白VP39相互作用的宿主蛋白基因的初步研究

为研究WSSV的结构蛋白VP39相关蛋白的基因,应用酵母双杂交系统筛选中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)鳃细胞全长cDNA文库。将构建好的VP39基因的重组载体pGBKT7-VP39转化酵母Y187后,与含文库质粒的酵母株AH109融合,在营养缺陷培养基上进行反复筛选,得到1个阳性克隆,测序并进行生物信息学分析。结果显示,此cDNA片段在数据库中是新序列,该蛋白在WSSV识别并结合宿主的过程中所起的作用还有待于进一步研究。本实验成功筛选了VP39相关蛋白的cDNA片段,为进一步研究WSSV的致病机理奠定了基础。     

锯缘青蟹(Scylla serrata)呼肠孤病毒5个结构蛋白互作分析

采用酵母双杂交系统,对青蟹呼肠孤病毒(Scylla serrata reovirus)5个结构蛋白(VP3,VP6,VP9,VP11,VP12)间的双向互作进行了分析。将5个结构蛋白对应的ORF分别亚克隆至诱饵载体p GBKT7和猎物载体p GADT7,成功构建了10个酵母双杂交重组载体。将重组诱饵载体或重组捕获载体转化至酵母菌Y2H Gold中进行自激活检测,结果显示5个结构蛋白均不能激活酵母菌报告基因HIS3的表达,表明5个病毒蛋白均不具有自激活活性。通过酵母双杂交实验,从5个结构蛋白25个可能性互作对中,共筛选出2个双向互作对(VP11VP6,VP11VP12)和3个自身互作对(VP3VP3,VP11VP11,VP12VP12)。本研究是有关Ss RV结构蛋白互作的首次报道。     

允饲植物源复方制剂对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)的免疫增强作用研究

为筛选适合添加于草鱼(Ctenopharyngodon idellus)饲料的植物源免疫增强剂,本试验以白芍(Radix paeoniae Alba)、杜仲(Eucommia ulmoides)和知母(Rhizoma anemarrhenae)三种允饲植物配制的复方制剂A、B和C为研究对象,开展其对草鱼非特异性免疫功能的比较研究。试验将二龄草鱼随机分成6个试验组和1个对照组,试验组和对照组按鱼体重量的3%每天分别投喂添加复方制剂的饲料和空白饲料。试验第7、14、21、28天分别采集试验草鱼血液,用于检测血液细胞组分、血清溶菌酶、血清SOD;试验第29天,对各组试验草鱼进行腹腔注射嗜水气单胞菌活菌,记录攻毒后14天内各组草鱼的存活率。结果表明,与对照组相比,试验第14天时,以2%和4%剂量添加的复方制剂A分别显著提高草鱼白细胞吞噬活性128%和143%,分别提高草鱼血清溶菌酶活性69%和85%,分别提高草鱼血清SOD活性61%和55%;连用28天对草鱼的保护率分别达到49%和55%,复方制剂A对草鱼非特异性免疫增强效果优于复方制剂B和C。     

草鱼出血病病毒VP7蛋白基因的人工合成与原核表达

根据GenBank已发表的GCRVVP7蛋白基因序列,设计合成2条特异性引物和19条搭桥引物,通过搭桥PCR人工合成带有3处变异碱基的GCRVVP7蛋白基因整个编码框,经过酶切、连接、PCR鉴定和测序鉴定克隆到原核表达载体pColdTF中,并转化大肠杆菌BL21(DE3),进行IPTG诱导表达和表达产物的SDS-PAGE、Western-blotting分析、纯化以及反应原性的iELISA检测。结果表明,成功人工合成了长831bp的GCRV VP7蛋白基因编码框和构建了VP7蛋白基因的重组质粒pCold TF-VP7,pColdTF-VP7转化菌经IPTG(1mmol/L)诱导3—4h即可获得特异性蛋白VP7重组蛋白的高效表达,VP7重组蛋白相对分子量大小约为73.9ku,与预期大小相符,且与鼠抗GCRV血清有良好反应原性。     

白斑综合症病毒极早期蛋白WSV403相互作用蛋白的筛选

WSV403是白斑综合症病毒(WSSV)的一个极早期基因,它编码一种E3泛素连接酶。在293T细胞中,利用串联亲和纯化和蛋白质谱技术筛选WSV403的相互作用蛋白,获得了15个可能与WSV403结合的蛋白。在此基础上对5个候选基因进行了克隆,并分别将它们与WSV403基因共表达。通过免疫共沉淀和免疫荧光分析证实了WSSV极早期蛋白WSV403能够与核转运蛋白(KPNA6)、丝/苏氨酸蛋白磷酸酶2A 65 kDa调节亚基A(PPP2RIA)和striatin(STRN)发生相互作用。该研究结果为进一步揭示WSV403的作用机制奠定了基础。     

垂盆草(Sedum sarmentosum)水提物对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)脂肪性肝损伤治疗效果研究

为了研究景天科中药植物垂盆草(Sedum sarmentosum)水提物对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)脂肪性肝损伤治疗作用及机理,本试验通过对连续投喂6周8.1%(鱼油5%+大豆油3.1%)高脂饲料建立的草鱼脂肪性肝损伤模型,投喂添加1200mg/kg、300mg/kg浓度的垂盆草饲料进行6周治疗,测定血清主要脂肪代谢相关生化指标、制作肝脏病理切片及应用半定量RT-PCR技术检测肝细胞脂肪代谢相关酶肉碱棕榈酰转移酶I(CPT-1)、过氧化物酶体增殖物激活受体-α(PPAR-α)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)m RNA相对表达量变化。结果表明:连续投喂6周的高脂饲料草鱼血清生化指标发生显著变化,组织病理学观察肝细胞发生严重的脂肪变性,故已成功建立了草鱼脂肪性肝损伤模型。通过6周治疗,1200mg/kg剂量组、300mg/kg剂量组均可显著降低模型动物的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、甘油三酯(TG)和总胆固醇(CHO)(P0.01);组织病理学观察显示,1200mg/kg、300mg/kg剂量组的肝细胞脂肪变性程度与高脂组相比有一定程度的改善;同时半定量RT-PCR检测结果表明:用药1200mg/kg、300mg/kg剂量组草鱼肝脏CPT-1 m RNA、PPAR-αm RNA相对表达量均显著高于高脂组(P0.01),且1200mg/kg剂量组TNF-αm RNA表达量显著低于高脂组(P0.01)。本研究结果表明肝脏是草鱼脂肪沉淀的主要场所,饲料中添加垂盆草水提物可对8.1%高脂饲料引起的草鱼肝脂肪性组织损伤具有治疗作用,该治疗作用与促进肝细胞脂质代谢途径有关。     

对虾白斑综合症病毒VP37基因诱饵重组载体的构建、转化与自激活作用检测

把对虾白斑综合症病毒(White syndrome spot virus,WSSV)黏附蛋白VP37的基因C末端截去102个碱基后设计了一对引物,通过PCR扩增出目的片段。用其构建酵母双杂交诱饵载体,并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用和自激活活性。结果获得截短的VP37基因片段,并成功克隆入酵母双杂交系统PGBKT7 DNA-BD载体中,测序结果表明序列完全正确。把重组载体转化酵母菌AH109并检测自激活作用。结果显示表达的融合蛋白没有激活ADE2,HIS3这2个报告基因,但激活了MEL1,该融合蛋白对酵母菌AH109无毒性。可利用其它2种报告基因将其应用于酵母双杂交系统,筛选cDNA文库中与之相互作用的基因。     

允饲植物源复方制剂对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)组织形态和生长性能的作用研究

为了进一步评估由白芍(Radix paeoniae Alba)、杜仲(Eucommia ulmoides)和知母(Rhizoma anemarrhenae)组成且具有免疫增强作用的复方制剂A、B、C对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)组织形态和生长性能方面可能存在的风险,本试验将二龄草鱼随机分成12个试验组和2个对照组,分别连续投喂含有不同复方制剂的饲料和空白饲料,在试验第7、14、21、28天分别随机从对应试验组中采集5尾草鱼肝胰脏、脾脏、肾脏和肠道进行切片制作和组织形态分析;在试验第0、29天分别随机从对应试验组中采集10尾草鱼进行肥满度、增重率、特定生长率、脏体比和肠道承重力测定。结果表明,分别以2%、4%剂量添加于草鱼饲料中的复方制剂A、B、C对试验草鱼阶段增重率、特定生长率、饵料系数、肝胰体比、肾体比和肠道承重力系列指标均无异常影响。组织形态分析方面,复方制剂A对草鱼肝胰脏、脾脏、肾脏和肠道具有良好的安全性,而复方制剂B、C经连续投喂21天起,对应剂量组草鱼肝胰脏、肾脏逐渐呈现不同程度的组织病变。本文得出结论认为,即使完全符合允饲要求的天然植物品种,缺乏基于较全面的评价维度试验证明其具有使用安全性,则容易仅关注允饲天然植物在效果表达的表象,而忽略其诱发的组织病变造成组织器官的功能衰退。     

几种污染物对草鱼细胞SCE的影响

1987年10月—1988年6月期间,以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)ZC-7901细胞株和1龄稚鱼作实验材料,选5种金属盐和4种农药作水体环境的污染物,对培养细胞和稚鱼进行处理,观察培养细胞和鱼体内肾细胞SCE的变化。结果表明:在每毫升培养基中分别含有104×10~(-7)mg的Cr~(6+),112×10~(-7)mg的Cd~(2+),74.9×10~(-7)mg的As~(3+),20l×l0~(-6)mg的Hg~(2+),207×10~(-4)mg的Pb~(2+)及216×10~(-4)mg的敌百虫等污染物,都能诱使培养细胞的SCE明显增加;稚鱼在每升分别含有15×10~(-7)g的Cr~(6+),15×10~(-7)g的Cd~(2+),13×10~(-7)g的Hg~(2+)的池水中喂养40天后,体内肾细胞的SCE也见增加;但是三环唑、甲胺磷、呋喃丹对细胞的SCE没有影响。本文认为,能够引起草鱼SCE变化的污染物的浓度,应该作为今后制定水质标准的参考;同时,草鱼培养细胞和体内肾细胞SCE的检测技术,可以发展成为一种监测水体环境污染的检测系统。     

温度对草鱼能量收支的影响

于１９９２年４月－１９９２年５月在２２，２６及３０℃，以莴苣叶为食物，不限量摄食，测定草鱼的能量收支。结果表明，草鱼摄食率及生长率均随温度上升而增加；最大摄食率与水温的关系温度对食物能分配于能量收支各组分的比例没有显著影响，在３个温度测定的平均能量收支式为：１００ｃ＝２９．８９Ｆ＋３．３０Ｕ＋５２．４８Ｒ＋１４．３４Ｇ，式中Ｃ为食物能，Ｆ为排粪能，Ｕ为排泄能，Ｒ为代谢能，Ｇ为生长能。     

草鱼血清中一种新的凝集素免疫因子

于1998年5月－2000年3月，在浙江省杭州市采集草鱼，采用硫酸铵盐析和梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，从血清中分离出一种自然凝集素，对其理化和生物学性质进行研究。结果表明，该凝集素能够识别和凝集多种不同的红细胞、细菌和酵母，具有100000g离心不沉降，不被透析，耐热、耐酸、耐碱，抗DNase、RNase、SDS和乙醚，对胰蛋白酶、糖苷酶、糖氧化剂NaIO4和β－巯基乙醇敏感等特性，是一种分子量为67kD、等电点为6．2的糖蛋白分子。其活性能被半乳糖、乳糖、甘露糖和N－乙酰葡糖胺所抑制，其抗原特异性不同于草鱼凝集集抗IgM，表明两者是不同的物质。草鱼凝集素显著地促进巨噬细胞的吞噬、杀菌能力，说明是一种重要的免疫活性因子。     

草鱼外周血淋巴细胞体外转化诸因素的研究

于１９９３年３月－１９９３年１１月，采自＾３Ｈ－ＴｄＲ同位素掺入法，分别测定草鱼外周血中淋巴细胞在经两种特异有丝分裂植物凝集素（ＰＨＡ）与金黄色葡萄球菌蛋白Ａ（ＳＰＡ）刺激后发生的Ｔ淋巴细胞与Ｂ淋巴细胞应答转化的平均刺激指数（ＳＩ）的值，经不同浓度的ＰＨＡ与ＳＰＡ刺激的Ｔ，Ｂ淋巴细胞转化实验表明，两种有丝分裂原促Ｔ，Ｂ淋巴细胞应答转化的最适剂量，ＰＨＡ为５００μｇ／ｍｌ，ＳＰＡ为０．０５％，用不同     

草鱼卵巢在第一次性周期内发育的研究

关于鱼类性腺发育的研究,自1963年以来先后有Malone,Dixit,Basile,Eournier,Guraya等等,做过一些工作。但早在六十年代初期,我国即有一些单位对萆、青、鲢、鳙的性腺发育进行了研究。而对草鱼性腺在第一次性周期内的发育却研究得很不系统,特别是对江西省水域中草鱼卵巢发育的规律,尚无系统资料。家鱼人工繁殖的实践也表明:培育好亲鱼使其性腺发育到生长成熟阶段(即能进行催情的阶段)是人工繁殖成败的关键,现将我们的实验工作报道如下。     

酪蛋白小肽和氨基酸对草鱼(Ctenopharyngodon idella)血液循环和组织蛋白质合成的影响

采用草鱼前肠灌注和3H-Tyr同位素标记方法,进行酪蛋白小肽和氨基酸对草鱼血液循环和组织蛋白质合成的影响研究。结果表明,灌注酶解酪蛋白(CSP)溶液组的草鱼血液循环中总肽量为19430.82μv/μl,灌注游离氨基酸(FAA)溶液组的草鱼血液循环中总肽量为16033.00μv/μl,前者显著高于后者(P0.05),同时前者的大多数肽段肽量也高于后者,2组血浆中某些肽段肽量有显著(P0.05)或极显著差异(P0.01)。CSP与FAA组草鱼肠道、肝脏、背肌组织蛋白质合成率(%/d)分别为96.84和72.25,98.64和81.65,65.38和46.59,CSP组草鱼显著或极显著高于FAA组(P0.05或P0.05)。草鱼血浆中总肽量和某些肽段肽量分别与草鱼肠道、肝胰脏和背肌组织蛋白质合成率有明显的正相关。实验表明,肠道对酪蛋白小肽的迅速吸收和进入血液循环中的某些小肽可能是促进草鱼组织蛋白合成的重要因素。