条斑紫菜类囊体膜蛋白质组双向电泳研究方法

以蓝绿温和胶电泳为工具,首次在国内用于条斑紫菜(Porphyra yezoensis)类囊体膜色素蛋白质复合物的研究。结果显示:(1)利用非离子型去污剂十二烷基麦芽糖苷(DM)增溶条斑紫菜类囊体膜,DM/Chla(w/w)15︰1产生的效果较好,在BN-PAGE胶中可以分离到较多较清晰的条带。(2)选取蔗糖密度层50%条带制备得到的类囊体膜样品进行第一向BN-PAGE和第二向SDS-Urea-PAGE电泳实验。第一向电泳分离出4个蛋白复合物,对第二向电泳胶上的15个蛋白点切取做质谱鉴定,检测到PSⅡ47ku,PSⅡ44ku,cytochrome f,PSⅡD2,PSⅡD1等蛋白。本实验证实了温和胶电泳与SDS电泳结合对于条斑紫菜这种原始红藻的类囊体膜研究方面应用的可行性。     

温度、光强和pH对条斑紫菜孢子体和配子体类囊体膜上光系统活性的影响

光合作用研究中,对于个体发育过程中类囊体膜蛋白结构和功能的变化所知甚少,其中的一个限制因素是能否纯化得到大量高活性的稳定且均一的膜蛋白。作者以条斑紫菜（Porphyra yezoensis）2个不同发育阶段（孢子体和配子体）作为研究对象,分离得到了孢子体和配子体的类囊体膜．在不同的温度、光强和pH下,对其类囊体膜上的光系统活性进行了研究。结果表明,孢子体和配子体的PSⅠ活性均随温度和光强的升高而呈现一个先升高后降低的趋势,在温度18℃,光强为2320lx时具有最高的PSⅠ活性。而孢子体乖配子体的PSll活性随温度和光强的变化趋势不明显,孢子体PSⅡ活性在温度18℃,光强为2320lx时最高,配子体PSⅡ活性在温度13℃,光强为2800lx时最高。孢子体PSⅠ在酸性条件下较活跃,在pH5．4时具有最高的PSⅠ活性,配子体PSⅠ在碱性条件下较活跃,PSⅠ活性在pH10．4时最高;孢子体PSⅡ活性随pH的升高呈现一个先升高后降低的趋势,配子体PSⅡ活性随pH变化趋势不明显,但都在pH8．0处活性最高。     

适用于条斑紫菜的双向电泳样品制备方法

为了建立适于条斑紫菜(Porphyra yezoensis)蛋白质组学分析的的样品提取方法, 作者以条斑紫菜叶状体为材料, 比较了饱和硫酸铵沉淀法、三氯乙酸/丙酮沉淀法和酚提取方法3 种方法对条斑紫菜叶状体总蛋白的提取效果。结果表明, 针对条斑紫菜叶状体细胞中含有大量多糖, 多酚化合物, 色素等干扰物质的特点, 通过酚提取方法能有效去除这些干扰杂质, 得到清晰、稳定、干净的双向电泳图谱和相对较多的蛋白质点数, 为提高其他大型海藻的总可溶性蛋白提取效率提供了重要参考。     

不同品系条斑紫菜光合效率比较研究

用叶绿素荧光仪测试了7个品系紫菜叶状体在不同光照和温度条件下的光合效率,分析了受强光抑制后光合效率恢复的情况,并测试了这些品系的光合色素含量。结果显示,随着光照强度从20μmol.m-2.s-1提高到1 200μmol.m-2.s-1,总的趋势是光合效率逐渐降低,但下降幅度在不同品系间又有差异:相比20μmol.m-2.s-1光照下条件下光合效率,Yjs在1 200μmol.m-2.s-1时的光合效率下降了27%,Yw下降了33%,Gm下降了53%,Yqd下降了50%。在120μmol.m-2.s-1光照条件,5~20℃实验范围内,15~20℃条件下光合效率最高,除Yh2和Wjs,其它品系叶状体均在15℃达到顶峰,Yh2和Wjs则在20℃达到顶峰。在受到高光抑制(200μmol.m-2.s-1)后,处于光照60μmol.m-2.s-1,温度12℃条件下紫菜光合效率可在30~60 min内恢复。未发现光合色素含量与光合效率的相关性。文章还对紫菜光合效率与生态条件的关系进行了分析和讨论。     

条斑紫菜单孢子的研究

研究了条斑紫菜不同栽培品系间在单孢子形成方面的差异，并采用RAPD方法研究了它们之间的遗传距离，还研究了温度、藻体不同发育时期、干出对单孢子形成的影响，结果表明，产生单包子多的品系与单孢子少的品系间遗传距离较远，单孢子多的品系间、单孢子少的品系间遗传距离都较近；室内培养环境能够形成单孢子的最低水温高于自然海区；大于几十个细胞的藻体在合适的温度下可以持续形成单孢子，一直到藻体成熟；在成熟的藻体上仍有单孢子放散，但大量的果胞也可以以与单孢子相同的方式放散并萌发成苗，干出对单孢子的产生没有明显的影响。     

条斑紫菜离体组织再生苗的研究

条斑紫菜叶状体离体组织（切块）在一定培养条件下,其营养细胞经过一系列的变化可产生出幼茵。本研究发现切块越小出苗越早、单位面积离体组织出苗量越多。成熟叶状体上靠近雌雄性细胞的区域与其他部位的营养细胞相比形成幼苗较早,离这一区域越远的细胞成苗越晚。离体组织细胞成苗的适宜水温为１５￣１７℃。在２０￣２５℃下部分细胞进行不规则分裂形成深紫红色的细胞团。当降温至１７℃时,它们仍可转化为幼苗。     

利用AFLP技术研究条斑紫菜的遗传变异

利用AFLP技术对11个条斑紫菜品系进行了研究.由16对引物共扩增出778条谱带,其中仅15条为共有谱带,多态位点的比例高达98.07%.日本鹿儿岛,我国的青岛、江苏、浙江等不同地点的野生或栽培条斑紫菜品系之间最近的遗传距离为0.180(两个日本样本之间),最远为0.397(日本样本与江苏样本之间),属于物种内种群间的遗传变异.聚类结果显示日本的样本与青岛的野生样本间的遗传相似系数较高而聚合在一起;浙江野生条斑紫菜与江苏的样本遗传距离相近,聚合在一起.结果表明,我国条斑紫菜的遗传多样性程度较高而且各品系间的遗传距离与其地理间距呈正相关关系.     

不同条件下条斑紫菜光合效率的比较研究

用叶绿素荧光仪测试了7个条斑紫菜品系在不同氮磷浓度、盐度、pH及光质条件下的光合效率及光合色素含量。结果显示,条斑紫菜叶状体最适氮浓度为1.0～1.5mg/L,最适磷浓度为0.05～0.15mg/L;在盐度为20～30条件下紫菜的光合效率保持较高的水平;紫菜生长的适宜pH值为8.0。在其它条件相同时,紫菜在不同的光质照射下光合效率顺序为:白光绿光红光蓝光。所实验紫菜品系的藻红蛋白含量和变异幅度均显著大于藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白,而叶绿素含量无明显变异。     

渤海湾条斑紫菜养殖的初步研究

本文对2017年11月下旬至2018年5月上旬在渤海湾养殖的条斑紫菜进行整个生长周期(1月中旬-3月中旬结冰期除外)的取样调查,并对其生长的海域环境因子进行实时监测。通过对头茬紫菜的生长状况与环境因子数据进行分析,初步证实,条斑紫菜适宜在渤海湾海域生长,水温、盐度、pH和亚硝酸盐是限制其生长的重要环境因子,如若在该海域环境条件适宜时及时张挂网帘,其生长期可延长至5个月左右。调查还发现,如何渡过冬季结冰期是该海域条斑紫菜养殖亟待解决的关键问题,本文亦提出两种方案,效果如何还有待进一步试验论证。     

复苏的不同条件对条斑紫菜细胞活性的影响

对冷藏的条斑紫菜叶状体在不同光照和温度条件下进行复苏实验。复苏的紫菜经海螺酶解离成为单细胞 ,通过染色检查其细胞活性并且将单细胞培养于适宜的条件下 ,观察其生长和发育状况 ,以了解不同复苏条件对冷藏叶状体细胞生理状态的恢复程度。结果表明 :(1)光照不是复苏的必要条件 ;(2 )温度对复苏很重要 ,2 5℃是条斑紫菜的致死复苏温度 ,10°～ 2 0℃是适宜的复苏温度。 (3)复苏时间随温度升高而减少。在 10℃的消毒海水中 ,至少需经历 2 d,才能达到完全复苏 ;15℃需 1.5d;2 0℃需 1d;2 3℃复苏时间可减少到 12 h。复苏主要是细胞吸水膨胀的过程 ,海水中已经存在足够的营养元素 ,紫菜细胞在一定的温度下复苏一段时间后 ,细胞活性恢复 ,酶解后细胞死亡率低 ,酶解后存活的单细胞在适当培养条件下 ,几乎可以全部发育成苗。生产上可以选择在较高温度下 ,短时间复苏即可大量出苗 ,实现生产上早出苗的目的。     

Isolated Cells of Porphyra yezoensis Cultured on Solid Medium

Vegetative cells of Porphyra yezoensis are isolated with sea snail enzyme and cultured on the solidified agar medium. The results of experiments show that the isolated cells can survive,divide and regenerate well on the medium solidified with agar. The first division on the solid medium starts after 7 days' culture, 4 days later than the liquid culture. The survival rate of isolated cells is 71.3% on the solid medium, lower than the 86.2% of that in seawater.Thalli, thalloids,conchocelis, spermatangia and multicellular masses are developed on the solid/medium in the first month, slowly but normally. Spermatangia sacs disappear within 4 weeks. Without adding nutrient liquid onto the surface of solid medium or injecting seawater under the agar layer in order to keep moisture, the thalli and cell groups release monospores to form new thalli instead of enlarging their areas after 5 weeks' culturing. Some monospores regenerate new thalli. Other monospores lose their pigments and minimize their volume and divide quickly to form light pink calli. After 16 weeks, numerous calli can be seen on the solid medium and after 24 weeks' culturing, almost only calli and conchocelis can be seen. If the calli are immersed in seawater, the monospores are released and may develop into young thallus.     

条斑紫菜单细胞固体培养的初步研究

成熟条斑紫菜叶状体酶解后获得单细胞,分别培养于添加了不同浓度N,P营养盐的0．5％和10％的琼胶培养基上,观察细胞的分化发育情况。结果显示：(1)营养细胞大部分先发育为细胞团,细胞团放散孢子,再由孢子萌发形成小苗。其余营养细胞极性分裂形成正常细胞苗或带假根的形状不规则的片状体。孢子茁和营养细胞直接形成的幼苗生长到一定大小均可放散单孢子,单孢予能够正常萌发形成单孢子苗。(2)在0．5％的琼胶培养基上或较高浓度的营养盐中,细胞发育快。添加5mg／L NO3-N和0．5mg／L H2PO4—P营养盐不能满足细胞生长发育的需要,培育20d绝大部分仍为单细胞,不能形成正常幼苗。     

不同时期和生长状态条斑紫菜总可溶性蛋白差异表达初探

用SDS-PAGE技术研究了不同时期条斑紫菜样品、高温下培养的丝状体以及不同季节收获的叶状体的总可溶性蛋白。结果表明,这些样品总可溶性蛋白的表达数量和种类相差很大。壳孢子中总可溶性蛋白的表达数量和种类明显比丝状体中多,但比膨大丝状体中少;高温条件下培养的丝状体比正常条件下培养的丝状体表达更多数量和种类的可溶性蛋白;所有样品中,以叶状体表达的溶性蛋白的表达数量和种类最多;上年收获的与本年度不同季节收获的叶状体在蛋白质表达图谱上差别很小。     

条斑紫菜冷冻前不同处理对细胞活性的影响

将新鲜幼嫩条斑紫菜叶状体在不同温度和通风状态下,干燥处 理后冻存于-20℃冰箱中。30d后酶解成单细胞,检查其活性和再生能力。结果表明,条斑紫 菜含水量为81.8%,在含水35%时冻藏可保持最大的活性。适宜的含水量范围是30%～40%。冷 冻前含水量高于40%时,复苏后细胞外观虽然正常,但酶解后存活率低,发育迟缓;冷冻前 含水量低于30%时,复苏后在叶状体上可见成片细胞死亡,色素弥散,形成红色斑块。酶解 后细胞死亡率高。阴干处理期间,温度的变化(10℃～25℃)对冷冻后的紫菜细胞活力没有明 显影响。     

条斑紫菜叶状体细胞的抗生素敏感性研究

为了进行条斑紫菜基因工程研究和培育转基因紫菜 ,首先必须确定适合的阳性选择标记基因。条斑紫菜对 8种抗生素的敏感性试验表明 ,它对各种抗生素的敏感性不同 ,其中 zeocin、腐草霉素和氯霉素半致死剂量都很低。因此 Cat(氯霉素乙酰转移酶 )基因和 Sh.ble(sh.bleomycin)基因均有望成为条斑紫菜基因工程研究中理想的选择标记基因。