缘管浒苔5.8SrDNA及其转录间隔区的序列测定及分析

利用PCR扩增、克隆和测序的方法对青岛市红岛虾池生长的缘管浒苔(Enteromorpha linza)的5.8S rD-NA及其转录间隔区ITS序列进行了分析,并依据ITS序列构建了浒苔属不同种之间的进化树。结果表明,获得了核糖体DNA完整的ITS和5.8S rDNA序列,ITS1为195 bp,5.8S rDNA为155 bp,ITS2为184 bp,总长度GC含量为63%。缘管浒苔与浒苔和曲浒苔的序列差异百分率较小,分别为2.4%和4.6%,与(U.olivascens)的序列差异百分率最大,为16.7%。Kimura-2参数遗传距离结果表明缘管浒苔和浒苔的遗传进化关系较近。     

东海原甲藻的分子鉴定

采用nrDNAITS序列及18S序列两种分子标记,对东海原甲藻和美国国家海洋藻种保藏中心(CCMP)的具齿原甲藻进行分子鉴定,结果表明,两者之间序列非常相似,两者的nrDNAITS序列碱基差异值仅为0.002,nrDNA18S序列的碱基差异值为0.000,根据分子数据,东海原甲藻和美国国家海洋藻种保藏中心的具齿原甲藻应为同一个种.从基因库获取原甲藻的另外3个种nrD-NAITS序列和8个种的18S序列,用计算机软件进行分析和构建分子系统树,结果显示18S序列用于原甲藻的分子鉴定过于保守,而nrDNAITS更适合于该种属界定的分子标准.     

2种分子标记应用于澄黄滨珊瑚群体遗传多样性研究中的可行性

利用PCR技术对澄黄滨珊瑚的2种分子标记（线粒体细胞色素氧化酶亚基1基因COI和核糖体RNA内转录间隔区基因ITS）进行测序,探讨COI序列和ITS序列在澄黄滨珊瑚（Porites lutea）群体研究中的适用性,并从中选出最适合研究澄黄滨珊瑚群体遗传多样性的分子标记．结果显示COI序列变异位点少,成对序列差异在群体内、群体间都很小,不适于澄黄滨珊瑚的群体研究;而ITS区序列个体内成对的序列差异仅为0．35％,可以作为研究澄黄滨珊瑚群体遗传多样性的分子标记;通过对ITS1、ITS2、5．8SrRNA、ITS1＋ITS2及ITS区序列的比较,认为ITS1＋ITS2序列是最适合研究澄黄滨珊瑚群体遗传多样性的分子标记．本研究为以后研究我国沿岸造礁石珊瑚澄黄滨珊瑚的群体遗传结构提供方法依据,从而为保护管理扣恢复受损珊瑚礁生态系统提供遗传学数据支持．     

文蛤属(Meretrix)16S rRNA基因及ITS1序列的系统学分析

利用线粒体16SrRNA基因片段及核糖体DNA转录间隔区ITS1序列分析的方法,以近缘属的青蛤(Cyclinasinensis)为外群,对文蛤属的文蛤(M.meretrix)、丽文蛤(M.lusoria)、帘文蛤(M.lyrata)和斧文蛤(M.lamarckii)4种贝类进行了系统学研究。经ClustalX多重比对及DNAsp软件分析后,用PAUP4.0分析软件,计算出种间序列的碱基转换/颠换频率,利用邻接法NJ构建系统发育树。结果表明,帘文蛤与该属其他三种的分歧时间较早,两类序列与其他种类间的相对遗传距离分别在0.25866—0.28218和0.15644—0.20104之间。文蛤与丽文蛤间的16SrDNA及ITS1序列间的遗传距离仅为0.04805和0.04201,拓扑结构图显示关系很近,并且二者的分布区大面积重叠,其序列间的转换/颠换频率接近种内单元型(haplotype)间的序列变化,鉴于它们的贝壳形态有一定差别,应归为同一个种内的不同地理亚种比较恰当。     

中国明对虾核糖体ITS1序列分析及其在对虾科系统分析中的应用

对采自不同群体的5个中国明对虾个体的核糖体RNA转录单元内间隔区1(ITS1)序列特点进行分析,并利用GeneBank数据库中已有的对虾科(Penaeidae)ITS1同源序列对对虾科虾类进行系统分析,探讨ITS1序列在对虾科系统及演化中的应用.结果表明,中国明对虾ITS1序列在个体间和个体内都表现出长度多态性,序列长度范围为637～652 bp,这种长度多态性主要是由于微卫星DNA简单重复序列的重复次数不同所造成.在中国明对虾ITS1序列中发现8个微卫星位点,根据目前已知的12种对虾的ITS1序列,发现某些微卫星位点只存于1种对虾中,如(CAGC)_(2-4)只存在于中国明对虾中,(CGGA)_(4-9)只存在于斑节对虾中,(GCGA)_4只存在于短沟对虾中.利用ITS1序列对12种对虾进行的系统分析表明,12种对虾分为4个类群,同种的不同个体,同属的不同种各自聚支,与形态分类比较吻合.对虾科属间遗传距离范围为0.313～0.977,平均值为0.633,远高于用线粒体基因片段得出的属间的遗传距离,支持将原对虾属的6个亚属提升为属的观点.     

Sensitive and rapid detection of two toxic microalgae Alexandrium by loop-mediated isothermal amplification

A loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay was designed and evaluated for rapid detection of the toxic microalgae Alexandrium catenella and A.minutum,which can produce paralytic shellfish poisoning (PSP).Two sets of four specific primers targeting these two species were derived from the sequence of internal transcribed spacer (ITS) of ribosomal DNA.The method worked well in less than an hour under isothermal conditions of 65 C.LAMP specificity was validated in closely related algae as a comparison,suggesting the strict specificity of the LAMP primers.Two visual inspection approaches were feasible to interpret the positive or negative results.The detection limits of A.catenella and A.minutum samples using the LAMP assay were found to be 5.6 and 4.5 pg DNA,respectively.The sensitivity of this LAMP assay was 10 or 100-fold higher than Polymerase Chain Reaction (PCR) method in detecting the two microalgae.These characteristics of species specificity,sensitivity,and rapidity suggest that this method has the potentiality in the monitoring of red tide caused by A.catenella and A.minutum.     

Molecular analysis of complete ssu to lsu rdna sequence in the harmful dinoflagellatealexandrium tamarense (korean isolate, HY970328M)

New PCR primers (N=18) were designed for the isolation of complete SSU to LSU rDNA sequences from the dinoflagellateAlexandrium tamarense. Standard PCR, employing each primer set selected for amplifications of less than 1.5 kb, successfully amplified the expected rDNA regions of A. tamarense (Korean isolate, HY970328M). Complete SSU, LSU rDNAs and ITS sequences, including 5.8S rDNA, were recorded at 1,800 bp, 520 bp and 3,393 bp, respectively. The LSU rDNA sequence was the first report inAlexandrium genus. No intron was found in the LSU rRNA coding region. Twelve D-domains within the LSU rDNA were put together into 1,879 bp (44.4% G+C), and cores into 1514 bp (42.8% G+C). The core sequence was significantly different (0.0867 of genetic distance, 91% sequence similarity) in comparison withProrocentrum micans (GenBank access. no. X16108). The D2 region was the longest in length (300 bp) and highly variable among the 12 D-domains. In a phylogenetic analysis using complete LSU rDNA sequences of a variety of phytoplankton,A tamarense was clearly separated with high resolution against other species. The result suggests that the sequence may resolve the taxonomic ambiguities ofAlexandrium genus, particularly of the tamarensis complex.     

黄海西部细弱刚毛藻（刚毛藻目，绿藻门）的表型可塑性与分类——暗示基因序列作为DNA条形码的可行性

由于广泛的形态可塑性,导致刚毛藻属物种的分类仍存在不确定性。作为分布较广的物种之一,细弱刚毛藻已报道了许多变异类型,这为对其鉴定造成了困难。针对这个问题,本研究通过采集于黄海西部相似于细弱刚毛藻的9个样品,分析了它们的形态多样性。一些样品具有明显的可变鉴定特征,难于利用形态分类准确鉴定。因此,采用18S rDNA和 ITS序列对它们进行了分子鉴定。其中,样品的18S rDNA序列相似度为99.6%-100%,而ITS的为98.7% -100%。分子数据强烈地支持了形态可变的样品可准确定位为细弱刚毛藻。通过对样品分类特征的比较分析发现,作为分类标准的分枝方式和密度、藻体颜色、藻体高度和质地受环境影响和藻体成熟度而发生较大变化。此外,作为相对稳定的特征,细胞大小在种内水平上也常发生变化。18S rDNA和ITS序列在本种鉴定上的成功应用,表明以DNA条形码为基础的基因序列分析可作为传统形态分类学强有力的辅助方法。     

烟台海域暴发浒苔ITS及5.8S rDNA的克隆及序列分析

以烟台海域引发"绿潮"的浒苔为研究对象,采用PCR技术扩增出浒苔的ITS-1、5.8SrDNA及ITS-2片段,将扩增出的片段纯化后克隆至pGEM-TEasy载体,筛选阳性克隆进行序列测定。结果表明,浒苔的ITS-1序列长度为195bp,5.8S序列为155bp,ITS-2序列为181bp,该序列与浒苔属的多种物种ITS序列具有很高的同源性,在ITS-1区、5.8SrDNA区和ITS-2区仅存在4个转换/颠换位点。结合GenBank注册序列和本研究的结果发现,单纯依靠ITS序列并不能对浒苔属种类进行有效的分类鉴定。     

核酸分析技术在红藻分子系统学研究中的应用

在红藻的分子系统学研究中,核酸分子数据的获得和应用日益显得重要,因为核酸序列是进化的重要单元,通常以点突变来体现种间/种内的差异,因此能反映物种进化过程的频率.目前,在红藻分子系统学研究中,核酸标记技术有：限制性片段长度多态性（RFLP）、随即扩增多态性DNA（RAPD）、扩增片段长度多态性（AFLP） 和简单重复序列间扩增（ISSR）;相关核酸分析技术涉及到的序列有：内转录间隔区（ITS）、18S和26S rRNA,核糖体大、小亚基（LSU和SSU）,Rubisco基因及大、小亚基.其在红藻品种鉴定、种群遗传、分类和系统进化的研究中起重要的作用.     

Identification of Perkinsus-like parasite in Manila clam, Ruditapes philippinarum using DNA molecular marker at ITS region

Genomic DNA was extracted from hypnospores of Perkinsus-like parasite of Manila clam Ruditapes philippinarum collected at the fishing grounds in Huanghai Sea coast Shicheng Island and East China Sea coast Ningbo, China. The internal transcribed spacer（ITS） in rDNA was PCR-amplified, cloned, sequenced, and compared with that of five Perkinsus species in GenBank. The fragment amplified from DNA of parasite of either Shicheng Island or Ningbo contained 649 bp, including partial ssrRNA（51 bp） and ITS（＋5.8 S） （598 bp） regions. The ITS（＋5.SS） sequences of Perkinsus-like parasite of both Shicheng Island and Ningbo were all 99% identical to those ofPerkinsis atlanticus, and were not more than 95% identical to those of other four Perkinsus species including P. marinus, P. andrewsi, P. qugwadi and P. medierraneus.The ITS （＋5.8S） sequence of Perkinsus-like parasite of Shicheng Island was 99% identical to that of Ningbo. These facts about nucleotide sequences suggested that the Perkinsus-like parasite in Manila clam, Ruditapes philippinarum collected from either the Huanghai Sea coast or the East China Sea coast was P. atlanticus, and might reflect P. atlanticus strains of distinct geographic distribution.     

三株赤潮硅藻5.8S rDNA及转录间隔区(ITS)的克隆及序列分析

对引发赤潮的3株硅藻——1株尖刺拟菱形藻(Pseudo-nitzshia pungens)和2株中肋骨条藻(Skeletonema costatum)的5.8SrDNA和ITS(internal transcribed spacers)序列进行了PCR扩增、克隆和序列测定,并分析了硅藻门10株赤潮藻(7株从GenBank获得)的系统进化关系.研究结果表明,尖刺拟菱形藻的ITS和5.8SrDNA的长度为693bp,SK-1(分离自东海赤潮暴发区)测序得到715bp,除ITS和5.8SrDNA外,还包含部分18SrDNA和28SrDNA;SK-2(分离自青岛养殖场)的ITS和5.8SrDNA的长度为331bp,尖刺拟菱形藻与从GenBank中获得的2株尖刺拟菱形藻相似程度最高,为100%,与该属的多列拟菱形藻相似程度稍低,为82.9%.SK-2的ITS序列与SK-1的相似程度很低,只有51%,但与拟中肋骨条藻的ITS序列相似程度高,为95.5%.SK-1的ITS序列与拟中肋骨条藻的相似程度也低,为56.7%.系统进化树反映的结果与相似性反映的结果一致.研究的该株尖刺拟菱形藻从根据ITS序列研究的结果与形态鉴定的结果看是一致的;SK-2可能属于拟中肋骨条藻;SK-1比较特殊,有待于用其他的方法进一步研究确定其分类地位.     

龙须菜5.8S rRNA和ITS区的克隆与系统学分析

研究青岛产龙须菜居群内的遗传多样性和系统学分类,通过对龙须菜居群内不同个体的5.8S rRNA-ITS区(包括ITS1-5.8S rRNA-ITS2)进行PCR扩增和序列分析,得到扩增DNA片段长度均为1 066 bp,包含完整的ITS1(250 bp)、5.8S(159 bp)和ITS2(657 bp);利用GenBank数据库对Cracilaria(江蓠属)和Gracilariopsis属共20个物种的rRNA-ITS相应序列进行了比较和系统进化分析.结果表明,龙须莱和江蓠科19个物种中rRNA的5.8S区的长度和序列非常保守,而ITS区的长度和序列则变异较大,20种江蓠科物种的遗传距离在0.013～0.596之间,龙须菜在5.8S rRNA-ITS区特性上相比江蓠属物种与Gracilariopsis属物种更为相似;采用UPGMA法构建了这20种江蓠科物种的系统发育树;分析结果表明青岛产龙须菜的居群内不存在遗传差异,且应属于Gracilariopsis属,并且在江蓠科中较早分化,而龙须菜处于Gracilariopsis属中比较古老的位置.     

我国东南海域2个新记录拟菱形藻物种及其产毒特征

为丰富我国拟菱形藻属的物种多样性,并澄清其产毒特征,本文从我国东南海域分离和建立了拟菱形藻的单克隆培养株系,结合光学显微镜下的群体特征和透射电镜下的超微形态特征,还有基于核糖体转录间隔区的分子系统学数据,以及基于ITS2转录RNA的二级结构分析,鉴定到我国拟菱形藻属的2个新记录种:镰刀拟菱形藻(P.sabit Teng,Lim,LimLeaw)和中鼓拟菱形藻(P.inflatula(Hasle)Hasle)。镰刀拟菱形藻的典型形态特征是壳面呈现镰刀状,点条纹由两排孔纹组成,与并基拟菱形藻(P.decipiens)的系统学关系最为接近,ITS2-RNA有2个补偿碱基差异。中鼓拟菱形藻主要形态特征是壳面呈直线形,点条纹由单排孔纹组成,孔纹内部以上下两分区为主,与格氏拟菱形藻(P.granii)和亚弧线拟菱形藻(P.subcurvata)的亲缘关系接近,ITS2-RNA二级结构分别有4个补偿碱基差异。另外,利用高效液相色谱-质谱联用法对培养藻株的产毒特征进行了分析,未检测到多莫酸。本文为我国拟菱形藻属的物种多样性做了必要的补充,还可为拟菱形藻的毒理研究提供基础数据。     

基于16S rRNA 部分序列探讨部分鳚亚目鱼类的分子系统进化关系

通过PCR扩增获得了3科5属6种中国黄渤海海域的鳚亚目(Blennioidei)鱼类的线粒体16S rRNA基因序列片段约669bp碱基,结合来自 GenBank的5种鳚亚目其他科鱼类的相应基因片段,并以眼斑雪冰鱼(Chionodraco rastrospinosus)为外群,生成供系统发育分析的序列矩阵,利用MEGA 4.0软件分析序列的碱基组成、差异百分比、转换/颠换值等,应用最大简约法(MP)和邻接法(NJ)构建系统发育树.结果显示:在鳚亚目鱼类的16S rRNA 片段生成的序列矩阵中发现有碱基的插入缺失现象,共有207 bp变异位点,转换/颠换值为0.8,碱基平均差异为3.36;支持绵鳚(Enchelyopus elongates)归于鳚亚目绵鳚科(Zoarcidae),鳚(Azuma emmnion)归于鳚亚目线鳚科(Stichaeidae);方氏云鳚(Enedrias fangi)和云鳚(Enedrias nebulosus)种间遗传距离只有0.01,亲缘关系最近.     

坛紫菜别藻蓝蛋白α,β亚基基因的克隆和序列分析

以野生坛紫菜色素体DNA为模板, 通过PCR扩增获得编码坛紫菜别藻蓝蛋白α亚基和β亚基的序列及两者之间的间隔序列,该序列全长为1 055 bp,其中编码α和β亚基的序列均为486 bp,间隔序列为83 bp.该序列与GenBank收录的其他4种红藻相关序列的同源性在75.6%~87.4%,与2种蓝藻的同源性分别为66.9%,68.5%,其中编码区同源性更高.     

几种海水贝类甲醛浸渍标本DNA的提取及rRNA基因ITS序列的扩增

从中国科学院海洋生物标本馆收藏的8种甲醛浸渍的海水贝类标本中提取DNA并对其rRNA编码基因的ITS序列进行特异性扩增,在牡蛎Crassostrea sp．、长肋日月贝Amussium pleurondectes (Linnaeus)、扇贝Volachlamys ringaporinug(Sowerby)与华贵栉孔扇贝Chlamys nobilis(Reeve)等4个物种的标本中成功获得扩增产物。利用图片分析软什得出牡蛎标本的ITS-1和ITS-2扩增片段分别为408bp和524bp,长肋日月贝标本分别521bp和537bp,而扇贝Volachlamys ringaporinug(Sowerby)与华贵栉孔扇贝标本只获得ITS-1扩增片段,长度均为545bp。     

Molecular identification of bloom-forming species Phaeocystis globosa (Pryninesiophyta) and its dispersal based on rDNA ITS sequence analysis

The colony-forming Phaeocystis species are causative agents of dense bloom occurrences in coastal waters worldwide. It is difficult to separate them because of the different morphologies associated with their colonial stages. In this study we applied molecular approaches to analyze the genetic variation of Phaeocystis globosa and Phaeocystis pouchetii from several geographic regions, and to assist in tracing the dispersal of bloom-forming Phaeocystis species in coastal waters of China. The sequences of the internal transcribed spacers (ITS1 and ITS2) of rDNA and the 5.8S ribosomal RNA gene of Phaeocystis strains were determined. Sequence comparison shows that P.globosa was the most divergent to P. pouchetii, exhibiting sequence divergence higher than 0.08. However, lower genetic divergences existed between strains of P.globosa. The sequence comparison of the Phaeocystis rDNA ITS clearly shows that the species isolated from the southeast coast of China is identified as P.globosa rather than P. cf. pouchetii or other species. Furthermore, the significance of rDNA variation in distinct global populations of P.globosa suggested it might have had sufficient time to accumulate detectable mutations at the rDNA locus, supporting the hypothesis of ancient dispersal of P.globosa to many areas, meaning that P.globosa blooms in the coastal waters of China are endemic rather than a newly introduced species or a foreign source. Finally, based on the high divergent region of rDNA ITS, a pair of species-specific primers for P.globosa were designed, they could be useful to detect the presence of this species in mixed plankton assemblages or flagellate stages that are recognized with diffculties by means of conventional microscopy.     

长耳珠母贝核rRNA基因ITS-2序列分析

以相应引物聚合酶链式反应(PCR)扩增长耳珠母贝(Pinctada chemnitzi)核核糖体RNA基因第2转录间隔区(ITS-2),PCR产物大小约500bp,经克隆、测序,所得序列包含5．8S和28SrRNA基因部分序列和ITS-2全序列,4种碱基含量分别为27．11％(A)、24．95％(G)、21．26％(T)和26．68％(C)。5个克隆的DNA序列差异为0．0％-0．4％,不存在个体内变异。对其潜在应用进行了讨论。