坛紫菜R-藻蓝蛋白和变藻蓝蛋白的亚基组成和发色团含量

坛紫菜(Porphyra haitanensis T.J.Chang et B.F.Zheng)中的R-藻蓝蛋白在Bio-Rex 70柱上用脲溶液(pH3.0)解离和层析,得到了α和β两个亚基,用SDS-PAGE测定α和β亚基的分子量分别为18 400和20 500。变藻蓝蛋白的α和β两亚基均分子量经测定,分别为18 800和19 700。R-藻蓝蛋白和变藻蓝蛋白的分子量分别确定为117 000和112 000,两藻胆蛋白中α和β两个亚基的摩尔比都为1:1,确定两藻胆蛋白的亚基组成都为(αβ)_3。各亚基的发色团含量为:R-藻蓝蛋白中,α亚基含1个藻蓝胆素,β亚基含1个藻蓝胆素和1个藻红胆素。变藻蓝蛋白中,α和β亚基各含1个藻蓝胆素。     

坛紫菜R-藻蓝蛋白和变藻蓝蛋白的亚基组成和发色团含量

坛紫菜中的Ｒ－藻蓝蛋白在Ｂｉｏ－Ｒｅｘ７０柱上用脲溶液（ｐＨ３．０）解离和层析，得到了α和β两个亚基。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定α和β亚基的分子量分别为１８４００和２０５００，变藻蓝蛋白的α和β两亚基的分子量经测定，分别为１８８００和１９７００。Ｒ－藻蓝蛋白和变藻蓝蛋白的分子量分别确定为１１７０００和１２２０００，两藻胆蛋白中α和β两个亚基的摩尔比都为１：１，确定两藻胆蛋白的亚基组成都为（αβ）３。各     

青岛海产红藻R-藻红蛋白光谱特性的比较研究

本文对红毛菜纲(Bangiophyceae)和真红藻纲(Florideophyceae)的30种青岛海产红藻的R-藻红蛋白进行了比较研究。所测定的吸收光谱表明,这些红藻中的R-藻红蛋白可区分成两种光谱类型,即在可见光谱区有两个吸收峰的Ⅰ型R-藻红蛋白和有三个吸收峰的Ⅱ型R-藻红蛋白。红毛菜纲的9种低等红藻全是Ⅰ型R-藻红蛋白。在真红藻纲的高等红藻中有三种是Ⅰ型R-藻红蛋白,其余18种都是Ⅱ型R-藻红蛋白。根据这两种R-藻红蛋白在红藻中的分布,可以看到从Ⅰ型R-藻红蛋白向Ⅱ型R-藻红蛋白进化的趋势,但这种进化过程是比较复杂的,并不存在一条以真红藻纲的海索面目为截然的分界线。两种光谱类型的R-藻红蛋白在红藻中的出现具有一定的分类学意义。     

坛紫菜藻红蛋白α,β亚基基因的克隆和序列分析

藻胆蛋白(Phycobiliprotein,PBP)是原核藻类和真核藻类进行光合作用的捕光色素蛋白,占藻体干重的2%左右,主要分为3类:藻红蛋白(phycoer-ythrin,PE)、藻蓝蛋白(phycocyanin,PC)和别藻蓝蛋白(allophycocyanin,APC)[1].藻胆蛋白一般由α亚基和β亚基组成,部分藻胆蛋白中还存在γ亚基.一般由α和β亚基形成稳定的单体(αβ),再由单体聚合为多聚体(αβ)_n.从蓝藻和红藻中分离的藻胆蛋白为三聚体(αβ)₃或六聚体(αβ)₆[2].     

利用多功能裂合酶CpcE/F合成非天然重组藻胆蛋白

藻胆蛋白裂合酶是催化藻胆色素与脱辅基藻胆蛋白亚基共价连接的裂合酶,在藻胆蛋白的生物合成途径中发挥着重要作用。本实验以藻蓝蛋白裂合酶Cpc E/F为研究对象,采用基因工程组合表达技术,构建了pCDFDuet-apcA-cpcE/F-hox1-pebS、pCDFDuet-pecA-cpcE/F-hox1-pebS等重组质粒,并导入大肠杆菌中,在IPTG的诱导下,成功表达得到两种非天然藻胆蛋白ApcA-PEB和PecA-PEB,这表明Cpc E/F不仅可以催化藻蓝胆素和脱辅基藻蓝蛋白的结合,还可以催化藻红胆素(PEB)与别藻蓝蛋白α-亚基(ApcA)和藻红蓝蛋白α-亚基(PecA)的结合,因此是一种多功能的裂合酶。根据重组产物的光谱特征峰分析发现,ApcA-PEB和PecA-PEB作为两种非天然存在的重组藻胆蛋白,具有与对应天然藻胆蛋白有着相近的特征吸收光谱和荧光发射峰,但同时具有明显的波长偏移并伴有色素异化现象,其光谱学性质主要由其所携带的色素基团决定。另外,荧光寿命衰减分析发现,不同脱辅基蛋白对于重组藻胆蛋白的光谱稳定性具有重要的影响。     

基于 R-藻红蛋白及硫酸多糖提取的次等紫菜综合利用技术

末水条斑紫菜以组织捣碎机粉碎,在10 mmol/L磷酸盐缓冲液(p H 6.8)中反复冻融3次,收集上清液,通过膨化床疏水层析技术分离R-藻红蛋白(R-PE),剩余残渣用于硫酸多糖提取。使用膨化柱分离,粗提液中约17%的藻红蛋白可以被回收,DEAE-Sepharose离子交换树脂纯化后,约12%的R-藻红蛋白得到回收,光谱纯度大于3.2,纯化得率为0.66 mg/g鲜紫菜。吸收光谱、荧光发射光谱以及凝胶电泳均显示该藻红蛋白属于典型三峰型R-藻红蛋白。利用藻红蛋白提取后的残渣,每克条斑紫菜可回收到30.5 mg的粗多糖,其中硫酸基含量为21.8%。实验证明,微波辅助抽提与热水浸提对硫酸多糖得率无显著影响。纯化的R-藻红蛋白与紫菜硫酸多糖可用于食品、化妆品添加,或药品、保健品的开发。本文对探索次等紫菜生物质的综合、高值化利用,进一步促进我国相关产品的开发与应用具有重要意义。     

藻红蛋白基因部分序列的克隆和顺序分析

报道了真核红藻—龙须菜的藻红蛋白亚基基因的部分序列,位于β亚基的近碳端、α亚基的近氮端,包括β亚基部分３０９个核苷酸,α亚基部分１６２个核苷酸,还有间隔部分５５个核苷酸,可编码β近碳端的１０２个氨基酸和α近氮端的５４个氨基酸,并与目前已知的相应序列做了比较。该序列与已知红藻ＰＥ亚基基因相应部分的相似性为７７．９％到８１．１％。对应的氨基酸序列的相似性为７９．５％到８６．５％,蛋白质序列的保守性高于核苷酸序列。     

龙须菜血红素加氧酶138位亮氨酸突变对藻红胆素合成的影响

藻红胆素是一个开链四吡咯结构的发色团,其与脱辅基藻红蛋白结合使藻红蛋白具有光学活性,而血红素加氧酶基因ho对于藻红胆素的合成是至关重要的。本研究对实验室前期已获得的龙须菜中的血红素加氧酶基因ho-1的基因序列进行分析发现,其在藻类中比较保守,存在6个高度保守结构域;结构功能分析显示其具有15个可能的血红素(Heme)结合位点,其中第138位亮氨酸(L)既位于118～145位HemeO的扭结螺旋结构内,又在115～142位的高度保守的结构域内,而且经预测是可能的血红素(Heme)结合位点之一。为了进一步验证该位点的作用,我们拟对其进行定点突变,将第413位碱基由T突变成C,得到ho(M)基因,碱基突变后所对应编码的第138位氨基酸由亮氨酸(L,非极性氨基酸)突变为丝氨酸(S,极性氨基酸)。在此基础上,我们构建了重组质粒pET-ho-1、pET-ho-1-pebS、pET-ho-1-pebA-pebB及pET-ho(M)、pET-ho(M)-pebS、pET-ho(M)-pebA-pebB,将其转化到E.coli BL21中构建重组菌株E.coli ph、E.coli phS、E.coli phAB、E.coli ph(M)、E.coli ph(M)S和E.coli ph(M)AB进行表达,检测重组菌株的荧光发射光谱。结果表明,E.coli phAB和E.coli phS在595 nm处检测到藻红胆素的荧光特征峰,表明ho-1基因编码的血红素加氧酶可以参与催化藻红胆素的合成;E.coli ph(M)、E.coli ph(M)S和E.coli ph(M)AB与E.coli BL21一样无任何特征峰出现,这表明ho(M)中第413位碱基对应编码的第138位亮氨酸是血红素的结合位点,直接影响藻红胆素的合成,该位点的突变使得PebS和PebB/A两条催化途径均无法合成藻红胆素。本研究为阐明血红素加氧酶基因在合成藻红胆素过程中的重要性及龙须菜中藻红蛋白的合成机制,进而进行藻红蛋白的重组表达奠定了基础。     

条斑紫菜藻红蛋白的制备

藻红蛋白存在于红藻、蓝藻与隐藻中。自Kützing(1843)首先从红藻中提出藻红蛋白以来,通过长期的研究,对这类色蛋白的种类、分布、结构和功能都有了更深入的了解。 红藻和蓝藻的藻红蛋白有三种:C-藻红蛋白,B-藻红蛋白和R-藻红蛋白。此外,在隐藻中另有三种隐藻藻红蛋白。条斑紫菜(Porphyrayezoensis)的藻红蛋白属于R-藻红蛋白。 藻红蛋白是光合作用的集光色素,它能高效率地吸收光能并将激发能传递给叶绿素a。     

钝顶螺旋藻藻蓝蛋白提取纯化新工艺

对钝顶螺旋藻（Spirulina platensis）中藻蓝蛋白的提取和纯化方法进行了改进。用磷酸盐缓冲液循环冻融联合超声波破碎法,50％硫酸铵沉淀获得藻蓝蛋白（phycocyanin,PC）,提取率达到13．1%。粗蛋白提取液再经过两次羟基磷灰石柱（HA）层析和sephacryl-HR-200凝胶层析对其进行纯化,纯度达到4．71％。纯化后的PC在12％十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中得到两条带,分别是α和β两个亚基,分子质量分别为21．4ku和17．0ku。结果表明,通过上述分离纯化过程得到了较高提取率和电泳纯度的藻蓝蛋白。     

紫球藻两种藻红蛋白特性的比较研究——γ亚基在稳定藻红蛋白结构方面的作用

从紫球藻中分离纯化两种藻红蛋白（B－藻红蛋白和b-藻红蛋白），对它们的吸收光谱和电泳图谱进行比较研究。结果表明，尽管电泳图谱与文献报道的相同，但b-藻红蛋白的吸收光谱与文献报道的有较大的差别，表现在本研究发现b-藻红蛋白在545nm处有一吸收峰。在565nm处仅有一个吸收肩峰，而不是文献中报道的在545nm和565nm无前独立的吸收峰。通过比较B－藻红蛋白和b-藻红蛋白在不完全变性条件下的电泳图谱，发现B－藻红蛋白比b-藻红蛋白要稳定的多，进一步分析认为这主要是因为B－藻红蛋白含有γ亚基，而b-藻红蛋白不含有γ亚基，因为此为γ亚基有稳定分子的作用。     

用高碘酸钠氧化法制备多管藻R-藻红蛋白和钝顶螺旋藻C-藻蓝蛋白的共价交联物

从海洋红藻多管藻(Polysiphonia urceolata)和蓝藻钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)中分别纯化了R-藻红蛋白和C-藻蓝蛋白，然后用高碘酸钠氧化法将二共价连接。交联反应液经Sephadex G-200凝胶过滤纯化共价交联物。光谱分析表明，共价交联体内部存在着从R-藻红蛋白到C-藻蓝蛋白的能量传递。     

委内瑞拉产地龙须菜藻红蛋白基因的克隆及其系统学研究

本文报道了红藻 Gracilaria lemaneiformis委内瑞拉株的藻红蛋白基因的部分序列 ,将所得序列与其它红藻 - Rhodella violacea,Polysiphonia boldii,Griffithsia monolis,Porphyra tenera,Porphyra yezoensis及青岛产龙须菜的相应序列对齐后 ,进行了系统学研究。结果显示 ,同一属的藻红蛋白 α和 β亚基之间的间隔序列 ,从长度到核苷酸序列均非常相似 ,而同一科不同属或同一目的科间的该序列有很大的不同 ;两不同产地龙须菜的 PE基因在 β亚基上的转换多于颠换 ,说明 β亚基比 α亚基保守 ;委内瑞拉来源龙须菜与青岛产地龙须菜可能不属于同一物种 ,应为同属不同种关系 ;由藻红蛋白基因所得的系统树包括 3个与建立在形态标准上的遗传位置一致的分支 ;藻红蛋白基因序列可用于种间及更高地位的分子系统研究。     

钝顶螺旋藻藻胆蛋白的纯化及其清除氧自由基的作用

本文对钝顶螺旋藻藻胆蛋白的分离工艺进行了研究,建立经细胞破碎,硫酸铵沉淀蛋白,羟基磷灰石柱分离工尼凝胶电泳,吸收光谱,荧光光谱和量热分析等研究,证明Ｃ－ＰＣ由大小两个亚基组成,分子量分别为１７２００ｕ和１４９００ｕ;ＡＰＣ由一个亚基组成,分子量为１３４００ｕ。     

华北半叶紫菜藻胆体的光谱特性和光能传递的研究

红藻的光合器是由叶绿体和藻胆体组成的。藻胆体由多种藻胆蛋白和在结构上起连接作用的无色蛋白或多肽所组成。藻胆体与类囊体片层紧密结合,在单位类囊体的片层上藻胆体的数目因生物种类不同及其所处环境条件的不同而异;一般为400—1200个/μm~(-2)。 藻胆体的功能是捕获光能和将光能传递给类囊体片层上叶绿素a,以进行光合作用。 红藻藻胆体中藻胆蛋白之间光能传递顺序为:R-藻红蛋白→R-藻蓝蛋白→别藻蓝     

几种重组别藻蓝蛋白的抗氧化活性

藻胆蛋白是某些藻类特有的捕光色素蛋白,其中天然别藻蓝蛋白、藻蓝蛋白的抗氧化活性已经被证明。实验以2,2-盐酸脒基丙烷(AAPH)为自由基生成者,应用藏红花素退色反应为检测清除氢过氧自由基的方法,探讨了在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达并纯化的带有6×His(6×组氨酸)标签和带有麦芽糖结合蛋白(MBP)标签的重组别藻蓝蛋白及其α、β亚基的抗氧化活性。结果表明,带有His标签的6×Hisα-APC、6×Hisβ-APC和6×His-APC均显示出一定的清除氢过氧自由基的能力,其中6×Hisβ-APC清除氢过氧自由基的IC50值可达到27.2 mg/L,Ka/Kc(氢过氧自由基与重组别藻蓝蛋白和藏红花素反应的速度常数比)达到1.24,大于带有色素基团的天然APC清除氢过氧自由基能力(IC5057.5 mg/L);而带有MBP标签的重组别藻蓝蛋白亚基MBPα-APC和MBPβ-APC和MBP-APC(rAPC)则无明显的清除能力。结果首次证实了脱辅基蛋白具有清除氢过氧自由基能力,因而在天然藻胆蛋白中脱辅基蛋白是清除自由基的贡献者之一,这为进一步研究重组别藻蓝蛋白的抗肿瘤机理提供了线索。     

带形蜈蚣藻多糖和可溶性蛋白含量测定及藻红蛋白分析鉴定

用沸水浴的方法提取了带形蜈蚣藻(Grateloupia turuturuYamada)中的多糖成分,并用“苯酚-硫酸法”测定了其含量。用此法得到的多糖标准曲线,相关系数r=0.998 4,结果显示带形蜈蚣藻多糖质量分数为44.91%;利用Bradford法,测得60℃恒温干燥的带形蜈蚣藻可溶性总蛋白质量分数为0.33%;用简单的羟基磷灰石柱层析的方法分离了藻红蛋白,光谱检测证明为R-藻红蛋白,其在带形蜈蚣藻中的质量分数为0.114 5%。本实验测定方法可靠且简便易行。     

串珠藻目植物rbcL基因的适应性进化分析

淡水红藻是藻类植物进化中的一个重要类群,其中最主要的类群是串珠藻目。核酮糖1,5二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)是一种既负责碳同化又引发光呼吸,在植物光合作用中起重要作用的酶,其催化固定CO_2的活性中心位于Rubisco大亚基,由叶绿体rbcL基因编码。为了探究串珠藻目植物适应特殊生存环境的分子水平机制,本文选取了串珠藻目及一些相近类群淡水红藻的rbcL基因39条,利用PAML4.8软件,运行位点模型、分支模型及分支-位点模型,对选取类群的rbcL基因进行了适应性进化分析。结果表明:(1)通过最大似然法构建的系统发育树显示,所有内类群聚集为6个分支,其中,分支A为暗紫红毛菜,分支B为胶串珠藻,分支C为扁圆串珠藻,后验概率同样为100%,分支D为熊野藻属,分支E为连珠藻属,分支F为弧形西斯藻;(2)分支-位点模型中,在3个分支中分别鉴定出350S、277L和280L为正选择位点;(3)在构建出的Rubisco大亚基的参考三维模型中,277L和280L位于Rubisco大亚基羧基末端保守的8个α螺旋和8个β片层构成的α/β桶状结构域中第7个α螺旋和第7个β片层之间的loop结构上,350S位于羧基末端邻近α/β桶状结构域的一个α螺旋上。研究结果一方面显示了基于ω比值检验基因适应性进化的准确性和有效性,另一方面也揭示了串珠藻目植物rbcL基因确实发生了适应性进化,对串珠藻目适应特殊生存环境产生了有益的作用。     

中国产紫菜属藻胆蛋白的研究

本研究以羟基磷灰石(Hydroxyla patite)为吸附剂的柱层析法分离和纯化了中国产紫菜属(Porphyra)6种紫菜——条斑紫菜(P.yezoensis)、少精紫菜(P.oligospermatangia)、华北半叶紫菜(P.katadai var.hemiphylla)、甘紫菜(P.tenera)、坛紫菜(P.haitanensis)和边紫菜(P.marginata)——中的藻胆蛋白。吸收光谱测定的结果显示,R-藻红蛋白(R-phycoerythrin)和变藻蓝蛋白(Allophycocyanin)存在于所研究的6种紫菜中,而C-藻蓝蛋白(C-phycocyanin)只出现于甘紫菜、条斑紫菜、少精紫菜和华北半叶紫菜中,而R-藻蓝蛋白(R-phycocyanin)则只出现于坛紫菜和边紫菜中。     

光学活性藻蓝蛋白β亚基的体内重组

在Synechococcus sp.PCC 7002中,首先发现了特异性催化脱辅基藻蓝蛋白β亚基(153位)与藻蓝胆素(phycocyanobiling, PCB)连接的裂合酶基因cpcT.本实验在Synechocystis sp.PCC 6803中找到与cpcT具有高度同源性的基因slr1649.构建2组相容的重组质粒pCDF-cpcB(C82I)或(C153I)-ho1-pcyA和pRSF-slr1649,cpcB(C82I)和cpcB(C153I)分别编码82和153位被突变的脱辅基藻蓝蛋白β亚基,slr1649编码可能的特异性裂合酶,在大肠杆菌体内生成PCB必需的2个基因(ho1编码血红素氧化酶,pcyA编码藻蓝胆素合成酶),将这些基因共同转化到大肠杆菌诱导表达,利用亲和层析柱对可溶性蛋白进行纯化,产物进行SDS-PAGE、色素蛋白锌电泳和光谱检测.结果表明基因slr1649能够特异性催化CpcB(153位)与PCB的连接,产生了具有光学活性的CpcB(C82I)-PCB,为进一步研究螺旋藻藻蓝蛋白的生物活性奠定了基础.