海洋生境刀鲚菌群PCR-DGGE指纹图谱构建及分析

为了分析海洋生境刀鲚(Coilia nasus)体内及生长环境菌群结构,作者采用免培养16S r DNA的PCR-DGGE指纹图谱技术,对刀鲚鳃、肠道壁、肠道内容物及水体环境中的菌群结构进行了对比分析。结果表明:变性梯度为35%~55%、浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶,150V 60℃下电泳10 h,DGGE带谱的分离效果较好;刀鲚鳃、肠道壁、肠道内容物及水体样品指纹图谱上分别显示出24、19、14和29条信号强度不同的条带;相同样品重复组细菌结构相似度在80%以上,差异不显著;不同样品之间,刀鲚鳃与海水聚为一支,具有较高的相似度为52%,肠壁与肠内容物相似度为41%。样品菌群主要以未培养菌为主,主要包括变形菌、放线菌和厚壁菌。本文首次成功构建海洋生境刀鲚菌群16S r DNA的PCR-DGGE指纹图谱。     

海水养殖蟹体内与外部环境中菌群结构的PCR-DGGE比较——以三疣梭子蟹和锯缘青蟹为例

利用PCR-DGGE指纹图谱技术和UPMGA聚类分析,对三疣梭子蟹Portunus trituberculatus、锯缘青蟹Scylla serrata的鳃组织及养殖环境中的菌群结构进行了对比分析。结果表明:三疣梭子蟹、锯缘青蟹鳃组织及养殖环境水样在指纹图谱上分别显示出21,21,23和21条信号强度不同的条带,条带的数量反映出三疣梭子蟹养殖环境中的菌群最为丰富,条带信号的强度,反映出不同样品中存在各自的优势菌种;可将4个样品中的菌群划分为2个群落,其中三疣梭子蟹和锯缘青蟹鳃组织中的菌群聚为一类,其相似度为75%,2种蟹养殖环境中的菌群聚为一类,相似度为69%。首次尝试利用16S rDNA的PCR-DGGE指纹图谱技术分析了2种健康蟹体内和各自养殖环境中微生物结构的差异性,从而寻找蟹体内的益生菌,将有助于建立一种不依赖于分离培养的原位研究蟹体内菌群组成的分子诊断技术,为今后研究锯缘青蟹、三疣梭子蟹与养殖水体微生物及相关蟹病害的关系提供基础科学依据。     

AFLP技术在笛鲷的仔鱼鉴定及其分类学上的研究

以南沙群岛采获的勒氏笛鲷(Lutjanus russelli)、黄笛鲷(Lutjanus lutjanus)、红笛鲷(Lut janus sanguineus)、紫红笛鲷(Lutjanus argentimaculatus)、金焰笛鲷(Lutjanus fulviflamma)、线纹笛鲷(Lutjanus lineolatus)、画眉笛鲷(Lutjanus vitta)、马拉巴笛鲷(Lutjanus malabarius)、驼背笛鲷(Lutjanus gibbus)、约氏笛鲷(Lutjanus johni)、金带笛鲷(Lutjanus vaigiensis)11种笛鲷属的后期仔鱼为材料, 进行了基因组DNA的AFLP(扩增片段长度多态性)研究,通过笛鲷仔鱼和成鱼的AFLP电泳图谱的比较分析,将这11种笛鲷属的仔鱼成功分开.研究表明,最适合的AFLP引物组合是E+AGC/M+CAA,由这11种笛鲷共扩增出132 AFLP位点,每种笛鲷的AFLP条带数为43~69,在这11种笛鲷中,共享的AFLP条带数仅为7,同一种笛鲷仔鱼和成鱼AFLP遗传相似度在90%以上.根据这11种笛鲷的Nei遗传距离对Neighboring系统进行进化分析,并且与传统的笛鲷形态分类进行了比较.分子生物学可以阐释笛鲷属鱼类的系统进化和遗传亲缘关系,对传统形态分类学加以完善和补充.     

烟台市区河流入海口微生物群落的分析

2015年4月在烟台市区4条主要河流(辛安河、逛荡河、鱼鸟河和夹河)入海口处采集12个样品,利用PCR-DGGE方法分析了此区域的细菌群落组成和优势菌群。通过统计学手段对DGGE图谱进行分析,结果表明4条河流入海口细菌群落丰富度都较高,12个取样点扩增的DGGE条带数都在30以上,样品的Shannon指数均高于3.3,个别甚至可达3.61。其中,辛安河和逛荡河的Shannon指数平均值均高于鱼鸟河和夹河,夹河多样性最低;而且UPGMA聚类分析结果显示地理位置越接近,其细菌组成的相似度越高。在DGGE电泳条带中选取14条主要条带进行扩增和序列测定,所得到的序列进行了系统进化分析发现4条河流入海口的优势菌群主要为变形杆菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)。这与近年来关于山东近岸海域细菌多样性的研究结果相符合,为研究和保护烟台市区河口处环境提供科学依据。     

南沙深海沉积物中石油降解菌的分离鉴定和多样性分析

为了解我国南沙海域中石油降解菌的多样性,认识其在环境自净中作用并获得用于石油污染生物修复的菌种资源,以不同链长烷烃及支链烷烃对南沙深海沉积物样品进行富集与烃降解菌的分离鉴定,并结合16S rRNA基因文库和DGGE技术对降解菌群的结构进行了分析.结果表明：通过16S rRNA基因文库构建及PCR-DGGE分析发现,不同链长烷烃富集后的菌群中,食烷菌（Alcanivorax）在各降解菌群中都是绝对优势菌;另外,除烃海杆菌（Marinobacter hydrocarbonoclasticus）、海绵假单胞菌（Pseudomonas pachastrellae）,以及Idiomarina与Kangiella属的细菌也是菌群中较重要的优势菌.此外,通过2种平板培养基从烷烃富集的降解菌群中分离获得了8个不同属的细菌.本研究还首次发现Kangiella属（食烷菌科）的细菌可能参与了烷烃降解.南沙沉积物烷烃降解菌多为γ-Proteobacteria;其中,食烷菌科（Alcanivoraceae）（Alcanivorax与Kangiella属）的细菌在降解菌群中是绝对优势菌,假单胞菌与海杆菌在烷烃降解过程中也起着重要作用.     

孟加拉笛鲷与四带笛鲷的微卫星分析

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,从西大西洋笛鲷（Lutjanuscampechanus）和勒氏笛鲷（L．russel—lii）的微卫星引物中筛选出适用于孟加拉笛鲷（L．bengalensis）和四带笛鲷（三．kasmira）的微卫星引物,并应用于三亚和湛江群体的遗传结构分析．结果表明：25对引物中筛选出13对可以稳定扩增出特异片段的引物,其中12对可在孟加拉笛鲷基因组中扩增出重复性好的特异性条带;10对可在四带笛鲷中扩增出重复性好的特异性条带,并且全部呈现出种内多态;9对为两个种通用．孟加拉笛鲷的湛江群体（zMJ）和三亚群体（SMJ）、四带笛鲷的湛江群体（ZSD）和三亚群体（SSD）的平均等位基因数分别为：3．8889、4．1111、4．3333、4．2222;平均观测杂合度分别为：0．5833、0．6389、0．5944、0．6389;平均多态信息含量分别为：0．4720、0．4692、0．5474、0．5257．将本实验所得结果与笛鲷鱼其他研究结果进行比较分析,可以看出目前湛江海域野生笛鲷的遗传多样性整体比较丰富,但部分野生笛鲷已表现出杂合子缺失的趋势,这势必会引起将来遗传多样性的降低,所以要尽旱对野生群体进行摸底调查。并找出解决养殖群体污染野生群体这一问题的方法．     

潮间带污泥中厌氧发酵产氢混合菌群组成与 Fe-氢酶基因多样性分析

以采自天津海水浴场潮间带的污泥为研究材料,将污泥热休克处理后富集混合菌群进行厌氧发酵产氢,测定混合菌群在发酵过程中累积产氢量和相关产氢指标(吸光度、酸碱度和氧化还原电位)的变化。结果表明,热休克处理后富集的产氢混合菌群产氢量为0.41mol H2/mol葡萄糖。产氢结束后,利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析混合菌群组成和Fe-氢酶基因的多样性。混合菌群基因组DNA的16S rRNAV3区扩增产物经过DGGE电泳分离,结果得到6条丰度比较高的条带,测序结果表明优势菌为Clostridium sp.。利用梭菌氢酶基因保守性引物克隆混合产氢菌群中梭菌Fe-氢酶基因,扩增产物经DGGE电泳分离,电泳结果表明混合菌群中Fe-氢酶基因分为3个分类单元,NCBI-BLAST比对结果与Clostridium roseum和Clostridium perfringens的Fe-氢酶基因相似度分别为79%和98%。分析产氢混合菌群组成和Fe-氢酶基因多样性,可以为扩大产氢微生物种质资源奠定基础。     

牛山湖浮游生物群落DNA指纹结构与物种组成的关系

利用RAPD及DGGE指纹技术揭示牛山湖5个采样点浮游生物群落的DNA多态性,并定性地探讨其与物种组成的关系.结果如下:(1)从40条随机引物中筛选出9条引物,共获得93条谱带,多态率为58%;各采样点所得谱带平均为67条,其中Ⅰ站最少,为61条,Ⅴ站最多,为74条;(2)PCR-DGGE指纹图谱共含102条谱带,其中原核生物56条,真核生物46条,谱带总数以Ⅲ站、Ⅳ站和Ⅴ站较多.Ⅰ站和Ⅱ站较少;(3)5个采样点共观察到62种/类浮游生物,其中Ⅰ站和Ⅱ站种类较少.Ⅲ站、Ⅳ站和Ⅴ站种类较多,分布概率在100%的种类达19种.多维尺度(MDS)分析表明:基于RAPD指纹和DGGE指纹,Ⅰ站和Ⅱ站最相似,Ⅲ站、Ⅳ站和Ⅴ站最相似;基于物种组成.Ⅳ站和Ⅴ站相似性最高,Ⅲ站和Ⅳ站次之,相对RAPD指纹和DGGE指纹,Ⅰ站和Ⅱ站相似性较低.研究表明:浮游生物群落DNA指纹结构与物种组成有一定的相关性,可能因部分物种信息的缺失导致些许偏差.     

黄海西北近岸沉积物中细菌群落空间分布特征

采用16S rDNA文库和变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术,对黄海西北部3个近岸站位沉积物中细菌群落多样性及空间分布特征进行了调查和解析。对表层沉积物16S rDNA序列统计表明,各站位细菌群落多样性很高,γ-和δ-变形菌纲分别占克隆序列总数的20%~32%,是沉积物中的绝对优势类群。DGGE图谱分析表明,同一站位中不同深度的细菌群落结构相似性较高,而不同站位间群落结构相差较远。研究表明在黄海西北近岸沉积物中细菌群落多样性较高,优势类群明显,在较小尺度范围内群落结构的垂直变化不明显。     

湘产山银花水提物、醇提物特征图谱对比及其经典名方量值传递研究

目的：建立山银花水提物和醇提物的指纹图谱,对比二者之间的成分及含量差异;建立经典名方五味消毒饮中以山银花入药的特征图谱,并评价其饮片到提取物的量值传递。方法：采用高效液相色谱法,色谱柱为Agilent ZORBAX SB C18、Waters Xselect HSS T3;流动相为乙腈-0.1%/0.2%磷酸水溶液,梯度洗脱;检测波长327 nm;柱温25℃、30℃;体积流量1.0 ml/min。采用相似度、相对峰面积等数据及对照指纹图谱对比方式对其结果进行综合分析。结果：山银花水提物共9个共有峰,相似度均<0.9,且差异较大;山银花醇提物共10个共有峰,相似度均>0.89;五味消毒饮特征图谱共13个共有峰,以同法检测山银花单味饮片提取物共7个特征峰。结论：本研究建立了山银花水提物及醇提物成分的指纹图谱,二者有细微差异;以山银花入药的五味消毒饮,所有特征峰均传递至五味消毒饮提取物中,其作为五味消毒饮的君药具有科学依据。     

6种笛鲷属鱼类Cyt b基因片段序列的比较

采用聚合酶链式反应直接测序法，获得紫红笛鲷(Lutjanus argentimaculatus)、白星笛鲷(L．stellatus)、千年笛鲷(L．sebae)、勒氏笛鲷(L．russelli)、红鳍笛鲷(L．erythropterus)5种笛鲷属鱼的线粒体细胞色素b(Cyt b)425bp序列，并结合基因库中的斜带笛鲷(L．decussatus)Cytb同源序列进行比较分析，共发现88个核苷酸位点存在变异(20．7％)。用MEGA2．1软件中的Pairwise distance工具计算了6种笛鲷属鱼类的相对遗传距离，表明6种笛鲷属鱼类的序列差异在0．096-0．129之间，其中红鳍笛鲷和紫红笛鲷序列差异最大为0．129，千年笛鲷与红鳍笛鲷的序列差异最小为0．096；序列变异的转换／颠换比值较低，平均只有2．160。     

川纹笛鲷染色体核型、银染和C-带

实验采用植物血凝素、秋水仙碱腹腔注射,肾细胞直接制片法分析了川纹笛鲷Lutjanus sebae染色体核型、Ag-NORs和C-带.结果表明:1)川纹笛鲷二倍体染色体数2n=48,核型公式为:2n=48t,NF=48;在第1对染色体靠近着丝粒部位有明显的次缢痕.2)染色体经快速银染后,Ag-NORs的数目在不同细胞中表现出多态性,数目1-4个,2个Ag-NORs的频率最高(占79%).在分裂相中,第1对t染色体近着丝粒的次缢痕区均出现2个银染位点(Ag-NORs阳性),且未见Ag-NORs的联合现象.3)大多数染色体的着丝粒区显示出1个深浅不同的C-带,在第1对染色体的随体区域分布有大量的结构异染色质,表现C-带强阳性.讨论了鱼类核型演化规律和Ag-NORs,C-带的发生机制,以及川纹笛鲷的进化地位.     

RAPD对红鳍笛鲷(♀)×千年笛鲷(♂)子一代杂种优势预测的分析

应用RAPD技术对红鳍笛鲷(♀)、千年笛鲷(♂)和红鳍笛鲷(♀)×千年笛鲷(♂)子一代3个群体的RAPD扩增带谱进行了分析,并对杂交子代F₁杂种优势进行了预测。从100个随机引物中筛选出35个扩增带丰富的引物进行扩增,共得到190条清晰稳定的扩增带,其中有176个扩增位点具有多态性,多态性位点比率为92.6%。红鳍笛鲷、F₁、千年笛鲷3个群体的遗传相似性指数分别为0.831 9,0.726 3,0.916 8;Nei多样性指数分别为0.174 5,0.264 0,0.118 4;Shannon信息指数分别为0.256 4,0.384 5,0.171 2。红鳍笛鲷(♀)-F₁,F₁-千年笛鲷(♂),红鳍笛鲷(♀)-千年笛鲷(♂)的遗传距离分别为0.397 2,0.317 0,0.854 1。从相似性指数、Nei多样性指数和Shannon信息指数均显示F₁代有杂种优势,并找到了种间特异性标记。     

饥饿和再投喂对千年笛鲷幼鱼消化酶活性的影响

研究了饥饿和再投喂对千年笛鲷(Lutjanus sebae)幼鱼消化酶活性的影响.实验设计分成6组,分别饥饿处理0(对照),2,4,6,9和11 d,然后在饱食的条件下恢复投喂10 d.分别测定饥饿和恢复投喂过程中千年笛鲷幼鱼蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶3种消化酶的活性.结果表明,在饥饿过程中,蛋白酶和脂肪酶活性下降明显,淀粉酶起伏较大;恢复投喂后,蛋白酶和脂肪酶活力与饥饿前相比都有所上升,但蛋白酶活力总体上仍低于同步取样对照组,脂肪酶活力总体上高于对照组水平,淀粉酶活力恢复到对照组水平,并且基本上没有变化.     

中国文昌红树林-海草床-珊瑚礁连续生境的鱼类连通性

Understanding the connectivity of fish among different typical habitats is important for conducting ecosystembased management, particularly when designing marine protected areas(MPA) or setting MPA networks. To clarify of connectivity among mangrove, seagrass beds, and coral reef habitats in Wenchang, Hainan Province,China, the fish community structure was studied in wet and dry seasons of 2018. Gill nets were placed across the three habitat types, and the number of species, individuals, and body size of individual fish were recorded. In total, 3 815 individuals belonging to 154 species of 57 families were collected. The highest number of individuals and species was documented in mangroves(117 species, 2 623 individuals), followed by coral reefs(61 species,438 individuals) and seagrass beds(46 species, 754 individuals). The similarity tests revealed highly significant differences among the three habitats. Approximately 23.4% species used two habitats and 11.0% species used three habitats. A significant difference(p0.05) in habitat use among eight species(Mugil cephalus, Gerres oblongus, Siganus fuscescens, Terapon jarbua, Sillago maculata, Upeneus tragula, Lutjanus russellii, and Monacanthus chinensis) was detected, with a clear ontogenetic shift in habitat use from mangrove or seagrass beds to coral reefs. The similarity indices suggested that fish assemblages can be divided into three large groups namely coral, seagrass, and mangrove habitat types. This study demonstrated that connectivity exists between mangrove–seagrass–coral reef continuum in Wenchang area; therefore, we recommend that fish connectivity should be considered when designing MPAs or MPA network where possible.     

笛鲷属三种鱼类染色体组型的研究

通过胸腔注射PHA及秋水仙素,取头肾细胞,经空气干燥法制片,Giemsa染液染色,观察了笛鲷属的约氏笛鲷（Lutjanus johni）、勒氏笛鲷（L.russelli bleeker）、画眉笛鲷（LLutjanus vitta）的染色体核型进行分析研究,结果表明：染色体数目2n=48,染色体总臂数（NF）为48,核型公式为48t.     

笛鲷属(Lutjanus)鱼类线粒体16S rRNA基因序列比较及系统学分析

对笛鲷属9种鱼的线粒体DNA16S rRNA基因片段进行了PCR扩增,扩增产物经纯化后测序,得到了长度为561bp的分析序列。结合GenBank中的另外9种笛鲷的16S rRNA同源序列计算得出A、T、G、C的含量平均为28.5%、22.1%、23.6%和25.8%,AT含量稍高于GC含量,18种笛鲷碱基组成差异不大。利用MEGA3.1软件对所得序列进行比对后检测到72个变异位点,其中包括简约信息位点44个,在变异位点中75.61%的碱基替换是由于发生了转换,转换/颠换平均为3.1︰1。计算了种间的遗传距离,结果表明,序列差异在0.0193-0.0680之间,其中勒氏笛鲷和金焰笛鲷、勒氏笛鲷和金带笛鲷的序列差异最小,而红鳍笛鲷和金焰笛鲷、红鳍笛鲷和画眉笛鲷的序列差异最大。选用高体四长棘鲷(Argyrops spinifer)为外群,利用NJ法构建了分子系统树,结果表明:本研究中的9种南海笛鲷与其它9种笛鲷进化关系较远;并且南海9种笛鲷相互之间仍然保持着着相对较远的遗传距离,遗传多样性较好。     

红鳍笛鲷、紫红笛鲷和白斑笛鲷的核型研究

以红鳍笛鲷（Lutjanus erythopterus)、紫红笛鲷(Lutjanus argentimaculatus)、白斑笛鲷（Lutjanus bohar)为材料，胸腔注射PHA及秋水仙素溶液，取头肾细胞经空气干燥法制片，姬姆萨染液染色，观察分析获得染色体核型：染色体数目2N＝48，染色总臂数为48。