基于四种水产病原弧菌的简型芯片检测体系的优化

基因芯片技术在病原菌检测领域展现出良好的前景,本文依托水产病原菌基因检测芯片的检测体系,以水产常见病原弧菌的hsp60、toxR基因检测探针为研究对象,系统研究不同点样液配方、寡核苷酸探针浓度、荧光标记物质浓度、杂交温度、杂交时长对芯片杂交效果的影响,并进行相应优化。结果表明,杂交温度为60℃、杂交时长为2h、探针浓度为1μmol/L、Cy3标记的随机引物的用量为150pmol时,芯片的经济性、灵敏度、检测效率达到均衡;以0.1mol/L磷酸氢二钠和25%二甲基亚砜混合溶液作为点样液,效果较好。优化后的芯片对4种弧菌的检测没有出现交叉杂交现象,探针特异性达到100%;对溶藻弧菌全基因组DNA检测灵敏度为10fg,高出PCR方法约2个数量级。     

山楂提取物生物合成纳米银对四种常见水产病原菌的抑制作用

近年来,"绿色"生物合成纳米抑菌材料以其方法简单、价格低廉、环境友好的优势已成为纳米技术领域中的一项激动人心的发展策略。为了研究生物合成纳米银(Silver nanoparticles,Ag NPs)对水产病原菌的抑菌效果,本研究分别以山楂果实超纯水提取物和山楂乙醇提取物作为还原剂和稳定剂,采用生物合成法制备出两种纳米银抑菌材料W-Ag NPs和E-Ag NPs。通过紫外-可见吸收光谱(UV-vis)、透射电镜(TEM)和X射线衍射(XRD)等方法对合成产物的光学特性、形貌特征以及晶体结构等指标进行了比较,并采用琼脂扩散法初步检测了W-Ag NPs和E-Ag NPs对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌两种典型病原菌的抑菌活性。研究结果显示,W-Ag NPs的合成效果较为理想,它的粒径较小、更加均一,并且具有较高的抑菌活性。在此基础上,我们进一步检测了W-Ag NPs对鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌及点状气单胞菌等4种典型的水产病原菌的抑菌圈,并测定了其抑菌动力学曲线、最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。研究结果表明,W-Ag NPs对四种供试水产病原菌均有显著的抑菌效果,10μg/m L和20μg/m L的W-Ag NPs均对鳗弧菌的生长产生明显的抑制作用,对鳗弧菌的MIC和MBC分别为6.5μg/m L和12.9μg/m L。研究表明山楂提取物制备的纳米银抑菌剂对水产病原菌有显著的抑制和杀灭效果,在水产养殖领域中有着广阔的开发和利用前景。     

水产养殖病原微生物检测技术研究进展

随着我国海水、淡水养殖集约化程度的提高 ,水产养殖中疾病的危害出现了日益严重的趋势。为了对各种暴发病、流行病进行深入研究和监控 ,将现代生物技术应用于各种病原诊断和防治 ,建立灵敏、准确、快速的病原检测技术已迫在眉睫。本文简要对目前的水产养殖病原微生物检测技术进行介绍。１免疫学检测技术免疫学检测技术利用抗原抗体间能发生特异性免疫反应的原理来检测病原 ,是运用较为广泛、成熟的检测技术。在抗原抗体反应当中 ,应用的抗体有多抗 (抗血清 )及单抗。抗血清制备相对简便易行 ,然而易发生血清交叉反应 ,需利用吸附法除去产生…     

姜提取物生物合成纳米银及其对水产病原菌抑菌性的研究

With the development of aquaculture, there is an urgent demand for an alternative antibacterial agent to reduce the drug resistance and environmental pollution caused by the abuse of antibiotics. Recently, silver nanoparticles(Ag NPs) have been viewed as a novel type of antimicrobial agents due to their unique advantages. In this study,Ag NPs were biosynthesized with the ginger rhizomes extract. The biosynthesized Ag NPs were characterised by UV–visible spectroscopy, transmission electron microscopy, X-ray diffraction and fourier transform infrared spectroscopy. Furthermore, the antimicrobial activities of the Ag NPs were fully analyzed against six typical aquatic pathogens. The results indicated that the components in ginger extract could function as the chemical reductant to synthesize Ag NPs. Moreover, compared with the Ag NPs synthesized by chemical methods, the biosynthesized Ag NPs were smaller, and had higher stability and antibacterial activity. Therefore, the biosynthesized Ag NPs using ginger extract may have prospective applications in aquaculture.     

大黄鱼病原菌──溶藻弧菌的ELISA快速检测研究

以灭活溶藻弧菌（0.05%甲醛，30℃,8h）制成菌苗，注射免疫实验兔获得抗血清。该抗血清经吸附后与副溶血弧菌、河流弧菌等10株对照菌株无交叉反应，用该抗血清进行溶藻水中溶藻弧菌浓度均低于最低检测限、外观健康大黄鱼肝脏中溶藻弧菌的阳性检出率为20%、患病大黄鱼的阳性检出率为80%，表明ELISA法不仅可以用于诊断大黄鱼的溶藻弧菌病，也可能检测无病症带菌大黄鱼。     

两种海藻提取物抗水产动物病原菌活性的初步研究

研究了两种大型海藻——羊栖菜(Sargassum fusiforme)、条浒苔(Enteromorpha clathrata)提取物对11种水产动物病原菌的抑制活性。结果显示:羊栖菜乙醇粗提物乙酸乙酯相对溶藻弧菌(Vibrio algi-nolyticus)的抑制作用最明显,抑菌圈可达21.6 mm;薄层层析表明羊栖菜乙醇粗提取物乙酸乙酯相有6条层析带,其中Rf=0.54带对哈氏弧菌(Vibrio harveyi)的抑制作用最强,抑菌圈可达13.6 mm;条浒苔乙醚粗脂对11种水产动物病原菌均表现出了较强的抑制作用,其中对灿烂弧菌(Vibrio splendidus)的抑制作用最强,抑菌圈可达24.7 mm;进一步的实验显示,条浒苔乙醚粗脂3种洗脱组分抗菌性均比粗脂减弱了,而其95%乙醇洗脱组分对恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的抑菌圈仍可达13.8 mm。说明利用羊栖菜、条浒苔为开发海洋药物资源提供了可能。     

采用UPPCR-SSCP技术快速鉴定水产养殖病原性弧菌的研究

采用通用引物PCR配合SSCP分析即UPPCR－SSCP技术,对弧菌科弧菌属中的副溶血弧菌、溶藻酸弧菌、费尼斯弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌的16S－RNA基因进行检测。结果发现,UPPCR－SSCP技术能较好地鉴别细菌的不同种,但对同种不同株细菌的区分较困难。认为PCR－SSCP是将病原菌至种的有力工具。上研究对水产养殖病原菌的快速诊断与及时防治有重要意义。     

近海水域病原菌多样性研究进展

水产动物病原菌广泛分布于近海,不但影响海水养殖业的发展、海产品的质量安全,甚至还威胁到人类公众健康,因此,开展近海水域病原菌多样性的研究,对于海水养殖业的可持续发展及人类健康都具有重要意义。文章综述了近海水域水产动物病原菌多样性研究主要方法的原理、特点以及局限性,介绍了16S rRNA序列分析、分子杂交、指纹图谱等分子生物学技术,阐述了实时荧光定量PCR、竞争定量PCR等定量研究技术的应用,展望了病原菌多样性研究的发展趋势是原位、快速、高通量、灵敏、多技术联合和准确定量。     

分子生物学技术在水产养殖动物病原快速检测中的应用

在动植物病原体的检测中,方法学历经了生物培养、显微镜观察、生化检测、免疫学到分子生物学几个阶段的变更,朝着更特异、更快速、更便捷、更安全、集成化、微量化、定量化、费用低廉化的方向发展。传统病原检测主要依据致病病原体在介质或细胞中的培养、分析病原体表型或血清型特征,或采用组织学检测病原体对宿主器官的影响[1]。这类方法耗时、特异性和灵敏度低,远远不能满足日常快速检测工作的需要。免疫学方法可以在一定程度上缩短检验时间,就灵敏度而言,酶联免疫吸附试验(ELISA)要高于免疫荧光、反向免疫凝胶电泳和免疫扩散,是最常用的免疫学检测病原体方法[2]。     

14 种红树植物对动物病原菌的抑菌活性

采用带药培养基涂布法测定了14种红树植物甲醇提取物及从中分离获得的2种纯化合物对大肠杆菌(Escherichia coli)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)和蜡样芽胞杆菌(Bacillus cer-eus)9种动物病原菌的抑菌活性。结果表明,苦郎树(Clerodendrum inerme)、海漆(Excoecaria agallocha)、白骨壤(Avicennia marina)、苦槛蓝(Myoporum bontioides)、银叶树(Heritiera littoralis)和榄李(Lumnitzeraracemosa)有比较广谱的抗菌活性。苦槛蓝和海漆的抑菌活性较高,最低抑制浓度(Minimum inhibitoryconcentration,MIC)值分别为1～4 g/L和2～6 g/L。从苦郎树中分离获得的纯化合物KLS-46对伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、溶壁微球菌和蜡样芽胞杆菌的MIC值分别为0.1、0.05、0.1和0.05 g/L,对其余5种病原菌的MIC值均大于0.4 g/L。从病原菌对红树植物的敏感性看,藤黄微球菌和蜡样芽胞杆菌对红树植物比较敏感。     

以哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)为重点的鱼类细菌病原的诊断与控制(英文)

作者对鱼类细菌病原的诊断与控制作了较全面的综述。细菌病原诊断技术包括酶联免疫吸附技术（ＥＬＩＳＡ）及蛋白印迹法（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ）。细菌病原控制技术包括化学疗剂的应用,有益微生物的应用,营养添加剂,β－葡萄糖苷增强免疫抗病力,及免疫保护作用等。     

6种鱼类病原菌的免疫反应分析及其检测免疫芯片的构建

采用ELISA、Western-blot及Dot-blot方法,分析海豚链球菌(Streptococcus iniae)、鳗弧菌(Vibrioanguillarum)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、荧光假单胞菌(Psedo-monas fluorescens)及海分支杆菌(Mycobacterium marinum)6种养殖鱼类病原菌与其兔抗血清之间的免疫反应。结果显示,ELISA、Western-blot和Dot-blot 3种方法的分析结果具有一致性,各菌株抗血清与相应的抗原菌株间的反应最为强烈,各菌株与其他细菌兔抗血清间有程度不等的交叉反应。基于以上结果,采用6种病原菌的兔抗血清作为捕获抗体构建了其免疫芯片,确定了检测结果的判读方法,并对其进行验证性应用,结果显示,该芯片可以用于病原菌的准确检测,对分别注射感染不同病原菌的牙鲆(Paralichthys olivaceus)进行取样检测的结果也验证了这一结论。     

水产养殖病害及其药物控制与水产品安全

针对目前我国水产养殖过程中对发生的病害多采用药物控制极易造成因药物使用不当或盲目用药等原因，使细菌产生耐药性、水产品中出现药物残留、养殖环境不断恶化的同时，最终会影响食品安全的现状。从常见病毒病、细菌病，以及寄生虫病等论述开展对药物残留毒性研究，重视专用渔药研制、加强用药指导，减少用药盲目性等工作的重要性。     

发光细菌法检测水产品中氯霉素体系的建立

从青岛近海分离的多株发光细菌中筛选出1株对氯霉素敏感的鳆发光杆菌Photobacterium leiognathi YL,接种单菌落快速培养,制备出适宜检测的菌悬液,添加不同浓度的氯霉素溶液,研究氯霉素浓度与细菌发光强度抑制率之间的关系.通过控制菌体起始发光强度、菌液与氯霉素作用时间,建立发光细菌检测水产品中氯霉素体系.结果表明,当菌体的起始发光强度控制在(2.0～4.0)×105、菌液与氯霉素的最佳作用时间为30 min时,氯霉素浓度与细菌发光强度抑制率呈良好的线性关系.该方法的线性范围为0.1～1.0 ng/mL,相关系数R2为0.989,该体系对氯霉素的检测灵敏度可以达到0.1 ng/mL,可以作为水产品中痕量氯霉素残留的1种快速、灵敏的检测方法.在水产品的氯霉素加标回收试验中,鱼肉中添加浓度为0.1～1.0 ng/g时,回收率在40.34%～114.26%之间.     

锦鲤疱疹病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

研究建立并完善了Taqman实时荧光定量PCR检测锦鲤疱疹病毒（KHV）的方法。首先通过选取KHV病毒TK基因的保守序列（GenBank AB182940）,利用PRIMER EXPRESS 2.0设计引物和探针。其中Taqman探针的5’端标记FAM,3’端标记TAMRA。然后利用梯度稀释的阳性样品克隆质粒进行定量PCR反应,制作标准曲线,得到病毒拷贝数与Ct值的关系为：Ct=-3.45 lgX＋42.73（相关系数R2=0.989）。通过试验检测得到实时荧光定量PCR对KHV的灵敏度为32个病毒核酸拷贝数,同时,设计的引物和探针对于鱼类细胞系和其它鱼类病毒没有扩增反应,表现出较好的特异性。实验结果表明,实时荧光定量PCR检测KHV的方法,具有特异性好、灵敏度高的特点,可以缩短检测时间,提高检测速度,非常适合口岸进出口检验检疫的要求。     

一种基于16S rRNA基因检测海洋浮游细菌群落的微阵列基因芯片

A better understanding of bacterioplankton community shifts following change in marine environments is critical to predict the marine ecosystem function. In order to get a snapshot of the microbial taxonomy profiling of a wide range marine area, a quick, convenient and low cost method would be favorable. In this study, we developed a 16S rRNA gene-based microarray using ARB software, which contained 447 probes targeting 160 families of marine bacteria. The specificity, sensitivity and quantitative capability of this microarray were assessed by single cloned16S rRNA genes. The reliability of this microarray was tested by eight environmental samples. The results showed that the microarray was specific, only 1.16% false results were detected in five single-clone hybridization tests. The microarray could detect DNA samples as few as 1 ng/μL and the signal intensity could reflect the relative abundance of the bacteria in the range of 1 ng/μL to 100 ng/μL of DNA concentration. Hybridization with environmental samples showed that it can discriminate bacterioplankton communities by sites and time. High throughput sequencing results from the eight samples confirmed the hybridization results. It indicated that this developed microarray could be used as a convenient tool to monitor the bacterioplankton community in marine environment.     

一种用磷酸钙法高效转染HEK 293T细胞方法的建立

利用磷酸钙转染法将lacZ-pShuttle质粒导入HEK 293T细胞中,实验证明,pH值、DNA纯度、转染后培养时间和甘油休克时间是影响转染效率的重要因素.转染后培养6h进行甘油休克效果最佳,比培养0h直接进行休克转染效率升高584.4%;甘油休克时间为4.5min时转染效果最佳,比不用甘油休克转染效率升高130.8%.通过对影响转染的几个条件进行优化,建立了1种可以高效转染HEK 293T细胞的方法,且简便易行.     

青岛近岸能见度逐小时分级预报模型初探

本文对青岛2014~2015年4~8月份位于青岛奥帆基地站和胶州湾跨海大桥上的大桥4站的逐小时自动气象站测量数据进行多种统计分析工作,发现两地能见度变化影响因子有不同特点,大桥4站在雾出现时降温增湿过程更明显。能见度处于1km以下时,风速降低,温度降低,绝对湿度减小会导致更低的能见度出现。使用神经网络方法分别对两站建立逐小时的能见度分级预报模型,并用2016年4~8月数据进行预报检验,表明少数关键预报因子就可以较好地建立预报模型,奥帆基地站能见度0~1km和1~5km级别的TS评分可超过0.4,因子增多会提升能见度1~5km级别的预报效果。两站独立建模比使用一个模型预报效果更好。该研究为青岛近岸能见度精细化客观定量预报提供参考。