双锯鱼(Amphiprion)胚胎不同发育阶段和成鱼不同组织中内参基因的筛选及应用

双锯鱼(Amphiprion)亦称为海葵鱼,又称为小丑鱼,是一类经济价值较高的海水观赏鱼。目前国内在双锯鱼的胚胎发育、人工饲养以及形态学观察等方面已经取得了有效成果,但在分子生物学水平上对其基因表达的研究较少。为了筛选出适用于双锯鱼胚胎不同发育阶段以及成鱼组织的内参基因,分析酪氨酸酶(TYR)基因的表达情况,以眼斑双锯鱼(A.ocellaris)和白条双锯鱼(A.frenatus)为材料,利用实时定量聚合酶链式反应(qPCR)对18SrRNA、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因)、Ef-1α(转录延伸因子基因)和β-actin(β-肌动蛋白基因)这4个候选内参基因的表达水平进行检测,同时通过geNorm和Norm Finder软件对其稳定性进行评估,最后以合适的内参基因作为参考,研究TYR mRNA的表达水平。结果表明,在双锯鱼胚胎的不同发育阶段,18S和β-actin的表达量相对于其他基因较为稳定;在双锯鱼的不同组织中,稳定性依次为18S>β-actin>Ef-1α>GAPDH。以18S作为内参基因时分析发现TYR基因的表达在双锯鱼胚胎发育过程中呈先上升后下降的趋势,在体节期表达量最高;在双锯鱼各组织中均有表达,且在眼、尾和红皮中表达量最高。     

牙鲆17β-HSD1基因克隆及其表达调控的初步研究

17β-羟类固醇脱氢酶1(17β-HSD1)的主要作用是将雌酮(El)转化为发挥功能的雌二醇(E2)。作者从牙鲆(Paralichthys olivaceus)性腺转录组数据库获得该基因的开放阅读框(ORF)序列,对其进行了验证,并分析了该基因在高温、外源性激素处理条件下性腺分化期性腺组织中的差异表达以及c AMP和转录因子(NR5a2和NR0b1)在精巢原代细胞中对该基因表达的作用。结果显示,牙鲆17β-HSD1基因的ORF为873bp,编码290个氨基酸,与其他鱼类的有很高的相似性。半定量RT-PCR结果表明,该基因在卵巢中高表达,精巢有少量表达,并且在雌性个体的鳃、头肾、肾、脾、胃和肠中也有表达。实时定量RT-PCR结果显示,该基因在卵巢或精巢分化的关键时期表达量较高;在精巢原代培养细胞中,外源信号分子c AMP及转录因子NR5a2可以显著下调17β-HSD1基因的表达(P0.05),且呈现剂量效应,转录因子NR0b1对该基因的调控也与剂量有关。作者推测牙鲆17β-HSD1基因在性腺分化中起一定的作用,其表达受到调控因子的作用,这些结果将有助于增加对鱼类性腺分化和发育的认识。     

环境浓度的丁草胺暴露对雌性褐菖鲉卵巢发育的干扰

丁草胺是使用最广泛的酰胺类除草剂之一,目前丁草胺对鱼类的生殖毒性研究集中于淡水种类,近海鱼类鲜有报道。本研究以分布于我国东南海域的近海经济鱼类褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)为受试对象,探讨丁草胺对海洋鱼类卵巢发育的影响及机制。褐菖鲉在以环境相关浓度(2、20、200 ng/L)的丁草胺暴露50 d后,褐菖鮋卵巢生殖细胞发育受到不同程度抑制,卵巢17β-雌二醇(E2)水平下降,Caspase-3活性上升。相对定量PCR分析结果显示,卵巢芳香化酶基因(CYP19s)及雌激素受体基因(ERβ)表达量下降。结果表明：丁草胺对褐菖鮋具有明显的生殖毒性,卵巢CYP19s基因与ERβ基因表达被抑制而导致卵巢雌激素水平的下降引起卵细胞在发育早期的细胞凋亡是主要原因。     

实时荧光定量PCR分析中不同铁浓度处理下玛氏骨条藻内参基因的筛选

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)是定量分析基因表达的常用方法,选择合适的内参基因对准确分析目的基因表达水平至关重要。本研究以不同铁浓度培养条件下的玛氏骨条藻为材料,定量分析Cytb、EF-1α、HPRT、UBC、GAPDH、β-actin以及β-tubulin 7个内参基因的表达情况,并利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件对这些内参基因的稳定性进行综合评价。结果表明,Cytb和EF-1α的表达稳定性较好,EF-1α+Cytb组合的稳定性最佳,是玛氏骨条藻基因表达研究的理想内参基因,而其他基因的表达稳定性较差,不适合作为内参基因。本研究为玛氏骨条藻基因表达研究过程中内参基因的选择提供了方法学上的依据。     

牙鲆耐寒相关基因CIRP、HMGB1的克隆及表达特征分析

为鲆鲽鱼耐低温标记辅助育种研究和应用提供候选基因,并了解耐寒相关基因在低温下的表达图示,作者通过同源克隆以及5?/3?RACE的方法扩增得到了牙鲆(Paralichthys olivaceus)CIRP和HMGB1基因。组织表达谱分析显示,这两个基因在脑、鳃、心脏、肌肉、肝脏、肠等组织均有表达,但HMGB1基因在鳃中表达较弱。低温胁迫后,两基因随着胁迫时间的延长其表达量在肌肉中都出现先上升后下降的趋势:在0~12 h逐渐上升并达到最大值,然后下降恢复至最初水平。但在肝脏和脑组织中的变化趋势却不同,低温胁迫后0~2 h HMGB1基因在脑中的表达量上升至最高,然后下降至最初水平,在肝脏中变化不大。而CIRP基因在低温胁迫后0~2 h在肝脏中表达量处于上升趋势,然后下降至初始水平,在脑中变化不大。由此推测,这两个基因在低温条件下都参与了机体对外界的抵抗,特别是在抵抗外界寒冷的主要组织—肌肉中发挥作用,可能共同参与了机体的免疫反应,对低温胁迫环境下的鱼体进行保护,可以作为鱼类耐低温标记筛选的候选基因。     

三倍体牙鲆的核型证明

于1990，1993 - 1994年以捕自青岛近海的牙鲆亲鱼，采用冷休克法（0－4°C）进行多倍体的人工诱导实验，以期掌握牙鲆细胞遗传学特征和研究遗传育种方法。通过实验得到了三倍体牙鲆并进行培育。在原肠胚期采用空气干燥法、Giemsa染色获得正常二倍体、三倍体的染色体制片。镜检得，牙鲆二倍体染色体以2n=48，均为端部着丝点染色体，核型为24t，其管数NF=48；三倍体的染色体3n=72，也都为端部着丝点染色体，其臂数NF=72，并依据二倍体的枝型得出了三倍体的核型图。     

同时测定牙鲆肌肉中DNA和RNA的简便方法

组织细胞中ＤＮＡ的含量是基本恒定的,但ＲＮＡ含量则随细胞中蛋白质代谢水平的不同发生很大变异,进一步的研究证实,ＲＮＡ／ＤＮＡ比值与鱼类体重及体长增长速率相关,因而在研究鱼类的生长时,一般要考察其组织中ＲＮＡ含量及ＲＮＡ／ＤＮＡ比值的变化,作为反映其蛋白质代谢及生长速率的生化指标。本文建立了一种可同时测定样品中ＤＮＡ及ＲＮＡ的简便方法。１材料与方法１．１仪器小型离心机、消化炉、水浴锅、７２２－型光栅分光光度计等。１．２肌肉中ＤＮＡ和ＲＮＡ的抽提１．２．１精确称取０．１ｇ左右冰冻保存的肌肉样品,铰碎…     

脱水对条斑紫菜叶状体psbA和psbD基因表达量的影响

从处于不同脱水复水阶段的条斑紫菜(Porphyra yezoensis Ueda)叶状体中提取总RNA,用荧光定量PCR技术检测条斑紫菜不同脱水和复水过程中psbA和psbD基因的转录水平上的相对表达量的变化.实验结果表明,psbA和psbD基因转录水平上的相对表达量的变化趋势相似但变化幅度不一致.在相对含水量约为71...     

甘糖酯对大鼠尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)mRNA水平的影响

从分子水平上探讨海洋新药甘糖酯的抗栓作用机理。实验以大鼠为材料,采用定量ＲＴＰＣＲ方法定量检测口服甘糖酯后大鼠尿激酶型纤溶酶原激活物（ｕＰＡ）基因ｍ ＲＮＡ水平变化。研究表明大鼠口服甘糖酯后ｕＰＡ基因ｍ ＲＮＡ 水平高于对照组,差异显著。结论认为甘糖酯可提高体内ｕＰＡ基因的ｍ ＲＮＡ 水平,从而提高ｕＰＡ蛋白的活性,激活机体的纤溶系统,达到抗栓作用。     

急性温度胁迫对妊娠期许氏平鲉生殖内分泌机能的影响

为探究温度对妊娠期许氏平鲉(Sebastes schlegelii)生殖内分泌机能的影响,采用内分泌学和分子生物学方法,对急性温度胁迫后许氏平鲉的血清性类固醇激素的变化及脑和卵巢生殖相关基因表达的变化进行了系统的探究和分析。研究表明:妊娠期许氏平鲉的性腺型芳香化酶(P450aromA)具有温度敏感性。血清中17β-雌二醇(E2)和卵巢雌激素受体α(ERα)表达水平在急性高温胁迫后发生了显著下降,在急性低温胁迫后明显升高。在温度胁迫下,卵巢中雌激素受体β1(ERβ1)和雌激素受体β2(ERβ2)呈现出显著不同的表达方式;急性高温胁迫后,与性腺型芳香化酶基因(CYP19a1a)相比,脑型芳香化酶基因(CYP19a1b)的转录水平上升显著,表明二者在不同组织中承担着不同的生理功能;在妊娠期许氏平鲉脑中,CYP19a1b、E2、ERα间形成了自动反馈调节,促进CYP19a1b的转录;此外,Foxl2能够促进脑中芳香化酶的表达。研究结果表明,妊娠期许氏平鲉对高温胁迫更敏感,所需恢复期更长。在实际生产中,对于进入生殖期的雌鱼,应密切关注养殖水温的变化,减少温度应激。维持水温的相对恒定,以保证亲鱼胚胎发育和产仔进程的顺利进行。     

杂交鲆(牙鲆♀×夏鲆♂)胚胎发育的初步观察

通过人工调控促使亲本牙鲆(Paralichthys olivaceus)♀×夏鲆(Paralichthys dentatus)♂的性腺发育,人工干法授精获得杂交受精卵。杂交受精卵在温度为16.5~17.5℃,光照为100~400 lx,微充气条件下孵化。对杂交鲆胚胎发育全过程进行连续观察并与牙鲆及夏鲆的胚胎发育进行比较。结果表明:杂交鲆卵裂方式与其他大部分硬骨鱼类一样,属于盘状卵裂。受精后经过2 h 30 min进入2细胞期,7 h 45 min进入囊胚期,15 h 10 min进入原肠胚阶段,25 h 30 min进入神经胚期,49 h左右进入尾芽期。授精后63 h左右发现初孵仔鱼,68h左右50%的仔鱼孵出。在杂交鲆的胚胎发育中,主要有2个发育特征与母本类似而与父本不同:视囊的出现要早于体节的分化;孵化前,仔鱼在卵膜内环绕卵黄囊不到1周。但是在其孵化时间上却与父本相似。     

养殖比目鱼生殖及其调控机理研究进展

综述了养殖比目鱼生殖及其调控机理研究的最新进展,包括雌鱼卵巢发育及其外源激素和光温调控,雄鱼精巢发育及其外源激素和光温调控,性别分化的温度决定机制,早期性别鉴定方法等.旨在为我国比目鱼的养殖和研究提供科学依据.     

外源激素对养殖牙鲆血浆睾酮和雌二醇含量的影响研究

雄性牙鲆单独注射促黄体激素释放激素类似物(LHRH-A)(每千克质量的注射量,下同)25μg/kg或人绒毛膜促性腺激素(hCG)1 000 IU/kg,血浆睾酮(T)含量在注射后6 h大幅度降低,12h时达到最低值,以后逐渐回升;LHRH-A与hCG联合注射[LHRH-A(12.5μg/kg)+hCG(500 IU/kg)],注射后6 h血浆T含量剧烈下降,24 h时达到最低点,以后缓慢回升;对照组雄鱼血浆T含量随着采样进行而呈现降低趋势.雌鱼单独LHRH-A后,血浆雌二醇(E₂)水平逐渐下降,24 h时达到最低值,30 h后略有回升;单独注射hCG后,血浆E₂含量缓慢下降,30 h达到最低值;LHRH-A与hCG联合注射,注射后6 h血浆E2含量逐渐下降,24 h时达到最低点,30 h时缓慢回升.对照组雌鱼血浆E₂水平也随着采样的进行而逐渐降低.结果表明:单独或联合注射LHRH-A和hCG降低了雌、雄牙鲆血浆E₂和T含量,与对照组结果相同.     

牙鲆胃肠道及肝脏GnRH受体的免疫组织化学研究

利用免疫组织化学ABC法，对牙Ping胃肠道及肝脏促性腺激素释放激素（GnRH）受体的表达及分布特点进行了研究。结果显示：胃肠道粘膜上皮、腺上皮及肝细胞呈GnRH受体免疫反应阳性，阳性反应物分布在细胞膜和细胞质中，细胞核呈阴性反应。提示：牙Ping胃肠道上皮细胞及肝细胞能够表达GnRH受体，说明GnRH可能通过其受体影响牙Ping消化系统的功能。     

牙鲆野生群体与养殖群体的遗传多样性分析

利用AFLP技术对荣成野生群体和养殖群体牙鲆进行遗传多样性分析和比较。实验采用 7对引物组合在 2个群体中共扩增出 797个位点 ,其中多态位点数为 43 3个 ,占总位点数的 5 4.2 7%。各引物组合在 2个群体中的扩增位点数目和多态位点比例有较大不同 ,但养殖群体的总扩增位点数和多态位点比例均低于野生群体 ,野生群体和养殖群体的平均多态位点率分别为 46.18%和 40 .0 7% ,其中 ,E3 8M 5 0引物组合在两群体中扩增的多态位点比例差异显著 (P <0 .0 5 )。养殖群体中低频位点明显减少而隐性纯合基因位点显著增加。群体遗传结构分析表明 ,两群体间的遗传距离比较小 ,群体遗传结构相似 ,说明养殖群体尚没有形成自己独立的遗传结构。     

牙鲆胸腺的组织学研究

牙鲆的胸腺位于鳃腔背面结缔组织膜上,紧贴着肾脏的头部,界限清晰,胸腺不向咽腔突出,胸腺上皮没有粘液细胞。牙鲆胸腺没有明显的外区和内区之分,胸腺细胞和巨噬细胞比较均匀地分布于整个组织中,未能观察到胸腺小体。在胸腺的细胞类型上,首次发现了大量的交错突细胞,常与淋巴细胞相伴,其特点是具有大量的”迷路样”膜结构。同时还发现,牙鲆胸腺可以不对称并存在快速退化现象,在3月龄时最易观察,而6月龄以上的牙鲆即退化消失。     

In vitro acute cytotoxicity of the neonicotinoid insecticide acetamiprid to FG cells, the gill cell line of flounder Paralichthy olivaceus

The in vitro acute cytotoxicity of the neonicotinoid insecticide acetamiprid to FG cell line, derived from the gill of flounder Paralichthys olizaceus, was tested by the three widely used endpoint bioassays-neutral red （NR） assay, tetrazolium （MTT） assay and cell protein assay. It was found that acetamiprid was increasingly toxic to FG cells at concentrations of 1 μg/cm^3 or above, and the inhibitory concentration 50% values for NR, MTF, and cell protein assays were 38.38, 36.27 and 32.03 μg/cm^3, respectively. This appeared to be the first report on the in vitro cytotoxicity of acetamiprid to non-mammalian vertebrate cells. Ultrastructural examination revealed that for the cells exposed to 60 μg/cm^3 acetamiprid for 48 h, their mitochondria were severely damaged with the cristae swelled up or disrupted, while their nuclei and rough endoplasmic reticlum （RER） appeared to be still normal. This suggests that mitochondria are possibly the primary target of acetamiprid.     

In vitro acute cytotoxicity of the neonicotinoid insecticide acetamiprid to FG cells, the gill cell line of flounder Paralichthy olivaceus

1 IntroductionAcetamiprid (( E)-N1-[( 6-chlor-3-pyridyl )methyl]-N2-cyano-N1-methylacetamidine), a cyano-substituted neonicotinoid compound ( Kagabu,1999), is a relatively newclass of insectide, exhibi-ting a broad insecticidal spectrum ( Matsunaka,2000; …     

大西洋牙鲆幼鱼肌肉组成与营养需求的探讨

测定了养殖大西洋牙鲆幼鱼肌肉中的蛋白质、脂类、灰分等生化组织,并计算了其比能值,分析了肌肉蛋白质中17种常见氨基酸的含量、脂肪酸组成及含量。结果表明:大西洋牙鲆属高蛋白、低脂肪、低比能值鱼类,肌肉氨基酸含量同其它鲆鲽鱼类相比,属中等水平,必需氨基酸和呈味氨基酸的含量较高;肌肉蛋白中氨基酸的支/芳值为2.794;脂肪酸含量中棕榈酸(16∶0)的含量最高,其次为油酸(18∶1 n)和DHA(22∶6 n-3);其EPA(20∶5 n-3)和DHA(22∶6 n-3)的含量较高,营养丰富且平衡良好,是值得推荐的优良养殖品种和食用鱼类。