大菱鲆精子运动特征与精液pH的相关性研究

为探究大菱鲆(Scophthalmus maximus)精液质量与pH的关系及甘油对大菱鲆精子激活的影响,本研究通过计算机辅助精子分析系统分析检测了威海和烟台4家大菱鲆育苗场(A、B、C、D)的精子质量。研究发现,不同育苗场的大菱鲆精子活力存在显著的差异,A2A1DCB,精子预测寿命分别为11.7、7.1、6.8、4.6、3.3 min,所取精子的质量的存在显著差异。研究结果发现,大菱鲆精子运动特性与精子活化率相关性显著,其中精子活化率与平均曲线运动速度、平均直线运动速度、平均路径速度、精子头侧摆幅度、精子平均鞭打频率呈显著正相关(P0.05),与运动直线性、运动摆动性、运动前向性等参数无显著相关性;大菱鲆精子运动特性受pH影响显著,精液pH与平均曲线运动速度、平均直线运动速度、平均路径速度、精子头侧摆幅度、精子平均鞭打频率呈显著正相关(P0.05),而与运动直线性、运动摆动性、运动前向性等参数无显著相关性。同时还发现,精子活化率高、寿命长的大菱鲆精液pH偏弱碱性(pH=8.0),即大菱鲆精子适宜在弱碱性环境中活动。除此之外,向激活海水中加入梯度甘油(0.1、1、10、100、500、1 000 mmol/L),发现可以显著提高大菱鲆精子寿命,其中甘油浓度为100 mmol/L时,精子寿命延长至15.17 min±0.29 min,推测甘油在精子激活后可能被精子吸收并氧化分解提供能量。     

大菱鲆微卫星标记在亲本后代中的分离分析

为对大菱鲆(Scophthalmus maximus)的养殖群体进行微卫星分析研究,作者用70个微卫星位点在大菱鲆亲本后代中的基因型分离方式进行检测与分析。结果显示,70个位点共产生了12种分离方式(♀×♂)。70个微卫星位点中45个位点符合孟德尔遗传定律(P≥0.05),有25个位点偏离了孟德尔遗传定律(P0.05)。平均等位基因数目为2.2,平均有效等位基因数为1.885。平均期望杂合度和观测杂合度分别为0.55和0.537。多态信息含量为0.182~0.699,平均值为0.361。研究证明这些标记大部分可以用于大菱鲆进一步的图谱构建,QTL定位和分子标记辅助育种研究。同时对群体的分析表明,该大菱鲆养殖群体遗传多样性水平较高,可用于进一步的良种繁育。     

大菱鲆早期发育过程中免疫器官的发生

应用组织切片研究了大菱鲆(Scophthalmus maximus)初孵仔鱼至60 日龄幼鱼免疫器官的发育过程。结果表明, 免疫器官原基出现的先后顺序是头肾、脾脏和胸腺。1 日龄仔鱼可以观察到头肾原基, 包含未分化的造血干细胞。5 日龄时, 脾脏原基出现, 其淋巴化开始于27 日龄且发育速度较慢。13 日龄时, 大菱鲆仔鱼胸腺原基出现, 且发育速度较快, 分为外区和内区。在大菱鲆早期发育过程中, 胸腺和头肾之间出现细胞迁移现象。免疫器官淋巴化的顺序是胸腺、头肾和脾脏。在免疫器官发育后期, 脾脏和头肾中均发现了黑色素-巨噬细胞中心(MMCs), 脾脏中较丰富, 但在胸腺中尚未发现。在大菱鲆仔鱼早期发育阶段, 免疫器官尚未发育完善, 非特异性防御机制起着重要的免疫作用。     

大菱鲆家系选育二代7种免疫因子的分析

为选育高成活率的大菱鲆(Scophthalmus maximus)抗鳗弧菌(Vibrio anguillarum)群体,对30个大菱鲆选育二代家系(F2)和1个普通养殖群体进行鳗弧菌攻毒实验(周期为14 d),统计分析死亡率。选取死亡率不同的6个选育家系和普通养殖群体构成7个实验组,采用半定量-聚合酶链反应(semi-quantitative polymerase Chain reaction,RT-PCR)技术对它们肝脏、脾脏、头肾的相关免疫因子——溶菌酶(Lysozyme)、抗菌肽(Hepcidin)、热激蛋白70(HSP70)、热激蛋白90(HSP90)、免疫球蛋白(Ig M)、C-型凝集素(C-type lectin)、Lily-型凝集素(Lily-type lectin)的表达量开展研究,并应用SPSS 16.0软件对攻毒前后各免疫因子的表达量与攻毒后存活率之间的相关性进行分析。研究结果表明:攻毒前后选育家系幼鱼肝脏、脾脏、头肾中7个免疫因子的表达量普遍高于普通养殖幼鱼,且在7个实验组中,攻毒后的表达量相较攻毒前均呈现下降趋势;攻毒前,肝脏中lysozyme、Ig M的表达量与存活率为极显著性正相关(P0.01),HSP70、HSP90、C-type lectin、Lily-type lectin的表达量与存活率为显著性正相关(P0.05);脾脏中,Hepcidin、HSP70和HSP90的表达量与存活率为极显著性正相关(P0.01);头肾中,HSP70的表达量与存活率为显著正相关(P0.05)。综上,可以推断选育家系相对于普通养殖群体大菱鲆抗鳗弧菌性能更强,且7种免疫因子在鳗弧菌感染鱼体的过程中发挥重要的抗感染作用;从F2中获得一个抗鳗弧菌性能较强的家系(23号),可用于今后大菱鲆抗鳗弧菌品系的选育指导工作,为大菱鲆高成活率群体的选育提供参考资料和理论依据。     

水位深度对工厂化流水养殖大菱鲆生长的影响

为探讨水深对工厂化流水养殖水环境的影响,本实验将9 000尾初始体质量为141.62±24.47 g的大菱鲆(Scophthalmus maximus)按照低水深(20 cm)、中水深(40 cm)、高水深(60 cm)条件分为3个不同养殖水深组,实验周期为80 d。实验期间,跟踪检测长期和特定时期(投喂后8 h内)不同养殖水深水体中总氨氮(TAN)、亚硝酸盐(NO₂^--N)、固体悬浮物(SS)、化学需氧量(COD)等参数,并在实验结束时对大菱鲆成活率、体质量、饲料系数水平进行测量。研究表明,水池内水流速度与水深呈负相关,但各组间无显著性差异。高水深组的固体悬浮物含量显著(P<0.05)低于其他两组,低水深组的化学需氧量显著(P<0.05)低于其他两组,各水深组中氨氮、亚硝酸盐都在大菱鲆幼鱼安全浓度范围内,且无显著性差异。在投喂后,固体悬浮物含量在各水深组中呈先升高后降低趋势,其中低水深组波动最大。氨氮含量在投喂后3 h开始上升,其中低水深组涨幅最大。各水深组中化学需氧量随着投喂时间延长而逐渐积累,而亚硝酸盐含量基本保持不变。实验结束,低水深组中大菱鲆增质量率、特定生长率、体质量变异系数均显著(P<0.05)高于高水深组,而存活率、肥满度、饲料系数在各组之间没有显著差异。研究结果显示,增加水深有利于提高养殖水环境水质恶化的缓冲能力。在保证养殖系统水质指标安全的前提下,低水深在大菱鲆工厂化流水养殖中是一个可行的方案。     

一株海洋细菌YCSC6的鉴定及其体外杀盾纤毛虫的能力

为开发安全、高效的防治大菱鲆(Scophthalmus maximus)盾纤毛虫(scuticociliate)病新型药物,本研究从近海微生物菌种资源库中筛选获得了一株有杀盾纤毛虫效果的细菌,利用形态学和分子生物学方法鉴定该菌为肋生盐弧菌(Salinivibrio costicola),通过共培养实验进行YCSC6杀灭大菱鲆病原性盾纤毛虫的药效活性实验,同时利用光学显微镜和扫描电镜观察记录YCSC6的杀虫特征。结果发现海洋细菌YCSC6发酵上清液可导致盾纤毛虫膜出现穿孔,膜完整性丧失从而裂解,在一定时间内,发酵液发酵时间越长,裂解能力越强。本研究从安全、高效的角度出发,筛得一株可裂解盾纤毛虫的海洋细菌YCSC6,并初步探究了其杀虫特征及能力,为养殖渔业微生物杀虫剂的开发提供了安全有效的来源。     

减数分裂期雄性大菱鲆孕激素及受体基因的表达分析

为研究孕激素在大菱鲆(Scophthalmus maximus)精原细胞增殖到减数分裂过程中的作用,以6~22月龄的大菱鲆精巢为材料,通过组织学方法和定量amh、sycp3基因确定精原细胞增殖期和减数分裂期的大菱鲆精巢发育过程。通过酶联免疫吸附技术(ELISA)检测6~22月龄雄性大菱鲆血清中的孕酮(P4)和17α,20β,双羟孕酮(DHP)含量变化,利用q RT-PCR技术和原位杂交技术检测孕酮核受体(pgr)和膜受体(m PRα)在不同组织和不同发育时期的表达情况。结果表明孕激素在精原细胞增殖期高表达,开始出现初级精母细胞时降低,在精子细胞数量增加时表达量再次升高,在精子细胞变态形成精子时降低。pgr在减数分裂初期定位于精巢中的sertoli细胞,在精原细胞增殖至减数分裂期表达量逐渐增加,出现精子后显著降低;m PRα在精原细胞增殖和初级精母细胞增加时表达量都很低,在精子细胞不断增加时显著增加。推测在精原细胞增殖和减数分裂阶段孕激素可能主要通过调节pgr的表达量来促进精巢发育,而在减数分裂II期pgr和m PRα都发挥作用,在精子细胞变态成熟时,主要是m PRα发挥作用。     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)热休克蛋白SmHsp47相互作用蛋白His-pull down和质谱鉴定

首次克隆了大菱鲆(Scophthalmusmaximus)热休克蛋白Sm Hsp47基因。该基因c DNA序列全长为1 927 bp,其中开放阅读框长度为1 218 bp,编码一条长度为405个氨基酸的多肽链。结果表明,大菱鲆Sm Hsp47基因在肝脏、皮肤、鳃和肠等4个组织中都有表达,表达量最高的组织是肝脏,表达量最低组织是鳃; 25°C处理6 h后Sm Hsp47在皮肤中的表达量增加150多倍。利用大肠杆菌原核表达系统表达了Sm Hsp47的his标签融合蛋白,然后利用His-pull down技术捕获了Sm Hsp47的相互作用蛋白质,通过质谱分析鉴定出31种候选蛋白,其中大部分蛋白为参与翻译后修饰,蛋白转换及分子伴侣;此外还包括参与脂转运与代谢、能量产生与转换、细胞骨架、防御机制等过程的蛋白质。从31种候选蛋白中进一步筛选出3种分值较高的蛋白:未知蛋白(uncharacterizedprotein,A0A6A4TFV0)、胎球蛋白B(FetuinB,A0A2U9C388)和胶原结合蛋白(collagen-bindingprotein,A0A2U9B608),可为后续的研究提供方向。     

养殖水体中氨氮对大菱鲆的急性毒性效应研究

为了评估大菱鲆(Scophthalmus maximus)耐氨氮性状的遗传参数和为循环水养殖大菱鲆提供科学指导,作者研究了养殖海水中氨氮对4月龄和8月龄大菱鲆的急性毒性效应,同时对比了氨氮对白化和正常个体、雌性和雄性个体的急性毒性效应差别。结果表明:非离子氨对4月龄大菱鲆的24、48、72、96 h LC50分别为2.19、1.94、1.80、1.72 mg/L,对8月龄大菱鲆的24、48、72、96 h LC50分别为3.64、3.02、2.93、2.86 mg/L,非离子氨对4月龄和8月龄大菱鲆的安全质量浓度分别为0.17和0.29 mg/L;氨氮对白化和正常大菱鲆以及雌性和雄性大菱鲆的急性毒性效应均没有显著性差异,研究结果为进一步选育大菱鲆的耐氨氮品系提供科学依据。     

不同铁水平饲养对大菱鲆(Scophthalmus maximus)生长及耐低氧能力影响的研究

铁元素作为细胞色素的重要成分参与鱼类细胞内的氧化还原供能过程,在鱼类应对低氧胁迫时发挥重要作用。以硫酸亚铁为铁源,研究不同铁水平饲养对大菱鲆(Scophthalmus maximus)生长及耐低氧能力的影响。在含铁量为463 mg/kg的基础饲料中添加0(A组)、75(B组)、150(C组)、225(D组)和300(E组)mg/kg铁离子,探究不同铁水平饲喂对大菱鲆常氧下的生长、血清生理生化指标以及抗低氧胁迫的影响。结果显示,常氧情况下,随着饲料中铁含量的增加,上述指标呈先增加后下降的趋势(P<0.05),且C、D组均为峰值显著高于A、B、E三组(P<0.05)。低氧胁迫及耐受实验结果显示,随着低氧胁迫的加剧,C、D两组抗氧化酶活性(SOD,GSH-PX)、低氧[DO=(2.0±0.5) mg/L]死亡率均显著高于或低于其他三组(P<0.05)。铁作为重要的氧载体和电子传递体影响着生物体的物质代谢和能量代谢。研究表明饲料铁水平613~688mg/kg的饲养对大菱鲆生长性能、抗氧化系统的增强和提高低氧耐受能力具有促进作用,研究结果可为鱼类健康养殖和功能性饵料研制提供新数据支撑。     

饵料中添加益生菌对大菱鲆幼鱼肠道菌群及部分免疫指标的影响

作者以初体质量为(4.80±0.11)g的大菱鲆(Scophthalmus maximus)为研究对象,在循环水水族箱中进行60 d饲喂实验,研究饲料中添加单一益生菌和复合益生菌对大菱鲆肠道菌群及部分血液免疫指标的影响。以基础饲料为对照组,在基础饲料中分别添加枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌+地衣芽孢杆菌(1:1)、嗜酸乳酸菌(Lactobacillus acidophi-lus)、双歧杆菌(Bifidobacterium inopinatum)、嗜酸乳酸菌+双歧杆菌(1:1)、枯草芽孢杆菌+地衣芽孢杆菌+嗜酸乳酸菌+双歧杆菌(1:1:1:1),每克饲料约含菌3.0×109个/g干质量,共配制7种实验饲料。实验结果显示,饲料中添加益生菌对肠道中总菌数无显著影响,但显著降低了肠道弧菌数(P<0.05),显著提高了大菱鲆酚氧化酶活力、溶菌酶活性和总抗氧化力。添加不同的益生菌对血细胞数、血清蛋白浓度及超氧化物歧化酶的影响不同,例如添加的益生菌中含有乳酸菌能显著提高大菱鲆血清蛋白浓度(P<0.05),而添加芽孢杆菌无此效果。上述实验结果表明,与添加单一益生菌相比,在饲料中添加复合益生菌对降低大菱鲆肠道弧菌总数,提高机体免疫力具有更好的促进作用。     

急性热应激对大菱鲆血液生化指标的影响

为探讨大菱鲆(Scophthalmusmaximus)大规格幼鱼热耐受性和热应激过程中敏感指标的变化,本研究设定18℃、21℃、24℃和27℃4个温度梯度,采用1℃/h的升温速率,对驯化温度为18±1℃的苗种进行96 h急性胁迫实验,统计各温度组96 h成活率和测定血浆部分生化指标的变化情况。结果表明,在pH 7.85、盐度29.5和溶解氧高于6.5 mg/L的环境条件下,平均体质量183.65±15.99 g的大菱鲆幼鱼96h高起始致死温度(UILT50)为28.05℃;温度和胁迫时间对血浆肾上腺素(EPI)、皮质醇(Cortisol)、血糖(GLU)、还原型谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和碱性磷酸酶(AKP)含量/活性都存在显著影响,除GSH外,温度和胁迫时间存在显著的交互影响作用;热应激组血浆EPI含量随胁迫时间延长呈逐渐上升趋势,同一胁迫时间以21℃组含量最高;热应激组Cortisol含量的响应时间随温度升高相应提前、随胁迫时间呈先升后降的趋势,均在48 h达最高值; 24℃和27℃组GLU含量随胁迫时间呈先升后降趋势,胁迫3h～6h即达最高值,上升幅度与温度正相...     

星斑川鲽、大菱鲆及其杂交后代的线粒体DNA 序列比较分析

为了揭示星斑川鲽(Platichthys stellatus)♀×大菱鲆(Scophthalmus maximus)♂杂交后代的种质遗传属性,作者采用线粒体(mt)DNA COI基因片段和控制区(D-loop)序列对星斑川鲽、大菱鲆及两种间的杂交后代(星斑川鲽♀×大菱鲆♂)遗传特性进行研究。研究结果显示,基于mtDNA COI和D-loop序列结果显示星斑川鲽和大菱鲆的种间遗传距离分别为22.9%和41.2%,相似的研究结果显示星斑川鲽♀×大菱鲆♂杂交后代与大菱鲆的遗传距离分别为22.9%和41.2%,遗传差异极其显著。而基于mtDNA D-loop序列结果显示星斑川鲽♀×大菱鲆♂杂交后代与星斑川鲽的遗传距离仅为0.4%,并且在mtDNA COI基因片段上两者序列完全一致,杂交后代在线粒体DNA上呈现明显的偏母遗传。     

大菱鲆低温生长遗传参数及相关的估计

The objectives of this present research were to assess the heritability of growth traits under low temperature conditions in turbot(Scophthalmus maximus L.), and to analyze the correlation between body weight(BW) and body length(BL). There were 536 individuals from 25 full- and half-sib families involved in this study. During the entire 90-day period, which was initiated at 233 dph(day old) and ended at 323 dph, the individuals' BW and BL were weighed consecutively six times every 18 days. The heritability of BW and BL and the correlation between these two traits were estimated based on an individual animal model with the derivative-free restricted maximum likelihood(DFREML) method. These results showed that the specific growth rates(SGR) of 25 families was from 0.75±0.11 to 1.05±0.14 under water temperature of 10.5–12°C. In addition, the heritability of BW and BL estimated under low-temperature were 0.32±0.04 and 0.47±0.06, respectively. The BW had a medium heritability(0.2–0.4), and the BL had a high heritability(0.45), which suggested that selection for increased weight and length was feasible. Moreover, there was potential for mass selection on growth. The genetic and phenotypic correlations between BW and BL were 0.95±0.01 and 0.91±0.01(P 0.01), respectively. A significant correlation between BW and BL showed that BL could be instead of BW for indirect selection, which could be effectively implemented in the breeding program.     

几种益生菌对大菱鲆幼鱼生长及消化酶活性的影响

作者以初体质量为(4.80±0.11)g 的大菱鲆(Scophthalmus maximus)为研究对象,在循环水水族箱中进行60 d 饲喂实验,研究饵料中添加单一益生菌和复合益生菌对大菱鲆生长及消化道酶活性的影响.以基础饲料为对照组,在基础饲料中分别添加枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌...     

Rearing in intermediate salinity enhances immunity and disease-resistance of turbot (Scophthalmus maximus L.)

Studies were conducted to investigate the non-specific immune responses and disease-resistance of juvenile turbot Scophthalmus maximus,cultured at four different salinities(8,20,32 and 40) . Three concentrations(3.75 × 10 7,3.75 × 10 8 and 3.75 × 10 9 CFU/ml) of Vibrio anguillarum suspension were employed at each salinity to determine the 4-day LD 50 . The serum lysozyme activity,the alternative complement pathway activity(ACH50) and the phagocytosis percentage of head kidney in turbot were tested at 24,48 and 72 h post-challenge of V. anguillarum(1.1 × 10 8 CFU/ml,0.1 ml) ,respectively,to evaluate the non-specific immune responses at the selected rearing salinities. Fish reared at salinity 20 had the lowest mortality,namely,the highest 4-day LD 50 value(8.88 ± 0.17) . Besides,the lysozyme activity,ACH50 and the phagocytosis of turbot were the highest at the salinity 20,but with the lowest at the salinity 40 treatment regardless of sampling time. In addition,the non-specific immune activities kept increasing within 72 h post-challenge of V. anguillarum,except that the lysozyme activity increased from 24 to 48 h,and then decreased from 48 to 72 h at 40 significantly. These results together indicate that rearing in intermediate salinity(20) was able to enhance the immunity and disease-resistance of turbot.     

金属蛋白酶对大菱鲆血清抗氧化酶活性及丙二醛含量的影响

为了研究金属蛋白酶对大菱鲆(Scophthalmus maximus)抗氧化系统的影响,作者分别对大菱鲆肌肉注射不同浓度的金属蛋白酶,并于3、6、12、24、48、72 h测定血清中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、总抗氧化活力(T-AOC)以及丙二醛(MDA)含量变化。结果显示,低质量浓度组(0.037mg/mL)金属蛋白酶处理后,CAT和T-SOD活力除3h显著高于对照组外(P0.05),其余时间点均与对照组无显著差异(P0.05),而低浓度组GSH-Px和T-AOC在整个试验过程中均与对照组无显著性差异(P0.05)。中质量浓度组(0.073mg/mL)金属蛋白酶胁迫后血清中CAT、GSH-Px、T-SOD和T-AOC在3 h～72 h均呈现波浪形的变化趋势。高质量浓度组(0.147 mg/mL)金属蛋白酶对上述4种抗氧化酶产生不同程度的抑制,且在6 h～72 h均显著低于对照组(P0.05)。金属蛋白酶低质量浓度和中质量浓度组MDA含量呈现较为平稳的变化趋势,且与对照组无显著性差异(P0.05),而高质量浓度组MDA含量在3 h～72 h均显著高于对照组(P0.05)。     

大菱鲆周期蛋白依赖激酶基因cdk1、cdk6克隆及表达分析

通过同源克隆以及5′/3′RACE的方法扩增得到大菱鲆(Scophthalmus maximus)细胞周期蛋白依赖激酶基因cdk1和cdk6的全长c DNA序列,在m RNA水平上分析了它们组织表达特征,并对比分析了静水压处理对其胚胎期表达的影响。结果显示,cdk1基因全长c DNA序列为1281 bp(Gen Bank登录号:KP339306),编码区为912 bp;cdk6基因c DNA全长1400 bp(Gen Bank登录号:KT186374),编码区长度为978 bp。组织RT-PCR分析表明,cdk1基因表达具有广泛性,在性腺、肾脏等生长发育较快的组织中表达量较高;cdk6基因也在多个组织中表达,在性腺中表达量最高。通过Real time RT-PCR检测基因在胚胎中的表达水平发现,静水压处理组cdk1、cdk6在胚胎发育中,总体变化趋势与对照组类似。大菱鲆胚胎对照组中cdk1在原肠期以前相对神经胚期及以后时期表达量较高,静水压处理组基因表达变化与对照组趋势相同;对照组中cdk6在原肠期出现表达高峰,但静水压处理组在原肠期表达量相对较低。静水压处理对cdk1和cdk6的表达量的影响不同,这可能与基因还有除调控细胞周期的其他功能有关。为解析这两个基因在大菱鲆胚胎发育中的作用及其机制提供了参考。