乳酸菌胞外产物对副溶血弧菌抑制作用的研究

对副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）有抑制作用的3株乳酸菌，分别命名为A-1，A-2，A3，并对其胞外产物的抑制作用进行了研究。结果表明．3株乳酸菌胞外产物对副溶血弧菌有较强抑制作用，抑菌圈直径分别可达18．6，20．3，19．5mm；抑菌物质对热处理不敏感：在60，80℃抑菌活性基本不变，在121℃处理20rain条件下抑菌效果分别是原液的67％，83％，74％，蛋白酶K处理对其活性有较大影响，抑菌成分可能是细菌素。进一步研究了细菌素抑菌活性与乳酸菌培养时间的关系。根据形态特征和常规生理生化反应进行鉴定，A-1，A-2鉴定为嗜热链球菌，A3鉴定为嗜酸乳杆菌。     

副溶血弧菌tdh基因在毕赤酵母中的表达及溶血活性检测

通过PCR技术从副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus,VP)基因组DNA上扩增耐热溶血素基因tdh,双酶切后定向插入到酵母表达载体pPICZaA中,构建重组表达质粒pPICZaA-tdh,经限制性内切酶SacI线性化后电转化毕赤酵母(Pichia pastoris,P.pastoris)GS115,经PCR和测序鉴定耐热溶血素基因成功整合到毕赤酵母的基因组中。在甲醇诱导下进行tdh的表达,SDS-PAGE分析证明重组TDH(thermostable direct hemolysin,TDH)的分子质量约为23ku,经Western blotting鉴定VP抗体能与表达的TDH发生特异反应,说明tdh基因在毕赤酵母中的表达是准确的。溶血实验证明了表达的TDH具有溶血活性。本研究首次应用毕赤酵母表达耐热溶血素基因tdh,在培养基中获得分泌表达的耐热溶血素,为研究tdh基因的功能奠定了基础。     

致病性副溶血弧菌生物膜形成特性研究

采用改良的微孔板法测定了12株弧菌的形成生物膜的效果,选择形成生物膜效果最好的副溶血弧菌ND-02,进一步研究了环境因子对其生物膜形成的影响。实验结果显示副溶血弧菌ND-02菌株在静置培养24～36 h后形成成熟的生物膜,在起始菌浓度为107～108CFU/mL形成生物膜的量最大;在30℃,NaCl浓度为3%～5%,pH偏弱碱性时的生物膜OD590值最大;C 2a+促进副溶血弧菌生物膜的形成,而M 2g+抑制生物膜的形成;副溶血弧菌在分别经大黄鱼表皮黏液、肠黏液和肝脏提取液包被的的基质上形成生物膜的作用明显,鳃黏液和脾脏提取液中次之,肌肉提取液包被后生物膜形成量最低。以上结果表明,副溶血弧菌ND-02菌株能形成稳定而明显的生物膜,而且生物膜的形成受温度、NaCl浓度、pH值等环境因子的影响。     

致病性副溶血弧菌生物膜形成特性研究

采用改良的微孔板法测定了12株弧菌的形成生物膜的效果,选择形成生物膜效果最好的副溶血弧菌ND-02,进一步研究了环境因子对其生物膜形成的影响。实验结果显示副溶血弧菌ND-02菌株在静置培养24~36 h后形成成熟的生物膜,在起始菌浓度为10⁷~10⁸CFU/mL形成生物膜的量最大;在30 ℃,NaCl浓度为3%~ 5%,pH偏弱碱性时的生物膜OD₅₉₀值最大;Ca²⁺ 促进副溶血弧菌生物膜的形成,而Mg²⁺ 抑制生物膜的形成;副溶血弧菌在分别经大黄鱼表皮黏液、肠黏液和肝脏提取液包被的的基质上形成生物膜的作用明显,鳃黏液和脾脏提取液中次之,肌肉提取液包被后生物膜形成量最低。以上结果表明,副溶血弧菌ND-02菌株能形成稳定而明显的生物膜,而且生物膜的形成受温度、NaCl浓度、pH值等环境因子的影响。     

副溶血弧菌胞外产物对中国对虾的致病性分析

１９９０年６－９月,从青岛上马镇对虾养殖场患败血病的中国对虾血淋巴内分离到副溶血弧菌２５－Ｃ菌株,利用平板玻璃纸覆盖技术,获得２５－Ｃ菌株的胞外产物（ＥＣＰ）,进行成分分析和致病性研究。结果表明,副溶血弧菌２５－Ｃ菌株的胞外产物具有多种酶活性和溶血活性,是病原菌感染中国对虾的主要因素,单独注射感染即可导致中国对虾的严重发病至死亡,ＥＰＣ蛋白可以破坏中国对虾血清的体外杀菌活力,提高２５－Ｃ菌株对中国     

微小卡罗藻溶血活性的生长期特征及其溶血毒素种类分析

研究微小卡罗藻的生长曲线及不同生长期藻细胞提取液和去藻上清液溶血活性的大小,通过乙酸乙酯和Bligh-Dyer两种方法提取溶血毒素,利用柱层析和薄层层析对溶血毒素成分进行初步的分离与分析。结果表明,藻细胞提取液在4个生长阶段中都具有明显的溶血活性,去藻上清液在平稳期和衰亡期具有明显的溶血活性,延滞期及对数生长期溶血活性很低,表明微小卡罗藻的溶血物质是其自身正常生理代谢产物,且在细胞老化过程中可以释放至水体环境中。两种提取方法都可以将溶血毒素提取出来,进一步的色谱分离和生物活性检测发现微小卡罗藻主要含有3种不同性质的溶血毒素,其溶血作用可能与微小卡罗藻较高含量的多不饱和脂肪酸18:5n3和22:6n3有关。     

球形棕囊藻溶血毒素对兔红细胞作用的AFM观察

溶血性毒素是有毒藻类分泌较多的一类毒素,具有溶血活性。运用光学显微镜和原子力显微镜(AFM)观察了球形棕囊藻Phaeocystis globosa溶血毒素对兔红细胞的溶血现象。结果显示,经毒素处理后的兔血红细胞边缘凹凸不平,只剩下一小部分残骸。该毒素可能由于其双亲性质与血红细胞膜表面的膜脂连接,产生脂溶效应,使细胞膜破坏。     

文蛤副溶血弧菌间接 ELISA检测技术的研究

从患病文蛤组织内分离出一株细菌,回归感染试验证明是文蛤的致病菌,经鉴定为副溶血弧菌,灭活后(56 ℃,1 h)制成菌苗,用该菌苗制备兔抗血清,以辣根过氧化酶标记的羊抗兔血清(HRP-IgG)为酶标二抗,对副溶血弧菌进行间接ELISA快速检测.结果表明:应用间接 ELISA 技术检测副溶血弧菌具有较高的灵敏度,其最低检测极限为 1 × 105 cfu / mL.患病文蛤内脏团中副溶血弧菌的检出率为 80 %,无病症带菌文蛤中的检出率为 15 %,海水中副溶血弧菌的浓度低于最低检测极限.表明间接 ELISA检测法不仅可以用于发病文蛤的快速检测,而且能够检测出无病症的带菌的文蛤,为有效预防副溶血弧菌病的暴发提供了检测手段.     

致病性副溶血弧菌脂多糖的制备及其对牙鲆的免疫效应

利用酚水法提取的副溶血弧菌脂多糖 (lipopolysaccharide,L PS) ,经 SDS- PAGE电泳及银染色后表明这种方法提取副溶血弧菌脂多糖显示出 4 1 .3KDa,30 .7KDa,2 5 .4 KDa以及 1 1 .8KDa 4条主要脂多糖带。用此做免疫原 ,采用加强腹腔注射法免疫牙鲆 ,测定牙鲆的血清凝集抗体效价和白细胞吞噬活性。结果表明 ,免疫后的牙鲆对副溶血弧菌的血清凝集抗体效价有显著提高 ,第 3周抗体滴度达到最高值 2 5 6 ;白细胞的吞噬活性与对照组相比有明显加强 (P<0 .0 5 )。     

含铁肠杆菌素受体调节蛋白VPA0148对副溶血弧菌毒力的影响

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种嗜盐性革兰氏阴性菌, 广泛分布于海洋环境中, 能够引起肠胃炎、伤口感染以及败血症, 是人类重要的病原菌之一。宿主体内被认为是一种低铁环境, 能够激发致细菌的毒力。副溶血弧菌能够分泌弧菌素或利用外源铁载体来获取铁。在低铁条件下, 编码双组份调控系统的基因簇VPA0148-VPA0149转录上调, 使含铁肠杆菌素受体PeuA转录出有活性的蛋白。VPA0148编码产物为一个响应调节因子, 具有一个磷酸基团接收结构域和一个DNA结合结构域。本研究发现, VPA0148的缺失增强了菌株的生物膜形成能力和对斑马鱼的致死能力, 同时能够促进菌株在低铁环境中的生长, 并增强菌株的群集运动。研究结果表明含铁肠杆菌素受体调节蛋白VPA0148对副溶血弧菌致病力具有调控作用, 增进了对铁调节副溶血弧菌毒力机制的认识。     

大黄鱼病原副溶血弧菌单克隆抗体制备及其应用

用甲醛灭活副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和溶藻弧菌(V.alginolyticus)制成免疫原免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,获得1株特异的针对副溶血弧菌的单克隆抗体,命名为D6F3H5。腹水及培养上清液抗体的ELISA效价分别为:1∶5 120和1∶1 280,该单克隆抗体与其它细菌没有明显的交叉反应。利用该单克隆抗体和兔抗副溶血弧菌多克隆抗体,建立了检测副溶血弧菌的双抗体夹心ELISA方法。该方法对副溶血弧菌的最小检出量为5×104个/mL。用双抗体夹心ELISA检测大黄鱼(Pseudosciaena crocea)样品,14尾患病大黄鱼中有11尾检出副溶血弧菌,而10尾健康大黄鱼都没有检出副溶血弧菌。由此可见,本试验制备的高特异性的抗副溶血弧菌单克隆抗体,可以用于患病大黄鱼副溶血弧菌的快速诊断。     

亚历山大藻溶血毒性的初步研究

研究了11株亚历山大藻（Alexandrium spp．）的溶血毒性,其中7株亚历山大藻具有显著的溶血毒性,说明溶血毒性在亚历山大藻中具有一定的普遍性,但各亚历山大藻藻株溶血毒性的大小与其所产麻痹性贝类毒素（Paralytic Shellfish Poisoning,PSP）的能力无直接关系;针对性地研究了一株典型PSP产毒甲藻——塔玛亚历山大藻（A．tamarense,ATHK株）的溶血毒性特点,该株亚历山大藻具有较强的溶血毒性,指数期单个藻细胞的溶血毒性大小约相当于4pg皂素的溶血能力,而且其溶血毒性的大小与藻的生长阶段和细胞密度都有一定关系：指数期的溶血毒性最大;藻细胞、细胞碎片、细胞内容物都有一定的溶血毒性,其中细胞碎片的毒性最大;研究还表明一种PSP标准品STX毒素并没有溶血毒性,进一步说明亚历山大藻产生的溶血毒性是其他非PSP物质造成的,这类溶血毒素对人类健康和生态环境的影响值得关注。     

对虾鳗弧菌卵黄抗体(IgY)的制备及其对人工感染的保护研究

以纯培养的鳗弧菌作为抗原,探讨对虾鳗弧菌(Vibrio anguillarum)卵黄抗体(IgY)的制备技术,以及IgY在对虾体内的代谢及对人工感染和自然感染弧菌病的保护作用。结果表明:鳗弧菌对蛋鸡有较好的免疫原性,产蛋鸡经免疫后,血清与卵黄中很快出现抗体,而且卵黄中的抗体水平要高于血清中的抗体水平。IgY对鳗弧菌的感染有可靠的保护作用,IgY经口服后很快到达直肠,继而血淋巴、肝胰脏中也出现抗体,并可持续12~24 h;投喂IgY的试验组对虾在7 d内的死亡率为15%,极显著地低于对照组对虾的同期死亡率(为60%)。     

螺旋藻多糖对肿瘤细胞生长及Hela细胞早期凋亡作用的实验研究

采用MTT法(四甲基偶氮唑盐比色法)研究了钝顶螺旋藻多糖(PSP)对Hela细胞及HepG2细胞生长的抑制作用。结果表明,随PSP浓度及培养时间的增加,肿瘤细胞存活率逐渐降低,抑制率逐渐增加,以PSP40 mg/L作用72 h最为显著。应用Annexin V/PI双染色流式细胞仪检测了早期Hela细胞凋亡,未经PSP处理的正常Hela细胞凋亡细胞极少,经PSP处理的细胞,凋亡细胞的百分比明显高于正常对照组,其作用随着剂量的增加和时间的延长而增强,具有量效关系和时效关系。结果说明PSP的抗肿瘤机制,除了诱导肿瘤细胞凋亡,还存在细胞毒性等其他机制,是多种机制共同作用的结果。     

深海热液区管状蠕虫Ridgeia piscesae β型半乳糖凝集素的克隆与功能研究

Lectins are sugar-specific binding proteins or glycoproteins that play important physiological roles in cellular recognition and regulation. And they are also valuable in medicine and pharmacy. Tubeworm is the representative species around the hydrothermal vent in the deep sea. They have developed unique mechanisms to adapt to the harsh environment. In this study, a 1 092 bp c DNA, designed as rpgal, was first cloned and characterized from the tubeworm Ridgeia piscesae. Sequence analysis showed that RPGAL had low homology with the known galectin. And it had two homologous carbohydrate-recognition domains, which is the characteristic of the tandem-repeat type galectins. The RPGAL was successfully recombinant expressed in Escherichia coli and purified. Analysis of biological activity revealed that RPGAL was metal ion independent and it could agglutinate all the vertebrate erythrocytes tested. It was stable at 10–50°C and p H 5–10. And the hemagglutinating activity of RPGAL was strongly inhibited by D-Lactose and lipopolysaccharide. Although RPGAL had no effect on the microorganisms tested, it showed anti-tumor activity towards He La cells and HT1080 cells, which was accomplished by apoptosis. The study demonstrated that RPGAL was a novel galectin and provided a potential candidate for therapy of anti-tumor.     

养殖石斑鱼溃疡病病原哈维氏弧菌胞外产物的研究

以网箱养殖的患溃疡病青石斑鱼(Epinephlus awoara)和斜带石斑鱼(Epinephlus co-ioides)分离的哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)TS-628菌株为研究对象,采用平板玻璃纸覆盖技术,获得该菌株的胞外产物(ECP),并对其成分进行分析。利用杯碟法研究表明,哈维氏弧菌TS-628菌株的胞外产物具有酪蛋白酶、明胶蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、卵磷脂酶等多种酶活性和溶血活性,且溶血性物质具有热不稳定性。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及考马斯亮蓝R-250染色分析表明,ECP蛋白条带主要集中在分子质量范围25.0~66.2 ku之间,经不同时间培养所获得的ECP在凝胶上显示出的蛋白条带几乎一致。采用复性电泳方法(G-PAGE)分析了哈维氏弧菌及其它4种弧菌属细菌的ECP蛋白酶活性,结果发现哈维氏弧菌ECP在酸性条件下,蛋白酶活性较强,在碱性条件下,蛋白酶带明显减少,活性很弱。在相同的pH条件下,5种弧菌中以副溶血弧菌的ECP蛋白酶活性最强,种类多,分子质量范围宽;而哈维氏弧菌的蛋白酶带较少,活性也稍弱。     

极大螺旋藻胞内多糖对体外肿瘤细胞抑制作用的实验研究

研究了极大螺旋藻(Spirulina maxima)胞内多糖对SMMC7721等肿瘤细胞系的生长及凋亡的影响。在体外培养条件下,用半抑制浓度(80,5 mg/L)的极大螺旋藻胞内多糖(IPSⅠ,IPSⅡ)处理肿瘤细胞,并用MTT,SRB,DNA ladder,AnnexinⅤ等方法测定。结果表明,IPSⅠ(80 mg/L)对SMMC7721,A549,HeLa,U251等肿瘤细胞系抑制率分别为64.97%、46.1%、43.3%、27.02%;IPSⅡ(5 mg/L)能诱导SMMC7721细胞凋亡。     

中国毛虾酶解多肽降压作用的初步探讨

初步探讨从中国毛虾(Acetes chinensis)经碱性及中性蛋白酶降解获得的多肽(AP、NP)的降压作用及相关机制。采用Cusllman-Cheung方法测定酶解多肽体外对血管紧张素酶(ACE)活性的影响;采用两肾一夹型建立肾血管性高血压大鼠模型,分别长期预防给药及急性治疗给药;应用GY-6088型多道生理参数分析记录仪和张力传感器测定、记录血压和呼吸;采用均相竞争法测定大鼠血浆中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的含量。结果表明,2种酶解多肽体外均能明显抑制ACE的活性,AP和NP的半数抑制浓度(IC50)分别为15．61mg/L和16．95mg/L;无论是长期预防给药还是急性治疗给药,二者均能显著地降低肾血管性高血压大鼠的动脉血压;经口服预防给药能明显降低高血压大鼠血浆中的AngⅡ水平：给药大鼠的呼吸频率随血压的变化呈正相关变化;碱性酶解多肽的降压作用及抑制ACE生成的作用均强于中性酶解多肽,其中,200μg/g的AP降压效果最好,与14μg/g的卡托普利相当。中国毛虾酶解多肽无论是长期预防给药还是急性治疗给药对肾性高血压大鼠均有显著的降压作用,抑制AngⅡ的生成可能是其降压机制之一。     

小球藻对不同盐度海水养殖尾水的净化效果研究

微藻处理养殖尾水已成为热点研究方向,有关一定盐度范围内海水养殖尾水的微藻处理研究较少。本试验调配了两种盐度(16和26)的海水养殖尾水,以空白组作对照,设置小球藻(Chlorella salina)初始接种密度梯度(5×10⁵、1×10⁶、2×10⁶和3×10⁶个/mL),研究小球藻对海水养殖尾水中不同形态氮和磷的去除效果。结果表明,小球藻在海水养殖尾水中生长良好,可有效去除尾水中的氮磷营养盐,16盐度组中各初始藻密度组对NH₄⁺、NO₃^-和总溶解态氮(total dissolved nitrogen,TDN)的去除率分别为85.03%~85.87%、60.87%~63.70%和54.53%~57.64%,组间无显著差异(P>0.05);26盐度组中除5×10⁵组外,其余藻密度组对NH₄⁺、NO₃^-和TDN的去除率分别为87.23%~88.16%、56.70%~57.79%和53.31%~54.62%,且组间无显著差异(P>0.05),表明小球藻初始接种密度对尾水中氮盐的去除无显著影响。除5×10⁵个/mL组外,16与26盐度组中对TDN的去除率无显著差异,表明盐度变化对氮的去除无影响。随着初始藻密度的升高,16和26处理组对总溶解态磷(total dissolved phosphorus,TDP)的去除率均上升,分别为76.13%~99.53%和63.72%~96.83%,表明藻初始接种密度的升高可促进尾水中磷的去除,且盐度升高没有影响小球藻对磷的去除。本研究获得了不同初始接种密度小球藻对一定盐度范围的海水养殖尾水的吸收利用特点,可为海水养殖尾水的生态化处理提供一定的理论基础。