大黄鱼(Larimichthys crocea)白细胞介素10(IL-10)基因克隆及溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)侵染后表达变化分析

白细胞介素10(interleukin10,IL-10)是鱼类先天性免疫因子之一,在炎症反应和免疫调节中有着重要作用。本研究获得大黄鱼(Larimichthys crocea)IL-10基因cDNA序列,由899个核苷酸组成,含1个555bp的开放阅读框、编码184个氨基酸,预测编码蛋白分子量为21.24kDa、N端有22个氨基酸组成的信号肽序列。氨基酸序列多重比对表明大黄鱼IL-10具有IL-10家族特征性序列和构成2对二硫键的4个保守性半胱氨酸,与欧洲鲈(Dicentrarchuslabrax)IL-10序列相似性最高(78.5%);系统进化树分析显示大黄鱼IL-10和其他鱼类IL-10形成一个大簇,与欧洲鲈进化关系最近。荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测结果显示健康大黄鱼IL-10基因在鳃和肠中高表达,肝和头肾中低表达;溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)侵染后大黄鱼肠、脑、脾、肝和头肾中IL-10基因表达量均显著上调(P0.05),其中头肾和肝中上调幅度最大(分别为菌侵染前的10.06倍和8.79倍)。综上,大黄鱼IL-10基因表达与病原菌感染密切相关,为深入研究大黄鱼IL-10的生物学功能及免疫机制提供了基础资料。     

大黄鱼EBI3基因的克隆与表达分析

通过克隆大黄鱼(Larimichthys crocea)的EBI3(Epstein-Barr virus-induced gene 3)基因并对其进行了序列分析.大黄鱼EBI3(Lyc EBI3)基因开放阅读框长747bp,编码248个氨基酸,存在1个信号肽序列和2个FN3结构域(37~130,145~230).多序列比对发现Lyc EBI3分子与其他已知EBI3氨基酸水平一致性为27.68%~57.53%.Real-time PCR结果表明,Lyc EBI3基因在脾脏和血液中表达量最高,且溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)刺激后,大黄鱼头肾和脾脏中Lyc EBI3基因的转录水平会显著升高,说明Lyc EBI3基因可能参与了抑制由细菌引起的炎症反应.     

大黄鱼IL-7-Rα基因的克隆与表达分析

白细胞介素7受体α链(IL-7Rα,CD127)是一个重要的多效性细胞因子受体.本研究克隆得到大黄鱼(Larimichthys crocea)的IL-7Rα(LycIL-7Rα),其开放阅读框全长1 242 bp,编码413个氨基酸.通过氨基酸序列分析和多序列比对发现,LycIL-7Rα多肽具有I型细胞因子受体的典型特征,包括4个保守的半胱氨酸、1个信号肽、1个单次跨膜结构域、1个胞外的fibronectin type III(FN IIIlike)结构域、1个Trp-Ser-X-Trp-Ser(WSXWS)基序以及胞内Box1结构域.系统进化分析表明,LycIL-7Rα与其他鱼类的IL-7Rα聚在一起,与鲈鱼(Lates calcarifer)IL-7Rα的亲缘关系最近.Realtime PCR结果表明,LycIL-7Rα在健康大黄鱼中为组成型表达,在脾脏中的表达量最高,在心脏中的表达量最低.大黄鱼经聚肌苷酸胞苷酸[Poly(I:C)]或溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)刺激后,其脾脏中LycIL-7Rα的mRNA转录水平均显著上调.这些结果表明LycIL-7Rα可能在大黄鱼免疫反应中发挥重要作用.     

大黄鱼肌肉生长抑制素基因原核表达及多克隆抗体的制备

肌肉生长抑制素抑制动物肌肉的生长发育.根据本实验室克隆的大黄鱼（Pseudosciaena cro-cea）肌肉生长抑制素（MSTN）基因编码序列设计引物,用RT-PCR扩增目的片段,构建MSTN-pET-28 a重组表达质粒,将其转化到大肠杆菌BL21上并用1.0 mmol/dm3IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳检测该目的蛋白大小约为44 kDa,与理论值大小符合.用0.25 mol/dm3KCl染色后从凝胶中切取该蛋白且回收.该回收蛋白与弗氏佐剂等量混合后注射ICR小鼠制备多克隆抗体,并用Westernblot检测该抗体.免疫印迹结果在44 kDa的位置上出现棕色条带,表明大黄鱼肌肉生长抑制素的多克隆抗体制备成功.这为今后对肌肉生长抑制素功能的研究奠定了基础.     

环境因子对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)粘附大黄鱼(Pseudosciaena crocea)表皮粘液影响的研究

采用3H-TdR同位素示踪方法研究了环境因子对溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液粘附作用的影响。试验结果表明,溶藻弧菌能很好地粘附于大黄鱼表皮粘液,其粘附量在菌浓度不超过6.52×108cfu/ml情况下随菌浓度的升高而升高;粘附量在25℃下孵育180min趋于饱和,在180min以内与孵育时间呈正相关关系;粘附作用在温度25—30℃、pH值偏酸、盐度35条件下较强;在无Na (盐度为0)时,无粘附作用;Ca2 能显著加强溶藻弧菌的粘附作用,而Mg2 作用不明显。这些结果表明,溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液有较强的粘附作用,其粘附作用受温度、盐度、pH值等环境因子的影响。     

Ficolin在毛蚶抗弧菌感染中的作用

Ficolin是一类含FBG结构域的蛋白,在动物免疫防御中发挥重要作用。无脊椎动物中,Ficolin主要作为模式识别受体和免疫效应分子发挥免疫功能。本研究从毛蚶中克隆获得一条Ficolin基因(命名为SsFic1),该基因编码区序列长度为897 bp,编码298个氨基酸,推测的蛋白含有典型的FBG结构域和Coiled coil结构域,但未发现胶原样结构域。SsFic1的mRNA在毛蚶各组织中广泛分布,其中在肝胰腺和鳃中表达丰度较高,但SsFic1转录产物在卵细胞和四细胞期未检测到,说明该基因不是母源性免疫基因。副溶血弧菌和脂多糖、葡聚糖等免疫刺激物均可诱导SsFic1显著上调表达。利用RNAi技术抑制SsFic1基因表达,酚氧化酶激活因子PAF和补体相关基因(C1qDC、补体C3和Fic3)的表达量及CAT、SOD和PO的酶活力均显著下降,而TEP、C1q2和Fic2等基因的表达显著上调。敲降SsFic1表达后,感染副溶血弧菌后毛蚶血细胞数量和吞噬能力均显著低于对照组,这也是RNAi实验组毛蚶死亡率和血细胞凋亡率显著升高的原因。综上,SsFic1可能通过调控补体通路和酚氧化酶原激活通路参与毛蚶免疫防御反应,这对贝类免疫学研究及抗病新品系的选育具有重要意义。     

许氏平鲉(Sebastes schlegelii)TRAF基因的鉴定及其响应杀鱼爱德华氏菌侵染的表达模式研究

TRAF是机体内一种具有信息传导作用的胞内因子, 承担多个受体家族的信号转导工作, 在固有免疫以及获得性免疫方面都发挥出重要作用。TRAF作为一类胞内接头蛋白, 对多条信号途径的活化具有一定的影响, 包括细胞的增殖、生存、凋亡、炎症反应、免疫反应等。目前已有研究表明鱼类中的TRAF基因也发挥重要的免疫防疫作用。以许氏平鲉为研究对象, 基于基因组和转录组的数据库, 进行了许氏平鲉TRAF基因家族的系统鉴定。在许氏平中共鉴定到9个TRAF基因, 并对这些TRAF基因的长度和氨基酸个数进行了统计分析。同时, 分析了这9个TRAF基因的结构特征。选取了包括许氏平鲉在内的6种鱼类进行了TRAF基因的共线性分析。结果显示, TRAF基因在硬骨鱼类中具有保守的共线性。通过系统发育分析, 更好地解析了TRAF家族基因的进化关系, 同时也证明了对其鉴定及命名的准确性。此外, 还进行了TRAF家族基因的蛋白质相互作用网络预测以及表达模式分析。通过蛋白质相互作用的网络分析, 得到TRAF基因与其互作蛋白的关联状况。在杀鱼爱德华氏菌侵染许氏平鲉后的不同时间点, 探究TRAF基因在杀鱼爱德华氏菌刺激下的表达模式。定量结果显示, 除TRAF4.1外, 其他TRAF基因在感染后均存在不同程度的上调。综上所述, 从分子水平上揭示了许氏平鲉TRAF家族基因的结构和功能, 揭示了TRAF可能依赖的免疫通路, 为进一步探究TRAF家族基因在许氏平先天免疫过程中的作用奠定了基础。     

大黄鱼(Larimichthys crocea)补体调节因子CFH 和 CFHR2 基因的分子特征及表达分析

补体是鱼类免疫系统重要的组分, 具有识别和消除外来病原体, 激活免疫细胞, 调控获得 性免疫等功能。在免疫组织中, 补体调节因子大约占据了补体成分的二分之一, 当受到外界病原刺激 时会迅速活化补体成分, 并且进一步聚合形成酶复合物发挥一系列免疫效应。CFH 和CFHR2 是补体 替代途径重要的调节因子, 对于补体系统正常运转必不可少。为此, 本文测定了大黄鱼补体调节因子 CFH 和CFHR2 基因的cDNA 全序列, 并对基因组织特异性表达和溶藻弧菌刺激后基因mRNA 表达 量的变化等方面进行了研究。CFH 和CFHR2 序列全长分别为1332 bp 和1170 bp, 分别编码443 和 389 个氨基酸, N 端信号肽序列分别为24 和32 个氨基酸。推导的氨基酸序列结构分析表明大黄鱼 CFH 和CFHR2 基因具有RCA 蛋白家族的典型特征, 即含有多个保守的CCP 结构(补体控制蛋白). 实时荧光定量PCR 结果显示, CFH 和CFHR2 在健康大黄鱼的肝、脾、肾、肠、脑、胃、心和肌肉 这8 种组织中都有表达, 其中肝脏的表达量显著高于其它几种组织。溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus) 侵染了健康的大黄鱼之后, CFH 和CFHR2 的mRNA 表达量均明显上调, 并且随着感染时间的变化呈 现不同的上升趋势。结果表明补体调节因子mRNA 表达量的变化与溶藻弧菌的侵染密切相关, 表明 了CFH 和CFHR2 可能在大黄鱼自身免疫机制中发挥重要的作用。     

栉孔扇贝Smad基因家族的表达特征和对鳗弧菌侵染的免疫应答分析

栉孔扇贝是我国海水养殖业的重要品种之一,但养殖扇贝陆续暴发大规模细菌性疾病,造成了巨大的经济损失。深入研究扇贝的免疫防御机制,是改良种质、培育抗病品系的必要措施。近年来研究发现,Smad基因可以通过调控增强子结合蛋白(CEBP/ε)来促进中性粒细胞的成熟和功能极化,在引发脊椎动物的先天免疫调节中发挥着重要的作用。然而目前对于Smad及其在免疫中的作用的研究大都集中于脊椎动物中,在海洋贝类中的研究还较为匮乏。因此,对栉孔扇贝的Smad基因家族进行了系统发生、共表达网络的构建、以及鳗弧菌侵染的免疫应答分析,以解析贝类Smad基因家族的表达调控机制和在免疫应答中的作用。结果表明,Smad3和Smad6可能在两侧对称动物的共同祖先中位于同一染色体上;栉孔扇贝Smad5与Toll样受体信号通路的关键基因协同表达;受鳗弧菌侵染后,血淋巴中的Smad5显著上调,说明Smad5基因可能通过与Toll样受体信号通路相互作用,参与了机体的免疫应答。研究结果可为深入研究贝类Smad基因在天然免疫系统中的作用提供重要参考。     

大黄鱼(Pseudosciaena crocea) leptin和cholecystokinin基因的克隆和表达特性研究

本文克隆了两种大黄鱼(Pseudosciaena crocea)摄食调控因子胆囊收缩素(CCK)、瘦素(LEP)基因的全长序列,并对其表达特性进行了研究。结果表明,克隆得到CCK基因属硬骨鱼类的CCK1亚家族,全长900nt,编码137个氨基酸,与其他鱼类的CCK1相比序列组成非常保守,特别是在20氨基酸的信号肽和8个氨基酸的CCK-8活性结构区域;而克隆得到LEP基因属硬骨鱼类的LEPA亚家族,全长1290nt,编码161个氨基酸,与其他鱼类LEP相比基因同源性较差,但在3D结构上却保留了LEP经典的4个α螺旋特征。两种因子在所检测的所有组织中均有表达,但尤以脑、胃、肠消化道、肝脏等摄食及能量平衡相关组织中表达活性最高。8天的饥饿能使大黄鱼脑、消化道组织的CCK和肝脏、脂肪组织中的LEP表达显著降低(P0.05)。该结果说明CCK和LEP可能在大黄鱼的摄食生理和能量平衡中起着重要的调控作用;本研究将为深入了解鱼类食欲调控的神经内分泌机理提供基础。     

大黄鱼(Larimichthys crocea)Tristetraprolin基因的克隆与功能分析

Tristetraprolin (TTP)是广泛存在于真核生物的RNA结合蛋白。TTP通过促进mRNA降解或抑制翻译在转录后水平抑制炎症因子表达,是炎症性疾病的潜在治疗靶点。采用RACE技术获取了大黄鱼(Larimichthys crocea) TTP (命名为LcTTP) cDNA的全长序列。LcTTP全长cDNA 1 508 bp,包括77 bp的5′-非编码区(5’-UTR)、183 bp的3’-UTR和1 248 bp的开放阅读框(ORF),编码418个氨基酸残基。推导的LcTTP理论分子量44 897.78 Da,预测等电点pI 8.37;哺乳动物TTP的重要功能结构域:N-端核输出序列(NES)、中央串联锌指结构域(TZF)、C-端NOT1-结合结构域(NOT1-BD)也在LcTTP中保守存在;系统发育分析显示LcTTP和其他脊椎动物TTP聚为一支,并与哺乳动物ZFP36家族其他成员ZFP36L1、ZFP36L2和ZFP36L3的进化支分离。组织表达特异性分析显示检测的9个组织均表达LcTTP mRNA,但不同组织间表达水平差异大,其中肌肉组织表达水平最高。大黄鱼头肾细胞系...     

大黄鱼(Larimichthys crocea)I型干扰素基因的特征与表达分析

采用RT-PCR和RACE-PCR技术克隆了大黄鱼(Larimichthys crocea)Ⅰ型干扰素基因全长cDNA序列及其基因组序列,并利用荧光定量PCR技术研究了该基因在大黄鱼不同组织中的表达谱,以及副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、LPS、polyI:C刺激后大黄鱼脾脏、肝脏和头肾组织中该基因在转录水平的表达变化。结果表明,大黄鱼Ⅰ型IFN基因全长cDNA为878bp,开放阅读框558bp,编码185个氨基酸。推测的大黄鱼Ⅰ型IFN氨基酸序列N端含有20个氨基酸的信号肽,其后包含一个保守的IFabd结构域。大黄鱼Ⅰ型IFN基因包含5个外显子,4个内含子,在大多数组织和细胞中都有表达,其中在血细胞中表达量最高,肌肉中表达量最低。PolyI:C刺激可诱导大黄鱼Ⅰ型干扰素基因在脾脏、头肾和肝脏中的表达量显著上调;LPS刺激可诱导大黄鱼Ⅰ型干扰素基因在脾脏和肝脏中的表达量显著上调;灭活的副溶血弧菌可诱导大黄鱼Ⅰ型干扰素基因在头肾和肝脏中的表达量显著上调。     

大黄鱼(Larimichthys crocea)补体C3和C4基因的分子特征及表达分析

本文测定了大黄鱼C3(L.c-C3)和C4(L.c-C4)基因的c DNA全序列。结果表明,L.c-C3和L.cC4序列全长分别为4962bp和5088bp,分别编码1653和1695个氨基酸,N端信号肽序列分别为23和19个氨基酸。推导的氨基酸序列结构分析表明大黄鱼C3和C4与已报道的补体C3、C4同样都具有在功能上比较重要的残基以及保守的硫酯区。分子进化分析表明,L.c-C3和L.c-C4分别与鮸鱼C3、C4的氨基酸同源性最高。实时荧光定量PCR结果显示,L.c-C3和L.c-C4在健康大黄鱼的肝脏、脾脏、肠、鳃、心脏、脑、肌肉和胃这8种组织中都有表达,其中肝脏的表达量最高。在大黄鱼胚胎不同发育时期(从2细胞期到初生仔鱼)中,L.c-C3在各个阶段没有明显的变化,而L.c-C4的表达量有明显升高。溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)侵染的大黄鱼肝脏和脾脏中,L.c-C3和L.c-C4的m RNA表达量均明显上调。该结果表明,大黄鱼肝组织C3和C4基因表达变化与溶藻弧菌的侵染密切相关,揭示了C3和C4在大黄鱼抗细菌免疫反应中具有重要的作用。     

蝉花菌质(Isaria cicadae)对大黄鱼(Larimichthys crocea)幼鱼生长、免疫和肠道菌群的影响

试验目的旨在研究蝉花菌质(Isaria cicadae)对大黄鱼(Larimichthys crocea)幼鱼生长性能、抗氧化和免疫、肠道组织形态以及肠道菌群等方面的影响,为大黄鱼绿色饲料添加剂的开发和利用提供参考。将初始体重为(16.50±1.10) g的大黄鱼幼鱼随机分成4组,对照组(IC0)不添加蝉花菌质,试验组分别添加1%(IC1)、3%(IC3)和5%(IC5)的蝉花菌质。试验结果表明:试验组的增重率(WGR)和特定生长率(SGR)显著高于对照组(P<0.05)。IC3与IC5组的肝体比(HSI)显著低于对照组(P<0.05),与IC1组差异不显著(P>0.05)。IC5组脏体比(VSI)显著低于对照组,但与其他试验组之间差异不显著(P<0.05)。肌肉和全鱼体成分各组之间差异不显著(P>0.05)。试验组肝脏过氧化氢酶(CAT)和血清溶菌酶(LZM)的活性显著高于对照组(P<0.05),各试验组间无显著性差异(P>0.05)。对照组单根绒毛杯状细胞数量显著少于各试验组(P<0.05),各试验组间无显著性差异(P>0.05...     

小黄鱼(Larimichthys polyactis)线粒体基因组结构与特征

采用长片段扩增策略,获得鲈形目石首鱼科黄鱼属小黄鱼的线粒体基因组全序列。组装分析结果表明,其长度为16470bp,H链碱基组成呈明显反G偏倚,G含量仅为16%。13个蛋白质基因起始密码子均为ATG。COI基因的终止密码子为AGA,ND1和ND3基因为TAG,COII、ND4和Cytb基因为不完全终止密码子T,其余7个基因都是完整的TAA。在小黄鱼mtDNA中发现2个特殊发夹结构,一个是轻链复制起始区(OL)的发夹环,位于tRNA簇,环区T含量仅为9%,而G含量达45%,这与哺乳动物和爪蟾该区域富含T有所不同。另一个假定发夹结构位于ATP6基因末端,这种二级结构可能与准确转录有关。该mtDNA控制区长度为799bp,5′端含有9个连续TA串联重复和2个5′-ATGTA---TACAT-3′重复,与已报道的鱼类扩展终止相关序列模式恰恰相反;中央控制区仅识别出CSB-E结构;保守序列区含有CSB-1,2,3,其中CSB-2具有高度保守性。对小黄鱼和大黄鱼的mtDNA比较进化研究,根据分子钟假说,估计二者线粒体基因组的进化分歧时间为4.8百万年前。     

MS-222对大黄鱼(Larimichthys crocea)麻醉保活运输效果研究

为优化大黄鱼(Larimichthyscrocea)麻醉运输技术,提高保活率,以不同浓度MS-222麻醉剂对其运输存活率、呼吸代谢、鱼体生理生化指标的影响展开研究。结果显示:(1) 12 h模拟运输后,10mg/L麻醉组大黄鱼存活率显著高于其他实验组(P<0.05),30mg/L麻醉组积累死亡率已高于50%;(2)呼吸频率随麻醉剂浓度的升高显著降低(P<0.05),各组水体溶解氧含量随运输时长增加均呈下降趋势;(3) 10和20 mg/L麻醉组大黄鱼复苏率分别为89%±10%和63%±19%,且均显著高于30 mg/L麻醉组(P<0.05);(4)随麻醉剂浓度的升高,大黄鱼血清中皮质醇、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸酶水平逐渐降低,其肌肉乳酸水平显著降低(P<0.05),其肌糖原水平显著升高(P<0.05)。结果表明:高浓度(30mg/L)MS-222处理会引起大黄鱼呼吸抑制,造成运输存活率下降,不适合应用于大黄鱼的保活运输;低浓度(10mg/L)MS-222处理可以达到降低鱼体拥挤胁迫、应激反应及呼吸代谢的效果,并可以有效降低大黄鱼死亡率,保活...     

大黄鱼(Larimichthys crocea)幼鱼同生群内不同增重性能子群间的形质差异

探究引起大黄鱼幼鱼同生群内不同增重性能子群间形质差异的内在逻辑,揭示造成各子群间生存适应对策分化的主因,对于精选大黄鱼优质增殖群体和指导大黄鱼幼鱼阶段的科学高效养殖具重要现实意义。随机捕捞宁波市象山西沪港海域内经板式网箱养殖3个月的3 000 ind.大黄鱼同生群幼鱼,按体质量由大到小依次分为A [体质量(3.446±0.428) g,出现率5%]、B [体质量(1.966±0.507) g,出现率90%]、C [体质量(0.738±0.036) g,出现率5%]三个增重性能子群。于每一子群内各随机选取30ind.作为生物学指标测定对象,在测量体质量、鳃质量、内脏质量、净体质量、体长、体宽、体高、肛长、头长、头宽、头高、眼后头长、眼径、鳃盖高、背鳍部体高、腹鳍间距、侧线长、尾柄长、尾柄高的基础上,依次采用聚类分析、主成分分析和判别分析方法,较系统开展了三个梯度增重性能子群间形质差异的研究。结果表明:(1)在所测19项生物学测定性状中,除尾柄高呈A>B≈C外,其余性状均呈A>B>C (P<0.05);(2)在所涉24项形质评价指标中, A-B、A-C、B-C子群间...