马氏珠母贝DNA甲基化转移酶Dnmt1的克隆及表达

【目的】对马氏珠母贝(Pinctada martensii)DNA甲基化转移酶1(DNA methyltransferase 1,Dnmt1)的基因全长及组织表达作分析,探究马氏珠母贝甲基转移酶Dnmt1(PmDnmt1)参与贝壳矿化调控机理。【方法】利用RACE技术获得PmDnmt1的c DNA序列全长,并对PmDnmt1的序列特征进行分析,同时利用逆转录-聚合酶链反应RT-PCR技术检测马氏珠母贝不同组织中PmDnmt1的表达情况。【结果与结论】PmDnmt1基因c DNA长4 818 bp,其中,开放阅读框为4 623 bp,编码1 540个氨基酸。预测分子质量约为174.55 ku、理论等电点为5.89。结构域分析显示,PmDnmt1具有DMAP结合结构域、DNMT1-RFD结构域、锌指结构、BAH结构域和C5胞嘧啶DNA甲基化酶结构域等。多序列比对结果发现,Dnmt1在不同物种间具有较高保守性。实时荧光定量PCR分析显示PmDnmt1在所有检测组织中均有表达,在外套膜中央膜部分的表达量最高(P 0.05)。PmDnmt1可通过调控外套膜的DNA甲基化修饰参与贝壳的形成。     

马氏珠母贝热休克蛋白HSP60基因的克隆与表达分析

运用cDNA末端快速扩增（RACE）技术,克隆马氏珠母贝（Pinctadamαrtensii）热休克蛋白HSP60基因 cDNA全序列。序列全长2495坤,开放阅读框（ORF） 1734坤,编码577个氨基酸,预测的分子量约为61.79阳, 理论等电点为5.4905＇非翻译区（ 5＇UTR）长150坤, 3＇非翻译区（3＇UTR）长611 bp。同源性比对分析结果,马 氏珠母贝HSP60基因与与太平洋长牡妨（Crωsos仰a gIgω）和光滑双蹄螺（Biomphalaria glabrata）的同源性较 高,达到75%。氨基酸序列分析显示,马氏珠母贝HSP60氨基酸序列具有典型的rnt-HSP60特征序列、C-末端典型的GGM重复基序和一个ATP结合结构域。荧光定量数据分析发现,该基因在闭壳肌、外套腹、血淋巴、肝膜腺、性腺、躁、等6个组织中具有表达,在肝膜腺中表达量最高,腮中次之,而在血液和闭壳肌中仅有少量表达;在脂多糖剌激后,该基因表达水平上调,12 h后达到最大值,之后又逐渐下调,均高于对照组,差异具统计学意 义（P〈0.05）。     

马氏珠母贝TRACP基因的克隆及组织表达

【目的】克隆马氏珠母贝(Pinctada martensii)抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase,TRACP)基因,分析该基因在不同组织中的表达模式。【方法】用RACE技术克隆得马氏珠母贝TRACP基因(PmTRACP),用实时荧光定量PCR分析该基因在外套膜、闭壳肌、足、性腺、珍珠囊、肝胰腺和鳃中的表达。【结果与结论】PmTRACP基因长度为2 034 bp,开放式阅读框972 bp,编码323个氨基酸,5′UTR长度为27 bp,3′UTR长度为1 035 bp。预测PmTRACP分子质量约为36.39 ku,理论等电点为5.97。该基因含有一个钙调神经磷酸酶样磷酸酯酶结构域。PmTRACP与其他物种TRACP的同源性为48%～65%,与长牡蛎(Crassostrea gigas)TRACP的同源性最高,同时D³²、D⁷⁰、Y⁷³、N¹⁰⁸、H²⁰³、H²¹²、H²³⁷、H²³⁹等8个氨基酸活性位点和N¹¹⁴糖基化位点在不同物种TRACP中高度保守。PmTRACP与长牡蛎TRACP的亲缘关系最近。PmTRACP在马氏珠母贝各个组织均有表达,且在肝胰腺和珍珠囊中高表达。     

马氏珠母贝PmLec-8基因的克隆与表达分析

Lec-8(C-type lectin 8)属于C-型凝集素超家族,在机体抵抗微生物的感染过程起重要的作用。本研究采用RACE技术克隆出了PmLec-8基因cDNA全长序列,并且运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测了PmLec-8基因在马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)不同组织中的表达模式。结果显示:PmLec-8基因序列全长737 bp,其中5′UTR长为36 bp,3′UTR长为113 bp,开放阅读框(ORF)为588 bp,编码195个氨基酸,预测其分子质量约为22.90 ku,等电点为5.17;PmLec-8具在一个糖类识别结构域(Carbonhydrate-recognition domain,CRD),符合典型的C型凝集素(C-type lectin)家族特征;多序列比对结果表明物种间Lec-8的同源性较低,4个半胱氨基酸残基高度保守;qRT-PCR数据分析表明,PmLec-8在马氏珠母贝肝胰腺、性腺、闭壳肌、鳃、血细胞和外套膜中均有表达,其中肝胰腺中表达量最高,其次是鳃,差异具统计学意义(P0.05)。     

马氏珠母贝载脂蛋白-2基因的克隆与表达分析

以RACE技术克隆获得马氏珠母贝载脂蛋白-2(Pm-ApoL2)基因cDNA全长序列,以传统萃取法提取黄色与白色闭壳肌个体的类胡萝卜素,以荧光定量技术检测Pm-ApoL2基因在各个组织中的表达量及黄与白闭壳肌个体的Pm-ApoL2表达量。结果表明,Pm-ApoL2基因cDNA序列全长1 328 bp,开放阅读框(ORF)长705 bp,编码234个氨基酸,5′非翻译区(5′UTR)长342 bp,3′UTR长281 bp。Pm-ApoL2在肝胰腺中表达量最高,其后依次是外套膜、鳃、闭壳肌,其中肝胰脏表达量显著大于其它3个组织(P0.05)。黄、白色闭壳肌个体之间的类胡萝卜素含量和Pm-ApoL2的表达量都存在显著性差异(P0.05),且二者的类胡萝卜素含量与Pm-ApoL2表达量呈显著正相关。Pm-ApoL2基因为马氏珠母贝类胡萝卜素代谢候选基因。     

马氏珠母贝B型清道夫受体PmSR-B基因克隆与表达性分析

采用c DNA末端快速扩增技术克隆获得马氏珠母贝清道夫受体基因c DNA全长序列(Pm SR-B);利用荧光定量技术检测Pm SR-B基因在各个组织中的表达量。结果表明,Pm SR-B基因c DNA序列全长1 857 bp,开放阅读框(ORF)长1 443 bp,编码480个氨基酸,5′非翻译区(5′UTR)长89 bp,3′UTR长325 bp。预测其分子质量为54.77 ku,等电点为7.94,脂溶性系数92.94,总平均亲水性-0.120,属于疏水性蛋白;不稳定指数26.37,属于稳定蛋白。氨基酸序列同源比对结果,Pm SR-B氨基酸序列与其他物种具有一定的保守性,与华贵类栉孔扇贝(Mimachlamys nobilis)SR-B的序列的相似度高达47%。荧光定量PCR检测结果,Pm SR-B在肝胰腺中表达量最高,其后依次是鳃、闭壳肌、中央膜,各组织的表达量差异具统计学意义(P0.05)。     

马氏珠母贝TRADD基因克隆与组织表达分析

【目的】克隆马氏珠母贝(Pinctada martensii)肿瘤坏死因子受体相关死亡域蛋白(TRADD)基因,并分析其在各组织中的表达。【方法】利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得马氏珠母贝PmTRADD基因的c DNA全长序列,利用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析PmTRADD基因在马氏珠母贝不同组织中的表达模式。【结果与结论】PmTRADD包含5′非编码区101 bp,3′非编码区144 bp和开放阅读框(ORF)591 bp,编码196个氨基酸。序列分析表明,PmTRADD没有信号肽和跨膜结构域,C端含有一个死亡结构域(DEATH)。将PmTRADD死亡结构域的氨基酸序列与其他物种的TRADD死亡结构域序列进行比对,发现不同物种的TRADD死亡结构域序列同源性较低。PmTRADD在马氏珠母贝各组织中均有不同程度表达,在鳃组织中表达最高,肝胰腺次之,闭壳肌中基本无表达。     

光合细菌在马氏珠母贝育苗中的应用

研究了光合细菌（下简称ＰＳＢ）作为饵料添加剂在马氏珠母贝育苗中的饵料效果。结果表明：（１）单独投喂ＰＳＢ,幼虫能生长发育并附着变态形成稚贝,但其长速,稚贝总育成率均低于单独投喂单胞藻的对照组;（２）用ＰＳＢ与单胞藻混合投喂,幼虫的长速,稚贝总育成率均高于对照组;（３）添加ＰＳＢ后,在眼点幼虫附着前不换水,幼虫的长速和眼点形成率均高于换水;但在眼点幼虫进入附着期仍不换水,则稚贝生长速度,总有成率均低     

马氏珠母贝Perlucin基因序列特征及其SNP与耐低温性状的关系

【目的】克隆马氏珠母贝（Pinctada fucata martensii）新的凝集素分子基因,命名为Perlucin,研究在低温胁迫下马氏珠母贝Perlucin的表达以及与抗低温性状相关的单核苷酸多态性（SNP）位点。【方法】根据马氏珠母贝基因组中Perlucin基因序列设计引物,克隆Perlucin基因全长;用生物信息学方法分析Perlucin的结构和理化特征;设计17和22℃（对照）2个温度组,对马氏珠母贝进行低温胁迫实验,用实时荧光定量PCR检测低温胁迫下Perlucin表达量的变化;筛选和比较分析马氏珠母贝耐低温选育系（R）F3和北部湾野生群体（W）的Perlucin外显子区的SNP位点和单倍型。【结果】马氏珠母贝Perlucin全长631 bp,编码152个氨基酸;包含1个信号肽和1个C型凝集素结构域。同源分析表明,马氏珠母贝Perlucin与紫贻贝（Mytilus galloprovincialis）Perlucin的亲缘性最近。Perlucin在鳃中表达量最高,其次为足和肝胰腺。低温胁迫时,鳃组织中Perlucin基因在17℃低温组的表达量呈先升高后降低的趋势,在12 ...     

马氏珠母贝Su(H)基因克隆与组织特异性表达

Su(H)基因(Suppressor of Hairless gene)对生物体细胞的分化、增殖和凋亡起重要的调控作用。根据马氏珠母贝(Pinctada martensii)转录组数据库中注释为Su(H)的unigene序列设计基因特异性引物,应用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得了马氏珠母贝Su(H)[pm-Su(H)]基因cDNA全长序列。结果表明:pm-Su(H)基因全长3 830 bp,其中开放阅读框含有1 920 bp,编码640个氨基酸残基,5'UTR为1 568bp,3'UTR为342 bp,含有27 bp polyA;预测其分子质量为70.6 ku,等电点为7.38;多序列比对显示,pm-Su(H)与其他物种的Su(H)有较高的保守性,与牡蛎(Crassostrea gigas)的同源序列高达80%;荧光定量PCR分析表明,pm-Su(H)在马氏珠母贝闭壳肌、鳃、珍珠囊、外套膜、肝胰脏、性腺、足、血淋巴等8组织中均有表达,其中以性腺中表达量最高,其次是珍珠囊和外套膜。     

马氏珠母贝贝壳基质蛋白基因Pm-PNU7的克隆和功能研究

【目的】研究马氏珠母贝(Pinctada martensii)贝壳基质蛋白(Shell Matrix Proteins, SMPs)基因(Pm-PNU7)表达与功能。【方法】利用马氏珠母贝基因组和蛋白质组信息分析和RACE技术克隆获得壳基质蛋白新基因Pm-PNU7全长序列,通过原位杂交对其进行定位,RNA干扰检测其对贝壳形成的影响。【结果】Pm-PNU7的cDNA全长为797 bp,编码145个氨基酸,具有特殊的"KGG"重复序列和富含天冬氨酸(Asp)序列"DDDDDDHDD"。qRT-PCR分析表明,Pm-PNU7基因在外套膜边缘区和套膜区显著高表达(P<0.05);ISH检测显示,Pm-PNU7主要定位于边缘区外褶外侧和内侧上皮细胞、中褶内侧上皮细胞以及套膜区外侧上皮细胞。RNA干扰后,Pm-PNU7在外套膜边缘区和套膜区的表达量均显著下调,贝壳棱柱层和珍珠层微观结构均出现不同程度的紊乱。【结论】Pm-PNU7参与了贝壳棱柱层和珍珠层的形成。     

合浦珠母贝两个种群染色体组型的分析

以北部湾和大亚湾两个地域的野生合浦珠母贝种群为研究对象，采用成贝的鳃组织，经空气干燥法制片进行染色体组型分析。结果表明两地种群的核型公式都为2N=28=16m+6sm+4st+2t，NF=50，但在染色体排序方面表现出较明显的群体差异。并与以往研究报道相比较，分析了不同的实验结果及可能产生差异的原因。     

合浦珠母贝丝氨酸蛋白酶抑制因子基因pfser1克隆与表达

【目的】克隆合浦珠母贝(Pinctada fucata)丝氨酸蛋白酶抑制因子pfser1基因,探讨该基因的组织表达及其在天然免疫过程中的作用,以及与生物矿化过程的关系。【方法】通过RACE技术获得pfser1基因的全长,通过生物信息学分析其序列结构特征,利用实时荧光定量PCR方法检测pfser1基因在不同组织中的表达,检测健康合浦珠母贝在被大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655刺激后和在贝壳损伤修复实验中pfser1基因表达量的变化。【结果】合浦珠母贝pfser1基因cDNA全长为1240 bp,包含1035 bp的开放阅读框(ORF),编码344个氨基酸,氨基酸序列的功能结构域含有丝氨酸蛋白酶抑制因子Serpin家族保守结构域。pfser1基因在合浦珠母贝各个组织中均有表达,在外套膜边缘膜中表达量最高;大肠杆菌MG1655刺激后,该基因表达量显著升高;在贝壳损伤修复过程中,pfser1基因表达先升高后受到抑制。【结论】pfser1基因所表达的蛋白参与了合浦珠母贝的天然免疫应答过程,并与生物矿化过程有一定关系。     

珠母贝糖胺聚糖胶囊制备与检测

以马氏珠母贝糖胺聚糖粗品为主要功能成分,以β-环糊精为辅料,制成珠母贝糖胺聚糖胶囊,并进行检测。结果表明:该胶囊中水分、总糖、糖胺聚糖(GAG)和粗蛋白质量分数分别为8.85%、85.23%、3.00%和3.60%;胶囊的装量差异与崩解时限均符合质量标准;胶囊制剂中细菌总数小于1000 g-1,大肠杆菌MPN小于30 g-1,霉菌和酵母菌总数小于25 g-1,符合《保健食品通用卫生要求》规定;致病菌均未检出。     

不同温度下马氏珠母贝干露耐受能力及其免疫相关基因表达的变化

【目的】探究马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)对干露胁迫的响应,为马氏珠母贝健康养殖和遗传育种提供基础资料。【方法】在不同温度下对马氏珠母贝进行干露胁迫,探究温度对马氏珠母贝干露耐受的影响;筛选出马氏珠母贝干露胁迫敏感组和耐受组,比较两组的免疫相关基因表达量和植核后休养期存活率。【结果】(1)22~34℃条件下,马氏珠母贝干露耐受能力随温度升高及干露时间延长而降低;(2)22℃下,S组和T组的脯氨酸羟化酶(PHD)、葡萄糖转运蛋白(GLUT)、髓样分化因子(MYD88)、热休克蛋白(Hsp70、Hsp20)和凋亡抑制因子(cIAP)6个基因在干露过程中表达量基本呈上升趋势,组间差异显著(P<0.05);(3)植核试验结果表明耐受组植核后休养期的存活率显著高于敏感组(P<0.05)。【结论】马氏珠母贝在高温环境下干露耐受能力降低,在适温条件下耐受组比敏感组表现出较高的存活率。