罗湖病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

【目的】建立一种快速、灵敏、特异的罗非鱼(Oreochromis spp)罗湖病毒定量检测方法。【方法】根据罗湖病毒节段8保守区设计一对特异性引物,建立检测罗湖病毒的SYBRGreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行了评价。【结果】标准曲线在2.5×10~8～2.5×10~0拷贝数之间有良好的线性关系(相关系数R~2=0.999),检测限为2.5×10~0个拷贝。试验内及试验间变异系数分别为0.11%～0.43%与0.54%～1.13%,重复性强;对水生动物其他病毒和细菌均无扩增反应,有很好的特异性。【结论】新建立的罗湖病毒实时荧光定量PCR检测方法特异性好、灵敏度高、重复性强,可用于TiLV的早期的快速诊断、流行病学调查和防控。     

凡纳滨对虾野田村病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立快速检测凡纳滨对虾野田村病毒的RT-PCR方法。【方法】根据GenBank中获得的凡纳滨对虾野田村病毒的基因序列,应用Oligo6.0软件设计合成1对特异性扩增引物,对反应条件和反应体系进行优化,建立快速检测凡纳滨对虾野田村病毒的RT-PCR方法。用该方法对感染野田村病毒的凡纳滨对虾进行RT-PCR检测。【结果】RT-PCR可扩增出与设计相符的413 bp的特异性目的条带,而对白斑症病毒(WSSV)阳性虾、对虾杆状病毒(BP)阳性虾、传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)阳性虾、肝胰腺细小病毒(HPV)阳性虾、黄头病毒(YHV)阳性虾、传染性肌肉坏死病毒(IMNV)阳性虾、桃拉病毒(TSV)阳性虾和健康虾的扩增结果均为阴性。测序比对结果表明,该方法检测结果准确,最低可检测出约100 fg/mL的野田村病毒重组质粒DNA;用该方法对从福建、广东、海南、广西、江苏、浙江、山东等地的386份临床样品进行RT-PCR检测,共检出野田村病毒阳性样品64份。【结论】该方法可用于凡纳滨对虾野田村病毒的快速检测。     

哈维氏弧菌可视化LAMP快速检测方法的建立及应用

【目的】为加强对哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）的早期快速诊断和筛查,探究一种快速检测方法。【方法】以哈维氏弧菌外膜通道蛋白基因Toic为靶基因,以钙黄绿素为检测结果指示剂,通过对反应体系、反应时间和温度进行优化,并检测其特异性和灵敏度,建立一种针对哈维氏弧菌的可视化环介导等温基因扩增（LAMP）检测方法。【结果】该方法的检测时间最快为35 min,灵敏度为100 fg/mL,特异性强,与8种弧菌及金黄色葡萄球菌均无交叉反应。实用性检测结果显示,该方法可准确并特异性地检测到鱼体组织中感染的哈维氏弧菌。【结论】建立一种设备简单、操作简单、反应快速、特异性强、灵敏度高、结果可视化的哈维氏弧菌LAMP快速检测方法,且适用于石斑鱼（Epinephelus）感染哈维氏弧菌的早期快速诊断,为进一步推广该技术在石斑鱼及其他水生动物哈维氏弧菌感染监测中的现场大规模应用提供技术支撑。     

罗非鱼下脚料自溶条件的初步探讨

采用单因素和正交优化实验19（43）确定酶法自溶罗非鱼下脚料的最适条件，结果表明，最适自溶条件为：料液质量比1：3，反应温度50％，pH7．5，反应时间6．5h；酶解结束蛋白质回收率为81．75％。     

罗非鱼下脚料自溶条件的初步探讨

采用单因素和正交优化实验L9(43)确定酶法自溶罗非鱼下脚料的最适条件,结果表明,最适自溶条件为:料液质量比1∶3,反应温度50℃,pH7.5,反应时间6.5h;酶解结束蛋白质回收率为81.75%。     

罗非鱼开口饵料的初步研究

研究了配合饵料、轮虫、蛋黄、轮虫+人工配合饵料(3～12日龄投喂轮虫,13日龄起投喂配合饵料)等4种开口饵料对奥尼罗非鱼仔鱼生长、发育和存活影响。结果表明,1)投喂不同饵料对奥尼罗非鱼仔鱼生长具有显著影响(P<0.05),轮虫+配合饵料组生长较快,绝对增重率和特定增重率分别为0.011g/d和17.18%d-1;蛋黄组生长最慢,绝对增重率和特定增重率与其他各组差异显著(P<0.05)。2)轮虫+配合饵料与轮虫组的仔鱼成活率较高,分别为90.3%和89.7%,2组差异不显著(P>0.05),且仔鱼发育较好,大部分个体进入稚鱼阶段;蛋黄组成活率最低,只有40.7%,个体发育较为缓慢,与其他各组差异显著(P<0.05)。可见,投喂鲜活的天然饵料(轮虫)+配合饵料是罗非鱼苗种培育的最佳开口饵料。     

鱼类类立克次氏体PCR检测方法的建立及初步应用

根据Gen Bank中类立克次氏体基因的保守序列,设计一对针对鱼类类立克次氏体PCR检测的特异性通用引物,通过对PCR扩增条件的优化,建立快速检测鱼类类立克次氏体的PCR方法,并用该方法对类立克次氏体阳性罗非鱼(Oreochromis nilotica)进行PCR扩增,结果得到与实验设计相符的390 bp的特异性扩增条带,而对健康罗非鱼、乌鳢(Ophiocephalus argus)、海鲈(Dicentrarchus labrax)、中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)及其他对照组的扩增结果为阴性。测序比对结果证实,该PCR方法检测结果准确,最低可检测出约1 pg的类立克次氏体质粒DNA;利用建立的PCR方法,对来自广东、云南、海南、天津、江苏、安徽、湖北等地的252份临床样品进行检测,共检出阳性样品30份,提示该PCR方法可用于类立克次氏体的临床快速检测。     

凡纳滨对虾对虾杆状病毒PCR检测方法的建立及初步应用

根据Gen Bank中公布的对虾杆状病毒(Baculovirus penaei,BP)基因片段序列,设计1对特异性检测引物,建立快速检测凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)对虾杆状病毒的PCR方法。用该方法对BP阳性虾进行PCR扩增,结果得到380 bp的特异性扩增条带,与实验设计相符,而对白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉病毒(TSV)、传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)阳性虾和健康虾的扩增结果为阴性。测序比对结果证实,该PCR方法检测结果准确,最低可检测出约1 pg的病毒DNA。利用建立的PCR方法对来自广东、广西、福建、海南和浙江的2 722份临床病料进行检测,共检出阳性病料133份,表明该PCR方法可用于对虾杆状病毒的临床快速检测。     

奥尼罗非鱼杂交子代及亲本mtDNA D-loop基因序列的多态性

利用PCR技术扩增奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)、尼罗罗非鱼(O.niloticus)及其杂交子代(O.aureus♂×O.niloticus♀)3个群体mtDNA控制区全序列,分析其变异和遗传结构。结果显示:3个群体的mtDNA控制区序列长度多态性并不十分明显,全长921～933bp;3个群体间存在丰富的DNA序列多态性,共检测到138个变异位点(14.9%),44个个体具有44种单倍型(haplotype);3群体间的序列差异平均为4%,Tamura-Nei遗传距离平均为5.1%;采用NJ法和ME法构建的分子系统树中,奥利亚罗非鱼群体内所有的单倍型聚成一支,尼罗罗非鱼与其杂交子代的单倍型混杂在一起,聚成一支,表明杂交后代mtDNAD-loop表现为母系遗传。     

硝化细菌对罗非鱼苗培育环境及抗病力的影响

于罗非鱼鱼苗培育水体中引入不同浓度的硝化细菌,检测主要水质因子,测定罗非鱼与抗病力有关的酶的活力,研究微生态调控对水质和对罗非鱼抗病力的影响。结果显示,硝化细菌浓度为100/L时,氨氮含量相对于对照组降低25.05%,亚硝酸氮含量降低45.16%,COD值降低12.33%,差异显著(P<0.05);鱼苗培育成活率相对于对照组高7.58%,体长增加22.18%,体重增加46.15%;幼鱼的抗菌酶、碱性磷酸酶(AKP)和超氧化物歧化酶(SOD)活力相对于对照组分别提高18.60%、59.19%和49.89%,差异显著(P<0.05),组织过氧化物酶(POD)活力差异不显著。表明不同浓度的硝化细菌可显著改善罗非鱼苗培育环境的水质,增强罗非鱼苗的抗病力。     

罗非鱼成鱼半封闭围隔池近临界低温越冬技术

在4.9hm2养殖池的一角围成面积0.13hm2的小塘,形成半封闭围隔池,内设投饵台,灌注21～23℃的地下水,维持围隔中水温在13～16℃,研究吉富罗非鱼成鱼低温越冬技术。结果表明,罗非鱼越冬成活率98%,未出现罗非鱼的低温损伤,溶氧从5.8mg/L降为3.2mg/L、透明度从50cm降为35cm、总氨氮低于0.3mg/L、亚硝酸氮低于0.5mg/L,COD低于23.6mg/L,水质良好。在同样气温条件下,大棚越冬对照池保持水温15～16℃,罗非鱼存活率95%,溶氧从5.8mg/L降为1.2mg/L、透明度35cm降为25cm、总氨氮0.9mg/L升为2.3mg/L、亚硝酸氮0.6mg/L升为2.5mg/L,COD为43.6mg/L,水质变差。半封闭围隔池可保持水温在罗非鱼的近临界伤害温度13℃或13℃以上,罗非鱼成鱼在野外不搭棚能安全越冬。     

2011年洪湖和梁子湖受旱程度差异和成因分析

湿地是水陆交错的生态系统,往往受旱灾影响大,故此,对不同湖泊湿地受旱程度差异及其原因分析,可为减灾和湿地保护提供科学依据。本文利用2010年5月和2011年5月2个时相的HJ-1卫星CCD影像,提取洪湖和梁子湖2个时相的湿地水面积,结合统计资料和问卷调查数据,从湿地水面积及空间分布变化、湿地生态系统功能退化、湿地生态系统,对人类福祉影响3方面,分析了两湖湿地受旱程度的差异。并综合气象数据、统计资料和问卷调查数据,从气象因子、区域自然地理环境、湿地类型及特点、区域水文条件和湿地受保护程度5方面探讨两湖受旱程度差异的原因。结果表明：（1）2011年春旱期间,洪湖比梁子湖受旱程度更严重。旱灾时,洪湖水面积减少83.93 km2,减小比例为26%,梁子湖水面积减少13.02 km2,减小比例为4%;两湖的涵养水源、保护生物多样性、物质生产和水质净化功能均受到损害,洪湖较梁子湖更严重;受旱灾影响,洪湖湿地对人类福祉的消极影响大于梁子湖。（2）降雨量、气温和风速等气象因素、湖泊湿地成因类型、区域自然地理环境和水文条件是影响两湖受旱程度差异的主要因素,另外,湿地保护措施的差异及效果也会造成两湖受旱程度不同。     

Application of MODIS data in monitoring suspended sediment of Taihu Lake,China

Application of MODIS in ocean color is mainly based on bands 8-16 with the spatial resolution of 1 000 m.This spatial resolution,however,can not meet the application demand of inland waters where the areas are relatively small.With the assumption of the black water at shortwave infrared(SWIR) wavelengths(>1 000 nm),we first propose an atmospheric correction method for bands 1 and 2 with their spatial resolution of 250 m,and we then establish a quantitative retrieval model for suspended sediment concentratio...     

不同饲料蛋白水平下L-肉碱对新吉富品系尼罗罗非鱼生长和饲料利用的影响

研究了三个蛋白水平(22%、25%、28%)和五个L-肉碱水平(0、200、400、600、800mg/kg)下尼罗罗非鱼生长和饲料利用率。结果表明,随着饲料中蛋白水平的提高,罗非鱼幼鱼的终体重、增重率(WGR)和特定生长率(SGR)呈上升趋势,而饲料系数(FCR)和蛋白质效率(PER)均随饲料蛋白水平的升高而显著下降(P<0.05);同等蛋白水平下,终体重、WGR和SGR均在L-肉碱添加量为200mg/kg时最高,不添加L-肉碱组最小;在添加400mg/kgL-肉碱时FCR最小,而PER最大,与不添加L-肉碱组比较,差异均显著(P<0.05)。说明饲料中蛋白含量和L-肉碱添加量能显著影响罗非鱼幼鱼的生长和饲料利用,而外源性L-肉碱可明显促进罗非鱼生长,提高饲料转化效率。     

鄱阳湖水动力形态结构模式的模拟系统设计与应用

在一般的水动力模拟中,人湖河口的数量和位置基本是不变的.都阳湖水位高动态变化的特征,导致了人湖河口数量和位置变化等特殊的运动边界问题.本文在分析水动力模拟的湖泊形态结构特征的基础上,概化了高水位湖相型、中水位涨水型、中水位退水型和低水位河相型4种水动力形态结构模式,以解决高水位变幅导致的边界移动、人湖河口数量和位置变化...     

凡纳滨对虾肠道上皮细胞微胞子虫PCR检测方法的建立与应用

根据Gen Bank中对虾肠道上皮细胞微胞子虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)的基因保守序列,设计一对特异性引物,通过优化PCR扩增条件,建立快速检测凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)EHP的PCR方法。用该方法对EHP阳性虾进行PCR扩增,得到与实验设计相符的330 bp特异性扩增条带,而对白斑综合症病毒(WSSV)、桃拉病毒(TSV)、传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)、对虾杆状病毒(BP)、"棉花虾"微孢子虫、黏孢子虫的阳性虾,以及健康虾的扩增结果为阴性。测序比对发现,PCR产物序列与Gen Bank EHP基因序列的同源性为99.8%,表明该PCR方法检测结果准确。敏感性试验表明,该方法最低可检测出约100 fg的EHP质粒DNA。用该PCR方法检测广东、广西、江苏、山东、海南等地的755份临床样品,共检出阳性样品21份。该PCR方法可用于凡纳滨对虾EHP的快速检测。