小黄鱼(Larimichthys polyactis)精子的生理特性及超低温冷冻保存研究

为了解养殖小黄鱼精子的生理特性及超低温冷冻保存效果,用计算机辅助精子分析系统(CASA)检测了小黄鱼精子的运动参数及盐度、pH、葡萄糖、离子等环境因子的变化对其精子活力的影响;探究了稀释液、抗冻剂、稀释比及降温高度等对精子冷冻保存效果的影响。结果显示:小黄鱼精液的精子密度为(6.92±1.20)×109/mL。精子经自然海水激活后,运动率、运动时间及寿命分别为(59.31±4.85)%、8.44±0.87min及12.20±0.50min,直线运动速率(VSL)、曲线运动速率(VCL)及平均路径运动速率(VAP)分别为11.96±5.21、25.38±7.19和22.33±6.88μm/s。精子运动适宜的盐度范围为25—30、适宜的pH范围为7.5—8.5,精子在盐度25或pH8.0的海水中活力较好。精子激活效果较好的葡萄糖浓度为0.7—0.9mol/L;浓度0.9mol/L时,精子活力较好。精子激活效果较好的KCl、NaCl、MgCl2及CaCl2溶液浓度分别为0.4—0.5、0.4—0.6、0.7—1.0和0.2—0.3mol/L;精子在KCl及CaCl2溶液中活力相对较差,运动率等参数显著低于对照组;精子在不同人工海水中的运动率显著低于自然海水中的运动率,但精子在单一离子缺陷型人工海水及全人工海水中的运动率无显著差异。以0.25mL麦细管为冻存管, 6种稀释液、不同浓度的4种抗冻剂、5种稀释比及5种降温高度对小黄鱼精子冷冻保存效果的影响试验发现,以HBSS液1︰3稀释精液,添加10%DMSO及15%PG为抗冻剂,液氮面上3.5cm处降温5min后投入液氮中保存效果较好,冻精解冻后运动率达(43.57±2.59)%及(43.06±6.77)%。     

花鲈精子生理特性及其精液超低温冷冻保存

以精子的活率、寿命和运动状态为参数,探讨了花鲈鲜精在不同盐度、酸碱度和离体条件下的生理特性,并对花鲈精液进行超低温冷冻保存研究.结果表明:盐度和酸碱度主要影响精子的寿命,对精子的活率影响不大;精子离休后置于室温(15～17℃)下8h,其活率和寿命随时间的延长而呈下降趋势,运动状态也逐渐减弱;不同组成成分的基础溶液以及抗冻保护剂的种类、浓度和使用方法均影响精液超低温冷冻保存效果;精液冷冻前经30min降温平衡(0～2℃),效果好于直接冷冻;冻精采用水浴快速解冻法(38～40℃)的效果优于室温(15.5～17.5℃)解冻法.     

鱼类精子冷冻保存的研究进展

1 研究意义及应用前景 鱼类精子长期冷冻保存的研究和探索,不仅对进一步理解基本的生命进程具有重要意义,而且对鱼类新品种培育和鱼类养殖业也将产生巨大的深远影响。众所周知,由于低温能抑制生物体内的生化反应,因而在长期保存时不发生变异,而且不需要复杂的温度和湿度调节。鱼类精子超低温冷冻保存的研究,对     

保存和激活对真鲷精子生理特性的影响

就真鲷的新鲜精子和冷阈保藏精子的活力特性及对环境变化的适应进行了研究。结果表明,真鲷精子在普通冰箱的冷冻室中能存活１２０ｈ以上;淡水对真鲷精子具有可逆的抑制作用;液氮保存使精子对ｐＨ值和盐度变化的适应性更强。     

不同温度保存对黑鲷精子生理特性的影响

分别采用室温（２１℃左右）低温（３－５℃,冰箱）和超低温（－１９６℃,液氮）保存黑鲷Ｓｐａｒｎｓｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌｕｓ（Ｂａｓｉｌｅｗｓｋｙ）精子,探讨不同温度保存在黑鲷精子生理特性的影响,在室温条件下,黑鲷精子活力随保存时间的延长而下降,保存４ｈ后的精子失去激烈运动的能力,在低温条件下,黑鲷精子寿命有所延长,黑鲷精子经过超低温保存后,其激活率,受精率与鲜精的接近,精子活力则有所下降,黑鲷新鲜     

不同温度保存对黑鲷精子生理特性的影响

分别采用室温(21℃左右)、低温(3—5℃,冰箱)和超低温(-196℃,液氮)保存黑鲷Sparusmacrocephalus(Basilewsky)精子,探讨不同温度保存对黑鲷精子生理特性的影响。在室温条件下,黑鲷精子活力随保存时间的延长而下降,保存4h后的精子失去激烈运动的能力。在低温条件下,黑鲷精子寿命有所延长。黑鲷精子经过超低温保存后,其激活率、受精率与鲜精的接近,精子活力则有所下降。黑鲷新鲜精子在海水盐度为10时能被激活,但经过超低温保存后的黑鲷精子激活所需的最低盐度必需在10以上。     

保存和激活对真鲷精子生理特性的影响

就真鲷Pagrosomusmajor的新鲜精子和冷冻保藏精子的活力特性及对环境变化的适应进行了研究。结果表明,真鲷精子在普通冰箱的冷冻室（-15℃）中能存活120h以上;淡水对真鲷精子具有可逆的抑制作用;液氮保存使精子对pH值和盐度变化的适应性更强。     

点带石斑鱼精子超低温冷冻保存研究

为建立点带石斑鱼(Epinephelus malabaricus)精子冷冻保存技术,保存点带石斑鱼种质资源,作者通过选用TS-19、TS-2、Hank’s、MPRS、Cortland、0.75%NaCl等作为稀释液及10%~25%二甲亚砜、甘油、甲醇作为抗冻液,对繁殖季节中3个不同时期的点带石斑鱼精液进行超低温冷冻保存研究。研究结果表明:(1)Hank’s溶液为点带石斑鱼精子冷冻保存最适冷冻稀释液;(2)Hank’s溶液与10%~15%DMSO溶液为点带石斑鱼精子保存的最适冷冻保护液组合,可以获得60%以上的冻精成活率,而使用不同浓度的MeOH作为抗冻液时,冻精成活率均为0%;(3)以10%~25%Gly作为抗冻液时,冷冻前未加天然海水时均能激活点带石斑鱼精子正常运动,其效果与天然海水相似,加入天然海水后精子运动效果急剧下降,精子冷冻保存后也存在同样现象;(4)为保证获得更高的冻精成活率,点带石斑鱼精液冷冻保存样品的最佳获取时期是在亲鱼自然繁殖期前进行为宜。     

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)精子冷冻前后的活力及超微结构变化

采用两步降温法超低温冷冻保存大黄鱼精子,并用透射电镜技术研究了精子的超微结构损伤.结果表明,大黄鱼冻精的激活率、运动时间及寿命与鲜精相比无显著差异.鲜精中28.5％的精子形态结构异常,冻精中37％的精子形态结构异常.形态结构正常的精子表现为质膜与核膜结构完整、无膨胀现象,袖套、轴丝及中心粒结构正常,线粒体形态完整、嵴较发达;形态结构异常的精子表现为质膜破裂、脱落,质膜膨胀,核膜破裂、脱落,核局部受损伤,线粒体膨胀、嵴退化或消失,线粒体移位或脱落.结果显示,以Cortland溶液为稀释液,10％ DMSO为抗冻剂,对大黄鱼精子具有较好的抗冻保护作用.     

超低温保存后大菱鲆(Scophthalmus maximus)精子的生理活性及其超微结构研究

采用计算机辅助分析和电子显微镜方法, 对大菱鲆(Scophthalmus maximus)精子生理活性(运动率、运动速度和寿命)和超微结构进行观察, 研究其精子经超低温保存后质量变化情况, 得到了新鲜精子的路径速度[(101.91±9.30)?m/s]、运动率(88.30%±2.62%)和寿命[(368.00±111.50)h], 以及冷冻精子的路径速度[(76.78±8.49)?m/s]、运动率(65.60%±4.76%)和寿命[(120.00±12.00)h]。结果表明, 新鲜精子的生理特性好于冷冻精子。同时通过电镜去进行超微结构分析, 发现大菱鲆精子经过超低温保存后, 40%—60%的精子基本保持正常的形态结构, 其余精子遭受不同程度的机械损伤。其中膜损伤为主要损伤, 损伤精子中60%—70%带有膜损伤。推测大菱鲆精子在冷冻解冻过程中遭受到的机械损伤可能是导致冻精生理活性显著下降的主要原因。     

官井洋大黄鱼标志放流技术与放流标志鱼早期生态习性的初步研究

用人工培育的大黄鱼幼鱼，经丁香酚溶液浸浴麻醉，体背系挂塑料牌，经 网箱暂养后于１９８７年１月２０日在官井洋中放流６ １２６尾。２个月内回捕４８３尾。 通过对回捕鱼及其捕捞实况调查，并结合定置网渔获物中天然大黄鱼及海区温盐 断面调查，对放流标志鱼早期的生态习性进行了初步研究。     

太平洋鳕(Gadus macrocephalus)精液超低温冷冻方法的建立及精子超微结构分析

采用分步降温法冷冻保存太平洋鳕(Gadus macrocephalus)精液,并用扫描电镜和透射电镜技术研究了精子的超微结构损伤。分析了添加剂(蛋黄)及五种抗冻剂(PG(丙二醇)、DMSO(二甲基亚砜)、EG(乙二醇)、GLY(甘油)、MeOH(甲醇))不同浓度(8%、10%、12%、14%、16%、18%)对太平洋鳕精子冷冻保存效果的影响。实验结果表明,蛋黄能够显著提高太平洋鳕冷冻保存效果(P0.05);12%PG中添加10%蛋黄保存的冻融精子运动率最高(85.87%±1.6%),显著高于其他冻存组(P0.05)。添加蛋黄的12%浓度的DMSO组解冻后精子运动速率较高,平均直线速度、平均曲线速度、平均路径速度分别达到了(120.39±20.78)μm/s、(120.39±20.78)μm/s、(155.64±12.02)μm/s,与其他各实验组差异显著(P0.05)。通过扫描电镜和透射电镜观察新鲜和冻融后的鳕鱼精子发现,鲜精中75.5%精子形态结构正常、24.5%精子形态结构异常;运动率最高的冻精中67%精子形态结构正常、33%精子形态结构异常。超低温保存对太平洋鳕精子结构产生了显著影响,细胞膜破裂、线粒体肿胀变形,鞭毛脱落、断裂。     

大黄鱼Pseudosciaena crocea (Richardson)卵子和仔、稚鱼的形态特征

关于大黄鱼卵子和仔、稚鱼的形态特征,过去已有一些记载,但对很多阶段的描述还不齐全,使鉴定工作遇到不少困难。1958和1959年我们在浙江和广东近海进行了卵子和仔、稚鱼的形态观察,同时,还做了卵子恒温发育的初步试验; 1960年又搜集了补充资料,为开展大黄鱼生殖习性和早期生活阶段生态研究提供了基本资料。大黄鱼与小黄鱼等卵子和仔、稚鱼的形态很相似,不易分辨,本文中亦一并作了比较。 本文是在导师张孝威教授指导下完成的,吴尚勤副教授提供了宝贵意见,丁正凰和陈富宝同志曾参加海上采集工作,范守安同志协助分析海水;此外,浙江鱼山岛渔业生产大队、广东硇洲岛洲岛渔业生产大队和我所的"水星号"稠查船船长及船员协助了海上工作,在此特致感谢。     

钝顶螺旋藻优良品系SCS的生理特性研究

本文报道从淡水原种中分离筛选出钝顶螺旋藻Spirulina platensis的优良品系SCS的生理特性。该种经过海水驯化后,不仅能在自然海水培养基中生长,而且产量、质量和纯度等方面均明显优于在淡水中培养的同一株系。此外,还具有适应高温和强光等优越的生理特性。     

大黄鱼生长的种内变异

围绕着大黄鱼Pseudosciaena crocea (Richardson) 的生长问题，我们曾分别对以下一些问题作过初步研究；生长的地理变异，季节生长，生长与性成熟的关系，生长与生殖力的关系，生殖季节的体长-体重关系的种内变异等。本文利用过去积累的资料，对大黄鱼整个物种的生长特性和种内生长的不同类型以及大黄鱼生长的种下群(Subpopulation)差异幅度，进行比较全面的分析研究。由于这些资料是在1-2年内于不同产卵场上收集的，文中所述体长和体重都是实测数值，所以可不考虑年度差异和季节差异。体重是指除去性腺和消化道的纯体重。     

太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)精液的超低温保存研究

筛选了六种抗冻保护剂(GLY[甘油],DMSO[二甲基亚砜],PG[丙二醇],EG[乙二醇],DMA[二甲基乙酰胺],MeOH[甲醇])及其五种不同浓度(6%,8%,10%,12%,14%,V/V)、三种稀释液(HBSS溶液,人工海水[ASW],过滤海水[FSW])、四种稀释比例(1︰1,1︰2,1︰4,1︰6)、三种添加剂(蔗糖,葡萄糖,海藻糖)、三个分步降温程序(程序A,程序B,程序C)对太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)精液冷冻保存的影响,成功建立了太平洋牡蛎精液超低温保存方法:以10%DMSO为抗冻保护剂,HBSS溶液为稀释液,1:4的稀释比例,添加海藻糖,采用分布降温法冷冻保存太平洋牡蛎的精液,37°C水浴解冻后精液运动率达到71.27%±3.24%,显著高于其它实验组(P0.05),受精率和孵化率分别达到95.04%±1.99%、93.33%±1.33%,与鲜精(88.89%±15.16%,94.90%±0.95%)、程序冷冻前精液(95.96%±2.15%,92.67%±14.83%)差异不显著(P0.05),证明该太平洋牡蛎精液超低温保存方法可以应用于生产实践和科学研究中。     

养殖大黄鱼(Pseudosciaena crocea)3种致病弧菌的分子鉴定及其系统发育学分析

从患病养殖大黄鱼分离到3株病原菌H040823-1、H050704-1、H050815-1,经常规生理生化鉴定均属于弧菌属的种类,API20E快速鉴定菌株H040823-1为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyti-cus),菌株H050815-1为溶藻弧菌(V.alginolyticus),菌株H050704-1不在API20E鉴定谱内。为了进一步确定其分类地位,测定了3株病原菌的16S rRNA和HSP60(heat shock protein,HSP60)基因部分序列。16S RNA基因系统进化分析表明,3株病原菌与副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌亲缘关系较近,相互之间同源性均大于96.9%,差异不明显。HSP60基因序列分析表明,菌株H040823-1、H050704-1、H050815-1的HSP60基因序列分别与V.parahaemolyticus(AF230951)、V.harveyi(EU036994)、V.alginolyticus(DQ664545)的同源性最高,分别为96.7%、99.8%和98.0%,而与其他弧菌HSP60基因的同源性均低于91.9%,3株病原菌相互之间同源性低于92.3%,差异显著。HSP60基因构建的系统进化树表明,H040823-1、H050704-1、H050815-1分别与V.parahaemolyticus、V.harveyi、V.alginolyticus聚类。综合以上结果,菌株H040823-1、H050704-1、H050815-1可分别鉴定为副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌。结果表明,HSP60基因比16S rRNA基因更适合用于海水鱼类致病性弧菌种间的分类研究。     

病原分离鉴定及致病性研究

于2013年4月从宁德患内脏白点病大黄鱼(Pseudosciaena crocea)中分离得到两株优势菌NZBD9和NZBD11, 这两株菌在16—19°C条件下回归感染能引起大黄鱼内脏白点病, 而在7—10°C和24—27°C条件下同样的人工感染不能致病, 从而证实这两株菌为大黄鱼内脏白点病的病原菌。经16S rDNA基因的测序和时间飞行质谱微生物鉴定仪分析, NZBD9 和NZBD11同为变形假单胞菌。药敏性实验结果显示NZBD9对庆大霉素、诺氟沙星和四环素等7种药物高度敏感。组织病理学观察结果显示病鱼的肝脏、脾脏、头肾等组织中均出现明显病症, 如变性和坏死。