鳗弧菌膜绑定溶胞壁质转糖酶MltD的表达纯化及生物信息学分析

本研究将新发现的鳗弧菌毒力相关基因mltD(膜绑定溶胞壁质转糖酶基因)克隆于表达载体pET-32a(+),在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并以镍琼脂糖亲和层析柱纯化表达的融合蛋白;经SDS-PAGE分析,纯化的融合蛋白为单一条带,分子量约为70.2 kDa,与理论预测值相符。生物信息学分析表明,鳗弧菌MltD由523个氨基酸组成,与其他弧菌的MltD氨基酸序列有较高的相似性;二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主;功能区包括N端的信号肽区域、1个糖基转移酶结构域和C端的3个溶解酶结构域;蛋白的N端具有一段脂蛋白信号肽,信号肽外的其他部分为非细胞质蛋白。鳗弧菌MltD蛋白为亲水性;不稳定系数为27.40,属于稳定性蛋白;整个蛋白分子共有24个可能的抗原决定簇,具有较强的抗原性。推断MltD蛋白为1种外周膜脂蛋白,在弧菌中相对保守,抗原性强,可应用于抗弧菌病疫苗的开发研制。     

创伤弧菌内膜脂蛋白MFP4的克隆、表达及细胞定位研究

创伤弧菌是一种海洋环境中的重要病原菌。细菌脂蛋白是一类细菌重要的具有不同生理功能的膜蛋白,以大肠杆菌为代表的经典革兰氏阴性菌脂蛋白分泌规律遵循“+2规则”。为探究海洋环境中革兰氏阴性菌的细菌脂蛋白分泌机制是否有别于其他环境中的革兰氏阴性菌,本研究克隆并表达了创伤弧菌的MFP4脂蛋白,该脂蛋白N端成熟肽段第二位(+2位)氨基酸为甘氨酸,根据“+2规则”理论上应定位于细胞外膜。实验利用细菌外膜小体分离鉴定法,在表达MFP4重组脂蛋白的创伤弧菌中对其进行细胞定位后发现, MFP4生物合成后定位于细胞内膜。实验进一步构建了MFP4蛋白N端序列与红色荧光蛋白RFP的融合脂蛋白基因MFP4tether-RFP并在创伤弧菌中表达,细胞定位结果发现该重组融合脂蛋白仍然定位于细胞内膜,说明MFP4成熟脂蛋白的N端携带内膜细胞定位的信息。实验同时构建并表达了外膜脂蛋白LptE的N端序列与RFP的融合重组脂蛋白LptEtether-RFP,该蛋白具有与MFP4相同的N端+2位氨基酸(Gly+2),与MFP4 tether-RFP融合脂蛋白仅有(+3—+10位)8个氨基酸序列的差异。实验发现该融合脂蛋白定位于...     

青蛤(Cyclina sinensis)溶菌酶基因在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激下的表达

利用构建的SMART cDNA文库和高通量测序方法,得到了青蛤溶菌酶相关基因的全长,采用荧光定量RT-PCR方法分析了c型溶菌酶基因在鳗弧菌刺激下的表达变化。结果表明,青蛤有c型溶菌酶和i型溶菌酶基因,分别编码155和182个氨基酸,c型溶菌酶信号肽为21个氨基酸并具有典型的LYZ1结构域,i型溶菌酶信号肽为19个氨基酸,其结构域为Destabilase domain结构,用于识别和切断谷氨酰胺-甲酰胺与赖氨酸ε-氨基之间的肽键。荧光定量PCR结果显示,在鳗弧菌刺激后6—24h,青蛤血细胞中c型溶菌酶的表达量出现明显上调的趋势,与对照组有显著性差异(P0.05),说明c型溶菌酶基因在青蛤的免疫应答中起重要的作用。     

大珠母贝外套膜基因PMMG1的克隆、表达及其特征分析

EF-hand结构域在真核生物细胞内钙离子吸收和运输中发挥重要作用,在贝类中可能参与贝壳和珍珠质的形成。根据已报道的贝类中具有EF-hand结构域的碱基序列设计简并引物,从大珠母贝外套膜cDNA文库中筛选得到PMMG1基因(大珠母贝外套膜基因1)。PMMG1基因全长618 bp,开放读码框编码140个氨基酸,N-端的22个氨基酸肽段为信号肽。PMMG1氨基酸序列与合浦珠母贝PFMG1的一致性为56%,预测有两个EF-hand结构域。选取编码PMMG1成熟蛋白的cDNA序列插入pET-32a质粒构建表达载体,通过IPTG诱导,Ni2+-NTA亲和层析柱纯化,成功获得预期大小的融合蛋白。凝胶电泳迁移率的变化证明PMMG1蛋白具有结合Ca2+/Mg2+的活性,组织特异性表达表明PMMG1基因在外套膜的表达量远高于其他组织。大珠母贝外套膜基因PMMG1的克隆与表达研究为进一步研究该蛋白在珍珠质矿化中的作用、探讨珍珠质形成的分子生物学机制奠定了一定基础。     

脊尾白虾抗菌肽Crustin基因的克隆、表达与功能研究

为研究脊尾白虾(Exopalaemoncarinicauda)抗菌肽Crustin的结构特征和功能,本研究从脊尾白虾中克隆得到一个Crustin的新变体,命名为EcCrustin1。研究结果表明,EcCrustin1基因cDNA序列长度为740 bp,开放阅读框(ORF)长度为477 bp,编码158个氨基酸,EcCrustin1蛋白具有Ⅱ型Crustin的典型特征,包括N端的信号肽,C端WAP结构域,以及二者之间的甘氨酸富集区(GRR)和半胱氨酸富集区(CRR)。EcCrustin1基因主要在脊尾白虾血淋巴中表达,副溶血弧菌刺激后,EcCrustin1在血淋巴中的表达显著上调(P<0.05),说明EcCrustin1在脊尾白虾先天免疫应答中发挥重要作用。此外,通过原核表达获得了该抗菌肽的重组蛋白,为进一步研究其抑菌功能和机理提供了基础。     

副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）tdh2基因和鳗弧菌（Kanguillarum）ompU基因二联DNA疫苗制备及其对大菱鲆（Scophthalmusmaximus）免疫保护作用

采用基因工程的方法,将副溶血弧菌的热稳定直接溶血素基因tdh2和鳗弧菌外膜蛋白基因ompU进行融合,在大肠杆菌中得到表达,并利用该融合基因构建二联DNA疫苗pEGFP．N1／tdh2-ompU。用DNA疫苗按10和50μg／尾的剂量通过肌肉注射免疫大菱鲆,对大菱鲆抵抗致病性副溶血弧菌和鳗弧菌的免疫效果进行研究。结果表明...     

致病性鳗弧菌W-1外膜蛋白ompU基因克隆及在大肠杆菌中的表达

从致病性鳗弧菌W-1基因组DNA扩增并克隆了1 156bp的特异性片段,含有完整的外膜蛋白ompU基因阅读框,由993个核苷酸组成,编码330个氨基酸残基的蛋白质。与国外已发表的鳗弧菌外膜蛋白基因的序列同源性为100%,与创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、费氏弧菌(Vibrio fischeri)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的序列同源性分别为72%,69%,68%和64%。将该外膜蛋白基因克隆于pBV220表达质粒,在大肠杆菌中得到了表达,SDS-PAGE分析表明表达蛋白分子量约38kDa,Western blot分析发现表达蛋白能与鳗弧菌外膜蛋白抗体很好的反应。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)Pthyastatin抗菌肽基因的克隆与表达分析

采用构建三疣梭子蟹血细胞全长cDNA文库的方法克隆了一个新型抗菌肽基因Pthyastatin,并用荧光定量RT-PCR方法,进行Pthyastatin的表达研究。结果表明,Pthyastatin前体由16个氨基酸残基的信号肽和成熟肽两部分组成,其中Pthyastatin成熟肽有两个结构域:N端的富含Pro/Arg结构域和C端的包含6个保守Cys残基与对虾抗菌肽penaeidins同源的结构域,表明Pthyastatin属于对虾抗菌肽penaeidins家族;荧光定量RT-PCR分析结果表明Pthyastatin在血细胞中高水平组成型表达;致病菌副溶血弧菌诱导后Pthyastatin在血细胞中表达先下调、后上调,在诱导后24h表达量又基本恢复到诱导前水平,支持Pthyastatin在血细胞中高水平组成型表达的观点,但致病菌诱导后表达变化机制不明。     

SsC1qDC基因在毛蚶免疫防御中的作用

含C1q结构域蛋白(C1qDCs)在无脊椎动物免疫应答中发挥重要作用,但目前有关毛蚶(Scapharca subcrenata)C1qDCs免疫功能的研究鲜有报道。本研究从毛蚶中鉴定出一个含有典型C1q结构域的基因(命名为SsC1qDC),并分析了其对主要病原感染的响应特征。SsC1qDC的cDNA全长序列为711bp,编码含有N端信号肽和199个氨基酸的蛋白,系统进化分析显示SsC1qDC与双壳贝类的C1qDCs聚在一起。SsC1qDC在毛蚶卵细胞到眼点幼虫时期的表达量随发育阶段显著增加,且该基因在成体毛蚶各组织中均有表达,其中在肝胰腺和闭壳肌中表达水平较高。副溶血弧菌刺激可显著诱导SsC1qDC基因高表达,敲降SsC1qDC基因表达后毛蚶死亡率和血细胞凋亡水平显著升高,且导致毛蚶血细胞总数和吞噬活力显著下降。同时,敲降SsC1qDC基因的表达可显著抑制母源免疫相关基因Vg、LSZ、Dscam、TEP和SsC1qDC-3的表达,而C3、PAF3、SsC1qDC-1和SsC1qDC-2等基因的表达显著上调。本研究结果表明, SsC1qDC在毛蚶抗弧菌响应中发挥重要作用,对贝类免疫学和抗...     

中国明对虾Imd免疫信号通路相关基因克隆及表达分析

Imd免疫信号通路在无脊椎动物抗革兰氏阴性菌方面起到十分重要的作用。在已知中国明对虾Imd通路下游核转录因子Relish基因全长的情况下,利用同源克隆方法获得了Imd通路上游基因Imd的cDNA序列,命名为FcImd,该基因全长783bp,5’非编码区45bp,3’非编码区255bp,开放阅读框483bp,编码160个氨基酸,包括一个位于C端的死亡结构域。同源性分析表明,FcImd基因氨基酸序列与其他甲壳动物的氨基酸序列高度保守,与凡纳滨对虾和日本囊对虾的同源性分别为99%和88%。于鳗弧菌感染后的1,3,6,12,24,48,96,144h记录实验组和对照组的累积死亡率,并分别取血淋巴用于检测中国明对虾Imd及Relish基因在不同时间点的表达量变化情况。结果显示:鳗弧菌感染后,实验组Imd和Relish表达量均显著高于对照组(P0.05),其中Imd表达量呈先升高后降低趋势,Relish表达量在1h时达到最高,然后呈逐渐降低趋势。中国明对虾感染鳗弧菌后Imd和Relish基因呈不同步上调表达,说明Imd和Relish基因的表达与弧菌刺激密切相关,提示Imd和Relish基因参与了对虾抗菌反应的Imd信号转导通路。