中国对虾人工诱导雌核发育的研究Ⅰ──四步诱导法

１９９０～１９９３年于青岛采用研究鱼类人工诱导雌核发育相类似的方法 ──紫外线照射精子、受精、温度或细胞松胞素Ｂ处理卵子方法，对中国对虾进行 人工雌核发育的研究。实验结果，有三批材料获得较好的效果：二批培育到蚤状幼 体，另一批培育到３～３．５ｃｍ幼虾。经受精细胞学观察，被照射的精子经受精，其核 有的不能原核化，有的虽能原核化，且能向中央迁移，但都不能与卵原核结合。实验 表明，这三批育出的个体是雌核发育的个体。     

中国对虾人工诱导雌核发育的研究：II.紫外线辐射对精子顶体反应和受精…

研究了３６５ｎｍ波长紫外线辐射中国对虾精子对其顶体反应和受精能力的影响，结果表明，低剂量上线辐射促进精子发生顶体反应，大剂量辐射使精子失发生顶体反应的生理机能并死亡，３６５ｎｍ波长紫外线能够透过精英和纳精覆盖，对其内精子起到杀伤作用，精液稀释液在紫外线下辐射５～８ｓ仍有部分精子具有受精能力，但胚胎在早期阶段即死亡，人工诱导雌核发育的过程中，紫外线辐射精液释液５～８ｓ可获得遗传物质失活的精子（激活源     

大黄鱼雌核发育二倍体的人工诱导

采用紫外线照射对大黄鱼(Pseudosciaena crocea Richardson)精子遗传物质进行完全灭活,灭活后精子与卵子受精获得雌核发育单倍体受精卵,再通过冷休克对单倍体受精卵进行倍性恢复,成功诱导出大黄鱼雌核发育二倍体。实验结果表明:(1)在紫外照射过程中照射剂量与大黄鱼精子和卵子受精后其成活率和孵化率呈现出明显的Hertwig效应,紫外照射时间超过2 min(剂量>2 400 ergs/mm2),可使大黄鱼精子遗传物质完全灭活。大黄鱼雌核发育诱导中精子遗传灭活的最适紫外照射时间为2.5 min(剂量为3 000 ergs/mm2);(2)冷休克法可成功抑制大黄鱼受精卵第二极体排放,诱导效果受处理时刻、处理时间和处理温度三因素的影响。综合雌核发育二倍体的诱导率、处理后受精卵早期胚胎存活率和仔鱼孵化率等因素,较适合的染色体加倍条件为23℃培育水温下授精后2 min,在3-4℃海水中处理10 min。     

黄姑鱼雌核发育的人工诱导及鉴定

采用紫外线（UV）灭活的同源精子通过冷休克抑制第二极体排放诱导黄姑鱼的雌核发育。黄姑鱼精子最适的灭活剂量为420 mJ/cm2,紫外照射剂量与黄姑鱼精子和卵子授精后的受精率及孵化率之间表现出明显的Hertwig效应。多次试验筛选的黄姑鱼雌核发育的最适条件为授精后2min在3℃处理8min。雌核发育仔鱼经形态学和流式细胞仪鉴定为二倍体。进一步利用10对微卫星分析了遗传物质在亲本和子代中的传递情况,结果表明雌核发育后代的等位基因完全来自于母本,没有父本基因参与;雌核发育后代在5个位点微卫星位点具有较高的重组率,使其与母本保持了高度同质性。     

人工诱导香港巨牡蛎雌核发育单倍体的研究

研究利用紫外线诱导香港巨牡蛎Crassostrea hongkongensis雌核发育的条件.结果表明,在强度为1820μW · (cm2·s)-1的紫外线(254nm)下分别照射精子0,5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,70,80和90s后,照射30s的实验组能够保持较高的受精率(61.6%),该组的D形幼虫发生率为0,出现"Hertwig效应".研究表明,在强度为1 820 μW·(cm2·s)-1的紫外线下照射精子30s是获得香港巨牡蛎雌核发育单倍体的适宜条件.研究还表明受精率和D形幼虫发生率随照射时间的增加而下降,遗传失活的精子与正常卵子受精后其胚胎发育至D形幼虫前期停止.经紫外线照射的精子授精后所产生的单倍体胚胎发育速度慢于正常受精所产生的二倍体胚胎,各照射组均出现非整倍体.     

中国对虾三倍体诱导的研究

中国对虾(Penaeus chinensis)主要分布于我国北方沿海,是我国水产养殖业的主要养殖对象,具有极其重要的经济价值。随着养殖事业的发展和人民生活水平的提高,提供优良的对虾品种已势在必行,于是遗传育种的研究引起了人们极大的重视。国家把生物技术在对虾上的应用列为国家“七五”和“八五”攻关课题。 近年来海洋生物多倍体诱导引起了水产养殖界的广泛兴趣(楼允东,1984;吴宝玲等，1986;姜卫国等,1987;王子臣,1990;相建海等,1992; Stanley,1981; Johnstone,1985;Downing,1987; Gosling,1989; Cai et al,1991),主要原因是三倍体较二倍体的生长速度快,长出的个体也比二倍体大,可得到较高的经济效益;同时,多倍体的诱导方法对染色体调控、性别决定和人工雌核发育(蔡难儿等,1995)等的研究都具有重要的意义。中国对虾的多倍体诱导不论从理论上还是从应用上都具有积极的意义,是一条值得探索的改良对虾品种的良好途径。     

皱纹盘鲍人工诱导雌核发育精子遗传失活的初步研究

用波长253．7nm，光照强度1．108mW/cm^2的不同剂量紫外线照射皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai Ino)精子，然后与皱纹盘鲍的正常卵受精。在0－120s的照射范围内，受精作用都仍能正常发生，从早期胚胎存活率上可观察到“Hertwig”效应的存在，单倍体和非整倍体胚胎在孵化前死亡。在150000个精子／cm^2的条件下，精液厚度5mm左右，经70s以上紫外线照射后，精子染色体可完全失活。     

中国对虾(Penaeus chinensis)四倍体诱导研究

利用光控和行为学原理,控制中国对虾在适当时候产卵,在一定的时刻以温度休克和细胞松弛素的方法诱导受精卵发育成为四倍体。作者发展了对虾染色体制备技术,以中肠和触角腺、精巢为材料,从后期幼体直到8～9cm左右次成虾均获得较好的分裂中相。染色体倍性检测结果表明,最好的四倍体诱导成功率达66.7％。共获得10cm左右的实验对虾几千尾。初步观察表明,四倍体中国对虾具有一定的生长优势。     

平鲷雌核发育二倍体的人工诱导

平鲷(Rhabolosargus sarba)养殖群体具有雌性生长优势的特点.应用冷休克方法进行平鲷雌核发育二倍体人工诱导,采用高温消毒的自然海水为精子稀释液,精液经强度为700μW/(cm2·s)的紫外线(UV)照射100 s,染色体遗传物质失活,卵子经激活后,可以获得95%～100%单倍体胚胎.实验结果表明:在卵子激活后5 min进行冷休克,温度0～8℃,处理时间持续15min,雌核发育二倍体的受精率达71.3%～82.7%,孵化率为24.7%～36.3%,2～6℃为适宜冷休克温度,此范围内的温度对雌核发育二倍体的受精率和孵化率没有显著影响(P>0.05),而与0,1和8℃实验组的受精率和孵化率差异均显著(P<0.05);在冷休克温度为3℃、持续时间为15 min的条件下,初始冷休克时间在4～6 min之间的受精率和孵化率均较高,分别达到60.0%～67.1%和30.6%～36.5%,其组间受精率和孵化率没有显著差异(P>0.05),而与其他实验组的孵化率存在显著差异(P<0.05);冷休克持续时间以11～19 min为宜,受精率和孵化率分别为46.9%～65.8%和31.7%～42.4%,在此时间内,冷休克持续时间对平鲷的雌核发育二倍体受精率和孵化率影响不显著(P>0.05).选用冷休克温度、初始冷休克时间和持续时间分别为3℃,5和15 min作为平鲷雌核发育二倍体的诱导条件是显著有效的.     

虾夷扇贝人工诱导雌核发育精子遗传失活及紫外线照射对精子形态结构影响的研究

在1698μWcm-2s^-1的紫外线照射强度下，虾夷扇贝雌核单倍体的最佳诱导时间为60s。从早期胚胎存活率可以观察到Hertwig效应的存在。随着照射时间增加，受精率明显下降，而受精卵在到达D形幼虫期之前便停止发育。扫描电镜显示，随着紫外线照射强度的增加。精子顶体和鞭毛结构趋向于受到更大程度的破坏，直到完全失去顶体和鞭毛。并指出这可能是造成受精率降低的主要原因。     

~(60)Coγ射线诱导中国对虾雌核发育的观察

用~(60)Coγ射线照射中国对虾的精子,进行人工授精,观察辐射精子与正常卵受精的胚胎发育和早期胚胎存活率。指出用~(60)Coγ射线照射精子授精后,早期胚胎发育存在“Her-twing效应”。     

黄姑鱼(Nibea albiflora)雌核发育的人工诱导及鉴定

采用紫外线(UV)灭活的同源精子通过冷休克抑制第二极体排放诱导黄姑鱼(Nibea albiflora)的雌核发育。结果表明,黄姑鱼精子最适的灭活剂量为420mJ/cm2,紫外照射剂量与黄姑鱼精子和卵子授精后的受精率及孵化率之间表现出明显的Hertwig效应。多次试验筛选的黄姑鱼雌核发育的最适条件为授精后2min于3℃处理8min。雌核发育仔鱼经形态学和流式细胞仪鉴定为二倍体。进一步利用10对微卫星分析了遗传物质在亲本和子代中的传递情况,结果表明雌核发育后代的等位基因完全来自于母本,没有父本基因参与;雌核发育后代在5个微卫星位点具有较高的重组率,使其与母本保持了高度同质性。     

紫贻贝雌核发育二倍体的人工诱导研究

采用紫外线照射的方式使精子遗传物质失活,通过细胞松弛素B(CB)的处理来抑制受精卵第二极体的释放,人工诱导紫贻贝(Mytilus gallopovincialis)雌核发育二倍体。将精子在强度为2561μW/(cm~2·s)的紫外线(254 nm)下进行时间梯度的照射,之后与正常的卵子受精,实验发现随照射时间的增加,卵裂率、早期胚胎存活率和D形幼虫发生率总体呈下降趋势,在照射55 s时D形幼虫发生率降为0。受精后25 min,用浓度0.5μg/mL的细胞松弛素B(CB)持续处理受精卵20 min,诱导出紫贻贝第二极体抑制型雌核发育二倍体。通过微卫星分析鉴定所得的子代个体均为雌核发育二倍体。     

中国对虾凝集素活力及弧菌的诱导动力学

实验证明中国对虾血淋巴中存在凝集素。用未经处理的兔血球检测,在正常状态下,春季的亲虾和秋季体长为12～16cm的虾,凝集活力滴度均为32,且对人的A、B、O型红血球均有凝集反应,其反应滴度与兔血球相同。用弧菌诱导时,这种凝集反应的活力可以提高。注射弧菌24h后活力由32上升到128,48h后达到256的峰值,然后又逐渐下降。     

摘除眼柄诱导斑节对虾成熟产卵的研究

本实验结果表明,摘除斑节对虾(Penaeus monodon Fabficius)左或右侧眼柄,可以诱导卵巢发育成熟产卵,且成活率高,亦不影响正常摄食和交配活动。不摘除眼柄和摘除两侧眼柄,迄今尚未见到卵巢发育之虾。 实验还表明:选择雌虾体长210mm、体重140g以上,在水温27—3l℃,盐度30—35‰,pH值7.2—8.5,弱光(光照度100—500Ix),光质为蓝或绿光,溶解氧4mg/L以上,外界环境尽量避免干扰,微循环水流动,饵料以贝类,日投喂量10%的条件下培养,催熟效果好。 本实验也为在对虾属中进行种间杂交培育优良品种提供了依据。     

中国对虾人工诱导雌核发育的研究 Ⅱ.紫外线辐射对精子顶体反应和受精能力的影响

研究了 36 5 nm波长紫外线辐射中国对虾精子对其顶体反应和受精能力的影响。结果表明 ,低剂量紫外线辐射促进精子发生顶体反应 ,大剂量辐射使精子丧失发生顶体反应的生理机能并死亡。 36 5 nm波长紫外线能够透过精荚和纳精囊盖 ,对其内精子起到杀伤作用。精液稀释液在紫外线下辐射 5～ 8s,仍有部分精子具有受精能力 ,但胚胎在早期阶段即死亡。人工诱导雌核发育的过程中 ,紫外线辐射精液稀释液 5～ 8s,可获得遗传物质失活的精子 (激活源 )。经透射电镜观察分析 ,紫外线对精子遗传物质的损伤是一种使染色质变性的化学作用。     

爆发性流行病病原对中国对虾仔虾的人工感染实验研究

为了探讨暴发性流行病病原——中国对虾皮下及造血组织坏死杆状病毒(HHNBV)在仔虾阶段的传播途径和感染方式,同时为建立高健康无特异病原虾系统提供检测手段,探讨改善对虾苗种培育措施,为养成提供健康苗种,作者对中国对虾仔虾进行了暴发性流行病原人工投喂感染试验以及检测方法的研究。1　材料与方法1.1　试验材料1.1.1　病虾的来源　发病对虾来源于1994年山东青岛郊区患爆发性流行病虾池的对虾,并经过电镜切片观察确认为感染HHNBV。1.1.2　毒种分离　取发病的对虾头胸甲部分约200g,去掉甲壳和肝胰腺,剩余部分加入1×10-9溶液(NaCl24g/…     

人工越冬对虾体内寄生纤毛虫病的研究

本文报道了中国对虾越冬亲虾体内寄生纤毛虫病的发病机制、病理组织及防治方法。试验结果表明：虾体表损伤是致病的主要原因。纤毛虫通过伤口进入虾体内，寄生于心脏血淋巴，吞噬血细胞，破坏组织尤其是鳃组织。致使组织机构损伤，缺血、变性，对虾呼吸困难，贫血、窒息而死，防止对虾体表受伤是预防该病的唯一途径。一些外用消毒剂如福尔马林、孔雀绿等对该病有预防作用。     

暴发性流行病病原对中国对虾越冬亲虾人工感染的研究

从典型的白斑症病虾中,分离出一种杆状病毒,属对虾白斑病杆状病毒［３］。为了探讨对虾暴发性流行病的发病机理及传播机制,作者于１９９６～１９９７年冬季,采用青岛地区当年夏季暴发典型白斑症的病虾,对中国对虾健康的越冬亲虾进行了白斑病杆状病毒的感染试验。１　材料和方法１．１　病虾标本与病原分离具典型白斑症状的病虾,于１９９６年８月取自青岛城阳区红岛邵格庄发病的虾场,保存于－７０℃。剥离病虾的胃、肠及鳃组织约１０ｇ,加液氮充分研磨,加９０ｍｌ０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ（０．２ｍｏｌ／ＬＮａ_２ＨＰＯ_４－Ｎａ…     

中国对虾早期性别分化研究

自20世纪80年代初期，对虾的工厂化育苗获得成功，使对虾养殖业得到长足的发展。为此，科学家们围绕对虾人工养殖，在对虾的性腺发育、性腺成熟等方面进行了研究(洪水根等，1988；李怀梅等，1994)。由于养殖水域的过度开发，养殖环境的恶化，养殖种类的病害越来越严重地影响着水产养殖业的发展。显然，要维持水产养殖业的持续发展，必须通过一些遗传改良技术对现有养殖品种进行遗传改良，从而获得性状优良的养殖品种。目前较为行之有效的方法是对对虾的性别进行控制，获得对虾雌性比例高的种群，才能有效地提高养殖产量，因而对对虾性别控制研究具有重要的意义。脊椎动物激素可引起鱼类发生性别反转，但是，对对虾的性别反转不起作用。利用激素饲喂或浸泡幼小动物可以引起性反转，已完成性分化的鱼苗不能进行性反转，只能抑制或促进性别特征的发育。促雄腺对对虾的外部性征发育起着重要的作用(李富花等，1996)，对对虾早期性别分化进行研究是成功进行人工性别控制的基础。目前有关对虾早期性别分化的研究报道很少(尹左芬等，1986；Nakamura，1992)。本文利用扫描电镜和组织学切片观察相结合的方法，研究了中国对虾的早期性别分化情况，为中国对虾性别控制硏究奠定了基础。