菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)漆酶型酚氧化酶的纯化及特性分析

采用非变性电泳结合特异性底物发色方法从菲律宾蛤仔血细胞中分离出一种酚氧化酶,研究了该酶的酶促反应动力学参数,金属离子、抑制剂对酶活的影响。结果表明,分离获得的酚氧化酶分子量约为563kDa;对底物邻苯二酚、左旋多巴(L-DOPA)、多巴胺、对苯二酚的米氏常数Km分别为0.42、1.60、1.79和1.76mmol/L;酶的活性在Mg2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+、Cu2+和Ca2+浓度为5、10、20、30mmol/L时受到抑制;酶的活性可被抑制剂抗坏血酸、二乙基二硫代氨基甲酸钠(DETC)、半胱氨酸、亚硫酸钠、柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、叠氮钠和硫代尿素等抑制。根据底物特异性、抑制剂等结果,所分离获得的酚氧化酶属于漆酶型的含铜酚氧化酶。     

牙鲆孵化酶的分离纯化及其部分生物化学性质研究

利用凝胶过滤柱层析和阴离子交换柱层析技术,从牙鲆（Paralichthys olivaceus）胚胎孵化液中分离纯化出了大小约为34．8ku的牙鲆孵化酶。该酶卵膜裂解的最适反应温度为35℃,最适pH为7．0;对底物酪蛋白的米氏常数Km值为1．53mmol／L。该酶对丝氨酸蛋白酶和胰蛋白酶的特异性抑制剂非常敏感,而对其他蛋白酶抑制剂不敏感,表明该酶极可能是一种丝氨酸蛋白酶类型的胰蛋白酶。此外,该酶可浓度依赖性地被EDTA所抑制,被Cu^2＋所强烈抑制,被Ca^2＋和Mg^2＋所激活,对Zn^2＋则不敏感,表明该酶很可能是一种金属蛋白酶。     

温度、pH对日本沼虾血清酚氧化酶活力及稳定性的影响

以日本沼虾（Macrobrachium mipponense)为材料，研究温度，pH对其血清酚氧化酶活力及稳定性的影响。试验以L－多巴为作用底物，测得酚氧化酶的最适温度为40℃，大于或低于该值，酶活力均迅速下降，同时该酶在40℃以下表现出较高的热稳定性；该酶的最适pH值为7．0；在pH6－8范围内具有较高的活性，最稳定的pH为8．0。     

中国对虾酚氧化酶的部分生物化学特性的初步研究

以海捕中国对虾(Penacus chinensis)为材料，运用离心、凝胶过滤柱层析和离子交换柱层析的方法从对虾血淋巴中部分纯化出酚氧化酶。实验又以L-DOPAC为底物，分析各种因子对其活力的影响。结果显示酚氧化酶的最适pH值约为6．0，最适温度为40℃，Cu^2 能强烈抑制酚氧化酶的活性，而Mg^2 则能促进其活性，表明酚氧化酶可能是一种金属酶。     

褐牙鲆鳃丝Na+-K+-ATPase性质的研究

研究了褐牙鲆 (Paralichthysolivaceus)鳃丝Na K ATPase的性质。结果表明 :褐牙鲆鳃丝Na K ATPase活力随着反应温度、pH的增加均呈现峰值变化 ,其最适反应温度为 3 0～ 3 5℃ ,高于 40℃酶活力急剧下降 ,至 5 0℃酶失活 ,而最适pH为 7.5～ 8.0之间 ,pH <7.5或 >8.0时酶活力急剧下降 ,低于 6.0酶活则被完全抑制 ;在本试验设计的反应时间和底物浓度范围内 ,随着时间和底物浓度的增大 ,酶活力的变化均为逐渐升高 ,且上升趋势逐渐变缓 ;反应介质中Na ,K ,Mg2 的最适浓度分别为 180 ,3 0 ,6mmol/L ,并且当K 或Mg2 浓度为 0时 ,酶活力均接近于 0。抑制剂乌本苷对鳃丝Na K ATPase活力表现为显著性抑制 ,在乌本苷浓度为 2mmol/L时 ,酶活力完全被抑制。     

红树林生境产嗜热纤维素酶芽孢杆菌的筛选及其活性分析

本研究从红树林沉积物样品中筛选获得一株具有较高纤维素酶活性的菌株ms-2,通过革兰氏染色、生理生化试验,以及16S r DNA基因片段比对鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ms-2。对其产酶性质进行研究表明该菌株所产纤维素酶为胞外酶而非膜锚定酶,该酶具有良好的嗜热性,且在弱酸条件下酶活性较高,最适宜温度和pH分别为65℃和6. 0,在此条件下最高酶活性为0. 655 7 U/cm3;另外,在浓度为1 mmol/dm3Cu2+、Mg2+、Zn2+、Fe3+和Mn2+条件下,Cu2+对酶活性无显著影响,Mg2+、Zn2+、Fe3+和Mn2+对酶活性均有不同程度的抑制作用,其中Mn2+的抑制最为明显,酶活性下降了29. 96%。由于产业应用中酶解纤维素时通常需要在55～60℃的温度下进行,研究获得的嗜热纤维素酶不仅适合这样的温度环境,还能维持较高的酶活性水平,并且对Cu2+、Mg2+、Zn2+、Fe3+较不敏感,有利于产业开发应用。     

中国明对虾体壁N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

为了探讨对虾N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52,NAGase)的分离纯化及其酶学性质,作者以中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)体壁为材料,通过硫酸铵沉淀分级分离、SephadexG-100柱层析和DEAE-32离子交换柱层析纯化,获得聚丙烯酰胺凝胶电泳纯的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶酶制剂,纯化酶比活力为3938.56U/mg。通过SDS-PAGE凝胶电泳,测得该酶亚基分子量为48.88 kD。酶的最适pH为6.0,最适温度为45℃;该酶在pH 6.0~9.0区域较稳定,温度稳定性范围是20~35℃,45℃下处理1 h酶活力丧失65.04%。酶水解对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷的Km为0.229 mmol/L,Vmax为5.00μmol/(L·min)。进一步研究金属离子对酶活力的影响,结果表明:Li+、Na+和Ba2+对酶没有明显影响,Mg2+、Ca2+、Mn2+、Co2+、Fe3+和Al3+对酶均有不同程度的激活作用,Cu2+、Zn2+和Pb2+对酶呈抑制作用,1.0 mmol/L Hg2+对酶呈激活作用,而10 mmol/L Hg2+使酶活力降低42.37%。     

中华管鞭虾(Solenocera crassicornis)蛋白酶的纯化及其生化特性研究

采用Tris-HCl缓冲液(50mmol/L,pH7.5)抽提、Q-sepharose F.F.阴离子交换层析、Sephacryl S-300凝胶过滤层析、SDS-PAGE等方法,进行中华管鞭虾虾头蛋白酶的分离纯化、酶学性质及其动力学特性的研究。结果表明,中华管鞭虾虾头蛋白酶粗提物经层析后,得到聚丙烯酰胺凝胶电泳纯的一酶组分。该蛋白酶的比活力从359.39U/mg增加到8277.83U/mg,提高了23.03倍,回收率达37.69%,SDS-PAGE显示该蛋白酶只含一条谱带,相对分子量为24.50kDa。以偶氮酪蛋白作为底物,该酶的米氏常数Km值为0.28mg/ml,最适温度为55℃,最适pH为7.5;蛋白酶在60℃以下比较稳定,放置1h后活性仍保持在60%以上,而在60℃以上时蛋白酶活性急剧下降,80℃放置1h后,酶活性只残留21.32%。10mmol/L Cu2 、Zn2 和EDTA对该蛋白酶有较强的抑制作用,抑制率分别约为97%、96%和55%,10mmol/LMg2 能显著促进蛋白酶活性,而10mmol/LFe2 、Ba2 、Ca2 对蛋白酶活性的影响不大。推测中华管鞭虾蛋白酶可能为一种金属蛋白酶。     

壳聚糖酶的分离纯化及性质研究

以本实验室分离的产壳聚糖酶YJ02菌株出发,制备壳聚糖酶发酵液,经离心、(NH4)2SO4分级盐析、Q-SepharoseFast Flow阴离子交换、Sephacry S-100凝胶过滤分离纯化步骤,SDS-PAGE显示为一条带,壳聚糖酶纯化了28.9倍,收率为47.6%。该酶的性质研究表明,该酶的分子量为66.2KD,最适反应温度为50℃,最适反应pH为6.0;Mn2 对酶活力有明显的促进作用,Cu2 ,Fe3 ,Hg2 对酶活力有抑制作用;小分子有机物EDTA和SDS对酶活力有抑制作用,而IAA和β-巯基乙醇对酶活力稍有促进作用。该壳聚糖酶对高脱乙酰度壳聚糖底物水解作用强,酶解位点可能为NGlc-NGlc,酶最大反应速度Vmax=4.1μmol/min,常数Km为64mmol/L。此壳聚糖酶水解壳聚糖制备的壳寡糖数均分子量为2 400Da。     

南大洋深海嗜冷菌2-5-10-1及其低温脂肪酶的研究

从南大洋普里兹湾的水样中筛选到一株产低温脂肪酶的深海嗜冷菌2-5-10-1,对其生长及产酶情况和酶性质做了初步研究.该菌株的最适生长温度为5℃,此时分泌的胞外脂肪酶最多;添加Tween80,橄榄油可显著促进脂肪酶的产生.该脂肪酶的最适作用温度为35℃,在0～20℃均保持较高的酶活性,在0℃可保持37%的相对酶活性;酶的最适作用的pH值为7.5,在pH6～9的范围内均存在较高酶活性;对热较敏感,在60℃保温15min可丧失50%以上的酶活性.该脂肪酶的催化作用不需要金属离子的参与,Cu2+和Zn2+对酶活有着强烈的抑制作用.     

镉铜单一及复合胁迫对双齿围沙蚕(Perineresis aibuhitensis)消化酶活性和抗氧化指标的影响

采用实验生态学方法,研究了Cd²⁺-Cu²⁺单一及复合胁迫3d、6d、9d对双齿围沙蚕(Perinereis aibuhitensis)消化酶活性和抗氧化指标的影响。结果表明,沙蚕的各项不同指标对Cd²⁺、Cu²⁺胁迫的响应表现出不同的变化趋势,复合胁迫中Cd²⁺-Cu²⁺对沙蚕各指标的影响存在交互效应。沙蚕3种消化酶活性大小为淀粉酶>蛋白酶>脂肪酶。Cd²⁺、Cu²⁺单一胁迫能激发沙蚕淀粉酶活性,激发作用强于复合胁迫。Cd²⁺、Cu²⁺单一胁迫实验前期低浓度组蛋白酶被抑制,高浓度组被诱导,复合胁迫实验前期Cd²⁺-Cu²⁺对蛋白酶活性的影响存在协同作用。Cd²⁺、Cu²⁺胁迫对沙蚕脂肪酶活性整体表现出抑制作用。Cd²⁺、Cu²⁺     

Cd2+和Cu2+对泥蚶的急性毒性和联合毒性试验

为了解重金属Cd2+和Cu2+对泥蚶的毒害程度和泥蚶对重金属Cd2+和Cu2+的解毒能力,用毒理学实验方法研究了Cd2+和Cu2+对泥蚶(Tegillarca granosa)的急性毒性和联合毒性效应。结果表明:Cd2+、Cu2+对泥蚶的96 h半致死质量浓度分别为6.189、0.460 mg/L;安全质量浓度分别为0.062、0.005 mg/L;相对毒性Cu2+Cd2+。在1︰1毒性单位的联合作用下,Cd2+和Cu2+对泥蚶96 h的半致死质量浓度分别为1.984、0.147 mg/L;安全质量浓度分别为0.020、0.001 mg/L。2种重金属离子的联合毒性大于任一重金属离子的毒性,联合毒性表现为协同作用。     

铜离子对海参精氨酸激酶活力与结构的影响

精氨酸激酶(Arginine kinase,EC2.7.3.3)是无脊椎动物能量代谢所必需的重要的酶.海参精氨酸激酶是一种特殊的双亚基精氨酸激酶.本文研究了在二价铜离子作用下,海参精氨酸激酶催化活性与结构的变化.结果表明,一定浓度的铜离子,可以抑制精氨酸激酶的活力,并引起酶二级结构与三级结构的变化,引起疏水面暴露,并导...     

Cu2+对青蛤的胁迫效应

为研究青蛤(Cyclina sinensis)对重金属Cu~(2+)的蓄积作用及免疫机能的影响,开展了Cu~(2+)对青蛤的急性毒性实验,观察青蛤在96 h Cu~(2+)半致死浓度和安全浓度胁迫下,不同组织的蓄积趋势,及血淋巴液中SOD、CAT和ACP活性的变化。结果显示:Cu~(2+)的半致死浓度为0.807 mg/L,安全浓度为0.00807 mg/L。鳃和内脏团组织中蓄积的Cu~(2+)浓度与处理时间呈正相关;在半致死和安全浓度胁迫下,鳃组织中Cu~(2+)蓄积速度均快于内脏团;在半致死浓度胁迫下血淋巴液中SOD、CAT和ACP活性呈现先诱导再抑制的趋势,安全浓度下无明显变化,但均高于对照组水平。     

Regulation of Tilapia metallothionein gene expression by heavy metal ions

Tilapia is a common fish species inhabiting inland waters and estuarine regions in Hong Kong and Southeast Asia, and useful for bio-monitoring of metal pollution. Metallothionein (MT) gene expression in fish tissues has been useful to sub-lethal risk assessment as biomarker of exposure to metal ions in fishes inhabiting metal contaminated area. To investigate metal inductions of Tilapia MT gene expression in vivo, Tilapias were injected with different concentrations of heavy metals and tissues were then removed for quantitative PCR assay using mimic PCR methods. All of the metal ions tested (Cu²⁺, Cd²⁺, Hg²⁺, Ni²⁺, Pb²⁺ and Zn²⁺) were able to induce hepatic MT mRNA levels. Renal MT mRNA levels of Cd²⁺ and Zn²⁺ treated fish was not induced with significant fold induction, however MT mRNA levels in gills were sensitive to the administrations of these metal ions. These data indicated that Tilapia MT mRNA levels in gills and liver are sensitive biomarker of exposure to various metal ions.     

THE EFFECT OF FOUR HEAVY METALS ON THE GROWTH RATE AND CHLOROPHYLL CONTENT OF Chaetoceros muelleri LEMMERMANN

Chaetoceros muelleri Lemmermann was cultured in solution of different concentrations of Cu2 , Pb2 , Zn2 and Cd2 , and in mixtures of any two of them. After 6 days the effect of these heavy metal cations on the growth rate and chlorophyll contents of the diatom were determined and an Opton microscope was used to observe the morphology and size of the cells.The experimental results show that the effects of toxicity of these four heavy metals on Chaetoceros muelleri are: Cu2 >Pb2 >Zn2 >Cd2 . However, the cells did not differ significantly in their morphology and size from the controled ones.In any of the mixed metals cultures, its growth rate came close to and was higher than that of the single metal culture of higher concentration.     

重金属Cu、Pb在泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)卵巢的蓄积特性及其对卵细胞发育的影响

采用静水法生物测试手段,研究了不同浓度梯度Cu、Pb(各0.00、0.10、0.25、0.50mg/L)随时间变化在泥鳅卵巢中的蓄积特性以及对卵细胞发育的影响。结果表明,泥鳅卵巢对Cu、Pb有较强的蓄积能力,在暴露期间20天内,蓄积量与时间呈线性关系,之后呈对数关系。其中,Cu的蓄积显著大于Pb(P0.01);卵巢中重金属的蓄积与水溶液中Cu、Pb的浓度梯度相关(P0.01),具有明显的时间效应和剂量效应。泥鳅卵巢中卵细胞的发育水平,亦与溶液重金属浓度的高低、暴露时间长短有关;在不同浓度重金属溶液中较长时间的暴露,将对卵巢及卵细胞的发育产生不可逆转的负效应。     

极大螺旋藻富积重金属机理的研究

于1993年5月由南京大学藻类培养室提供极大螺旋藻藻种,用Zarrouk培养基培养后,用活藻体和甲醛杀死的藻体分别进行吸附实验;过滤出的藻体置于6×10－3g／L左右浓度的Co2+,Ni2+,Cu2+,Zn2+离子混合液中。结果显示,死、活藻体都具有相似的吸附能力,对Co2+,Ni2+,Zn2+的富积大于203倍,对Cu2+的富积大于185倍;用热水提取、DEAE-纤维素D-23柱和SephadexG－200柱纯化后,获得了纯细胞外壁多糖,其分子量为52kD。将该糖溶液盛在透析袋内,并置于4种离子混合液中进行吸附实验,结果显示,核糖对Co2+,Ni2+,Cu2+,Zn2+的富积倍数分别达1744,1644,1340,1750。藻体和多糖对Co2+,Ni2+,Zn2+的吸附都高于对Cu2+的吸附。比较藻体与多糖对4种离子的吸附结果可见,藻体对离子的吸附主要是多糖的作用;多糖的红外光谱显示,金属离子改变OH和CO－NH的吸收峰,表明这两种基团与金属离子发生了络合作用;对Cu2+的络合滴定测定表明,Cu2+与多糖的结合度为0．40。     

4种重金属离子对彩虹明樱蛤(Moerella iridescens)的急性致毒效应

以彩虹明樱蛤养殖壳高优势组(平均壳高为17.35±1.01mm)为实验动物,进行4种重金属离子Hg2 、Cr6 、Cu2 、Zn2 对彩虹明樱蛤的急性毒性和加和等毒性强度联合毒性试验。结果表明,彩虹明樱蛤对重金属的耐药性均随实验时间延长而缓慢降低,4种重金属离子毒性大小依次为Cu2 、Hg2 、Zn2 、Cr6 ,其对彩虹明樱蛤96h的半致死质量浓度分别为0.0554mg/L、0.1099mg/L、2.2605mg/L、19.6277mg/L;Hg2 、Cr6 、Cu2 、Zn2 离子两两组合在加和等毒性强度下对彩虹明樱蛤96h联合急性毒性所呈现的致毒特征与离子间毒性强度匹配情形密切相关。