鱼类类立克次氏体PCR检测方法的建立及初步应用

根据Gen Bank中类立克次氏体基因的保守序列,设计一对针对鱼类类立克次氏体PCR检测的特异性通用引物,通过对PCR扩增条件的优化,建立快速检测鱼类类立克次氏体的PCR方法,并用该方法对类立克次氏体阳性罗非鱼(Oreochromis nilotica)进行PCR扩增,结果得到与实验设计相符的390 bp的特异性扩增条带,而对健康罗非鱼、乌鳢(Ophiocephalus argus)、海鲈(Dicentrarchus labrax)、中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)及其他对照组的扩增结果为阴性。测序比对结果证实,该PCR方法检测结果准确,最低可检测出约1 pg的类立克次氏体质粒DNA;利用建立的PCR方法,对来自广东、云南、海南、天津、江苏、安徽、湖北等地的252份临床样品进行检测,共检出阳性样品30份,提示该PCR方法可用于类立克次氏体的临床快速检测。     

哈维氏弧菌可视化LAMP快速检测方法的建立及应用

【目的】为加强对哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）的早期快速诊断和筛查,探究一种快速检测方法。【方法】以哈维氏弧菌外膜通道蛋白基因Toic为靶基因,以钙黄绿素为检测结果指示剂,通过对反应体系、反应时间和温度进行优化,并检测其特异性和灵敏度,建立一种针对哈维氏弧菌的可视化环介导等温基因扩增（LAMP）检测方法。【结果】该方法的检测时间最快为35 min,灵敏度为100 fg/mL,特异性强,与8种弧菌及金黄色葡萄球菌均无交叉反应。实用性检测结果显示,该方法可准确并特异性地检测到鱼体组织中感染的哈维氏弧菌。【结论】建立一种设备简单、操作简单、反应快速、特异性强、灵敏度高、结果可视化的哈维氏弧菌LAMP快速检测方法,且适用于石斑鱼（Epinephelus）感染哈维氏弧菌的早期快速诊断,为进一步推广该技术在石斑鱼及其他水生动物哈维氏弧菌感染监测中的现场大规模应用提供技术支撑。     

凡纳滨对虾对虾杆状病毒PCR检测方法的建立及初步应用

根据Gen Bank中公布的对虾杆状病毒(Baculovirus penaei,BP)基因片段序列,设计1对特异性检测引物,建立快速检测凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)对虾杆状病毒的PCR方法。用该方法对BP阳性虾进行PCR扩增,结果得到380 bp的特异性扩增条带,与实验设计相符,而对白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉病毒(TSV)、传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)阳性虾和健康虾的扩增结果为阴性。测序比对结果证实,该PCR方法检测结果准确,最低可检测出约1 pg的病毒DNA。利用建立的PCR方法对来自广东、广西、福建、海南和浙江的2 722份临床病料进行检测,共检出阳性病料133份,表明该PCR方法可用于对虾杆状病毒的临床快速检测。     

哈维氏弧菌PspF基因的克隆及原核表达分析

【目的】对哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)ZJ0603的PspF基因进行克隆与原核表达分析,优化表达条件。【方法】克隆哈维氏弧菌菌株ZJ0603的FspF基因,对其编码蛋白进行理化性质、信号肽、亚细胞定位、二级结构及三级结构分析,构建表达载体pET28a-PspF,经BamHI和XhoI双酶切和测序鉴定正确后转入表达菌株大肠杆菌BL21,对表达重组菌株进行表达条件优化及Western Blot鉴定。【结果与结论】PspF基因的开放阅读框(ORF)全长为1 179 bp,编码336个氨基酸,分子质量为38.04 ku,理论等电点5.27,不稳定系数41.97,总平均亲水性-0.382,PspF蛋白整体表现为亲水性蛋白。成功构建含pET28a-PspF的表达菌株,其最佳诱导条件为37℃下异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)0.2 mmol/L诱导6 h,其表达蛋白为38 ku。Western Blot结果表明PspF重组蛋白成功获得,蛋白同源性高,具有作为抗弧菌病疫苗的潜力。     

哈维氏弧菌qnr基因的克隆及原核表达条件优化

根据Gen Bank中公布的哈维氏弧菌qnr基因序列设计引物扩增哈维氏弧菌qnr序列,将其插入p ET-32a质粒,构建原核表达载体p ET32-qnr,并对诱导温度、时间、IPTG浓度等条件进行优化。结果表明,哈维氏弧菌qnr全长651 bp,编码216个氨基酸;重组蛋白优化条件为于28℃、IPTG浓度为0.05 mmol/L条件下诱导6 h。     

鱼类致病杀鲑诺卡氏菌(Nocardia salmonicida)特异性PCR检测方法的建立

鱼类诺卡氏菌病是全球性的鱼病,杀鲑诺卡氏菌(Nocardia salmonicida)是引起鱼类诺卡氏菌病的主要病原之一。根据杀鲑诺卡氏菌16S-23S转录间隔区(ITS)序列设计引物,建立特异性PCR检测杀鲑诺卡氏菌的方法。结果表明,筛选的PCR引物可特异性地扩增出杀鲑诺卡氏菌的ITS片段,检测灵敏度(DNA浓度)为28.3 pg·μL-1。检测人工感染杀鲑诺卡氏菌的鱼组织,结果显示,该方法可从未分离到病原菌的病鱼组织中检出阳性片段,较传统细菌分离鉴定方法更为高效灵敏。     

哈维氏弧菌GST核酸疫苗制备及其对斜带石斑鱼的免疫保护作用

通过同源引物从致病性哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)ZJ0603基因组中克隆GST的开放阅读框(ORF),构建真核表达质粒pcDNA-GST。大量抽提重组质粒后,于背鳍基部肌肉注射重组质粒免疫斜带石斑鱼(Epinephelus coioides),分析重组质粒的免疫效果。通过核酸水平检测重组质粒在鱼体肝、肌肉、头肾和脾脏组织的分布;用ELISA法检测鱼体血清的抗体水平,用Western-blot检测目的蛋白的表达情况。结果表明:该序列全长615 bp;免疫7 d后,鱼体中均有质粒分布;斜带石斑鱼血清中产生抗GST的高效抗体(1∶4 096);相应的目的蛋白也在鱼体中成功表达。攻毒后,疫苗免疫保护率达80%,表明GST可作为防治哈维氏弧菌病有效候选抗原。     

凡纳滨对虾肠道上皮细胞微胞子虫PCR检测方法的建立与应用

根据Gen Bank中对虾肠道上皮细胞微胞子虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)的基因保守序列,设计一对特异性引物,通过优化PCR扩增条件,建立快速检测凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)EHP的PCR方法。用该方法对EHP阳性虾进行PCR扩增,得到与实验设计相符的330 bp特异性扩增条带,而对白斑综合症病毒(WSSV)、桃拉病毒(TSV)、传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)、对虾杆状病毒(BP)、"棉花虾"微孢子虫、黏孢子虫的阳性虾,以及健康虾的扩增结果为阴性。测序比对发现,PCR产物序列与Gen Bank EHP基因序列的同源性为99.8%,表明该PCR方法检测结果准确。敏感性试验表明,该方法最低可检测出约100 fg的EHP质粒DNA。用该PCR方法检测广东、广西、江苏、山东、海南等地的755份临床样品,共检出阳性样品21份。该PCR方法可用于凡纳滨对虾EHP的快速检测。     

红笛鲷弧菌病血清流行病学研究方法的建立

以红笛鲷Lutjanus sanguineus弧菌病的主要病原菌——溶藻弧菌Vibrio alginolyticus为抗原制备兔抗血清,以辣根过氧化酶标记的羊抗兔血清为酶标二抗,建立了酶联免疫吸附试验检测技术。通过棋盘滴定法测定,得出溶藻弧菌菌悬液的最佳工作浓度为5×108mL-1,兔抗溶藻弧菌血清的最佳稀释度为1∶16000,酶标羊抗兔抗体的最佳稀释度为1∶2000。应用本实验建立的间接双抗体夹心法对红笛鲷进行现场检测,患病红笛鲷特异性抗体的检出率为70%,外观健康红笛鲷的检出率为20%。结果表明,本实验所建立的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测法可以用于红笛鲷弧菌病的血清流行病学研究,而且可以检测出隐性感染状态下的红笛鲷。     

罗非鱼罗湖病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

【目的】建立快速检测罗非鱼罗湖病毒(Tilapia Lake Virus,Ti LV)的RT-PCR方法。【方法】参照GenBank中罗非鱼罗湖病毒全基因序列,依据其假定蛋白基因片段3设计合成1对特异性扩增引物,提取罗湖病毒RNA,逆转录成cDNA,进行PCR扩增,通过优化扩增条件和扩增体系,建立快速检测罗非鱼罗湖病毒的RT-PCR方法。用该方法对自然感染罗湖病毒发病的罗非鱼样品进行RT-PCR扩增。【结果】RT-PCR扩增得到与试验设计相符的499 bp的特异性目的条带,而对健康罗非鱼、野生罗非鱼及其他病毒对照组的扩增结果均为阴性。测序比对结果表明,该方法检测结果准确,最低可检测出约10fg/mL的质粒DNA,具有较好的特异性和较高的敏感性。用该方法对332份临床样品进行RT-PCR检测,其中36份样品扩增出特异性的目的条带,经测序比对,检测结果正确。【结论】建立的检测方法可用于TiLV的检测。     

An extracellular oligopeptide permease may be a potential virulence factor of Vibrio harveyi

An oligopeptide permease A(OppA)was purified from the extracellular product of Vibrio harveyi SF-1.The molecular weight of the purified protein was estimated to be 58 kDa on SDS-PAGE.The purified protein showed phospholipase C activity at the optimal values of temperature 50℃ and pH 8.0.The enzymatic activity decreased when the temperature increased to 40℃.The N-terminal sequence of the purified protein was determined as ADVPAGTKLA,which is similar to that of OppA.The OppA pre-cursor gene was cloned from th...     

溶藻弧菌免疫胶体金快速检测试纸条的制备

采用溶藻弧菌ATCC17749菌体作为抗原免疫新西兰大白兔,制备兔抗溶藻弧菌多克隆抗体;利用柠檬酸钠还原氯金酸法制备胶体金及胶体金-抗体结合物,并将其喷涂在玻璃纤维膜上冷冻干燥;在硝酸纤维素膜上包被兔抗溶藻弧菌多克隆抗体和羊抗兔IgG分别作为检测线和控制线;将处理后的玻璃纤维素膜、硝酸纤维膜、样品垫及吸水纸组装成双抗夹心试纸条,并对试纸条灵敏度、特异性、稳定性进行评价。结果表明,制备的兔抗溶藻弧菌多克隆抗体的效价可达1∶512 000;胶体金溶胶的最佳制备条件为:加入1.8 mL 10 mg/mL的柠檬酸三钠,500 W微波炉中火加热10 min;试纸条检测线和质控线的抗体最佳包被量分别为8.0 mg/mL和1.0 mg/mL;试纸条检测灵敏度为1×106cfu/mL,特异性试验显示,试纸条与哈氏弧菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、拟态弧菌、美人鱼弧菌、弗氏弧菌、河流弧菌、创伤弧菌等8株菌无交叉反应;稳定性试验表明,试纸在4℃干燥条件下能稳定保存5个月以上。制备的溶藻弧菌多克隆检测试纸条可灵敏、较特异地检测源自病鱼的溶藻弧菌,整个检测过程可在10 min内完成,适用于溶藻弧菌的快速检测。     

Construction and characterization of a fosmid library for pathogenic bacterium <Emphasis Type="Italic">Vibrio anguillarum</Emphasis>

Vibrio anguillarum is a common bacterial pathogen in fish.However,little is known about its pathogenic mechanism,in part,because the entire genome has not been completely sequenced.We constructed a fosmid library for V.anguillarum containing 960 clones with an average insert size of 37.7 kb and 8.6-fold genome coverage.We characterized the library by end-sequencing 50 randomly selected clones.This generated 93 sequences with a total length of 57 485 bp covering 1.4% of the whole genome.Of these sequences,58...     

Interaction of haematopoietic tissue cultures of the Dublin Bay Prawn, Nephrops norvegicus (L.), with the causal agent of luminous vibriosis Vibrio harveyi

Vibrio harveyi cells (dose—<10³ cells mL⁻¹) and extracellular products (ECP; >25 μmg mL⁻¹ of total protein concentration) destroyed haematopoietic cultures of Nephrops norvegicus within 24 h of exposure. Cytopathic effects (CPE) started after 4h of exposure to the bacterial cells, with some granularity in the cytoplasm, mostly in cells in the outer periphery of the explant growth. At the end of the infection, a considerable number of nuclei remained attached to the substrate, apparently unaffected. Following exposure to ECP, initial deterioration was observed at 2 h with the presence of granularity in the cytoplasm of<20% cells, and few cells displayed small vacuoles around the nuclei. Parallel results were obtained using whole animal experiments, with V. harveyi cells being lethal to nephrops within 24 h.     

抗草甘磷转基因大豆多重PCR检测及假阳性问题探讨

以大豆病基因类似物(RGA)基因为对照,用RR大豆中的外源CaMV35S启动子、CP4-EPSPS引物,应用多重PCR方法,从RR大豆中扩增出预期大小的DNA片段。结果表明:将扩增产物回收后测序,经同源性分析扩增产物为CaMV35S启动子和CP4-EPSPS的一部分序列;多重PCR检测的灵敏度为0.08%;PCR检测过程中产生假阳性的原因是污染和非特异性扩增。     

Immune response of Pseudosciaena crocea to the injection of Vibrio alginolyticus

For the investigation of anti-infection immune response of Pseudosciaena crocea, 160 healthy fish samples were categorized into infected and control groups. Each individual fish in the infected group was injected intraperitoneally (i.p.) with 0.2 ml bacterial suspension of Vibrio alginolyticus in density of 2×107 CFU/ml, while each individual in the control group was injected i.p. with 0.2 ml sterile saline solution (0.85%). It was observed that the artificial injection of V. alginolyticus significantly inc...     

无菌人工养殖海水中副溶血弧菌噬菌体与宿主的消长动态

在3组一定浓度的副溶血弧菌菌液中分别加入3种浓度的副溶血弧菌噬菌体,第12天各实验组再次分别加入一定浓度的副溶血弧菌或副溶血弧菌噬菌体,比较各组水体中副溶血弧菌噬菌体及其宿主的动态关系。结果表明,副溶血弧菌噬菌体可使宿主下降至一定浓度并与之保持动态平衡关系,实验组1、2、3中副溶血弧菌浓度从2.43×106 mL-1分别下降至6.2×104、9.2×104、7.46×105 mL-1,并以此浓度范围维持下去。高浓度副溶血弧菌噬菌体与其宿主之间平衡关系的稳定性较好,再次加入副溶血弧菌,高、中浓度组分别在1 d和4 d后副溶血弧菌下降至平衡时的数量级浓度,并持续下去。低浓度组副溶血弧菌组有所上升,并持续下去。再次加入副溶血弧菌噬菌体对副溶血弧菌浓度影响较小(P>0.05)。     

融合蛋白IL6-OmpW的质粒构建及表达纯化

以重组质粒pMD18-T/IL6和pMD18-T/OmpW为模板,分别扩增红笛鲷IL-6基因和哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因,运用PCR重叠延伸剪切技术,将IL-6和OmpW基因融合,将融合基因定向克隆到原核表达载体pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白高效表达,融合蛋白分子质量约为66.6 ku。优化后表达条件为温度37℃,IPTG浓度0.2 mmol·L-1,诱导时间5 h。用HisTrap HP亲和柱纯化重组蛋白,最佳咪唑洗脱浓度为400 mmol·L-1,纯化蛋白的质量浓度为480μg·mL-1。Western-blot分析显示,该融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异反应,表明目的蛋白得以正确表达。     

一株溶藻弧菌噬菌体的生理特性研究

对从湛江市水产品批发市场分离得到一株溶藻弧菌噬菌体的生理特性进行测定,结果表明:该株噬菌体噬菌斑12 h直径为1～1.5 mm,对紫外线敏感,暴露在紫外灯(20 W,30 cm)下30 min可丧失全部裂解活性;在pH8～11范围内裂解活性较强,最适pH值为11,裂解周期为65 min,对65℃以上的高温敏感,对乙醚和氯仿有较好的耐受性,对抗病毒药物阿昔洛韦敏感,最大常规稀释度为106CFU/mL,最佳感染复数为10。