鱼类疫苗浸泡免疫策略优化的研究现状

疫苗是一种针对特定疾病并改善免疫者免疫力的生物制剂。疫苗能刺激免疫者的免疫系统产生特异性免疫反应和非特异性免疫反应,提高免疫者的抗病能力,达到免疫保护的效果。浸泡免疫是鱼类特有的免疫接种方法,该方法能简化人工操作、减少工作强度、降低鱼体应激、刺激鱼体的黏膜系统,可在短时间内完成大量的免疫工作。正确的疫苗使用有助于提高疫苗的效果。作者对鱼类黏膜免疫机制、鱼类疫苗浸泡免疫方式、浸泡免疫策略优化的方法、浸泡免疫面临的问题以及浸泡免疫的发展趋势等进行综述,以期为鱼类病害防治和鱼体免疫增强的研究提供新思路和新策略。     

综述:对虾弧菌病及其免疫预防的研究进展

弧菌病是影响对虾养殖业最为常见、危害较重的一类疾病。其症状一般为红腿、黄鳃、烂尾、烂眼、甲壳溃疡、肌肉白浊等 ,常伴有败血症。副溶血弧菌Vibriopara haemolyticus是人们发现最早的对虾病原弧菌 ,随后溶藻弧菌V .alginolyticus,鳗弧菌V .anguillarum ,哈维氏弧菌V .harveyi,创伤弧菌V .vulnificus等十多种致病弧菌陆续被发现 ,但其致病机理仍未查清。多年来弧菌病主要采用抗生素治疗 ,但抗生素治疗带来一系列严重后果 ,主要是产生耐药菌株 ,造成水体污染 ,破坏虾体免疫力 ,因此探索新的治疗途径势在必行。以提高虾体自身免疫力的免疫预防研究是当前研究的热点之一 ,它以无毒无副作用 ,不会造成环境污染等优点而显示出广阔的前景。弧菌疫苗的研制已获初步成功 ,疫苗有灭活疫苗和减毒疫苗两种。免疫方式有浸泡、口服、注射和喷雾等 ,注射方式效果最佳但费时费力且易损伤虾体 ,浸泡疫苗需要量大 ,故探索一条好的免疫方式是当前工作的重点。要进行对虾的免疫预防研究 ,必须了解对虾的免疫机制 ,一般认为虾类的免疫主要以非特异性免疫为主 ,血细胞和酚氧化酶系统在其中起着重要作用。对弧菌病的病原、病理、诊断、对虾的免疫机制及免疫预防等方面的研究进展及趋势作一回顾     

创伤弧菌疫苗对青石斑鱼的免疫学效应和安全性

弧菌病是海水网箱养殖石斑鱼Ｅｐｉｎｅｐｈｅｌｕｓ主要疾病之一。本文利用致病菌──创伤弧菌Ｖｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ强毒菌株制备出安全性很高的福尔马林灭活疫苗（ＦＶ）和热灭活疫苗（ＨＶ）。这两种疫苗无论使用佐剂与否，通过肌肉注射接种青石斑鱼Ｅ．ａｗｏａｒａ都能使鱼体在较短时间内产生较强的体液免疫应答，而且抗体效价能维持较长时期。免疫后的青石斑鱼获得了良好的免疫保护力。     

硬骨鱼免疫系统的组成与免疫应答机制研究进展

硬骨鱼是最低等的兼具固有与适应性免疫系统的脊椎动物。文章分别就硬骨鱼免疫系统的组织结构与细胞组成、主要免疫细胞的特性与功能以及抗原诱导的固有与适应性免疫应答等方面概括了近年来的主要研究进展。在与哺乳类等高等动物免疫系统比较异同的基础上,概括出硬骨鱼免疫系统所具有的基本特征:1)鱼类在免疫基因、细胞与功能上较为保守,在免疫器官形态和结构上差异较大;2)鱼类具有完全的固有与获得性免疫应答体系,但其固有免疫作用可能更为重要,主要表现在胚系基因编码受体的种类与抗原识别范围更广,应答启动条件相对较低而免疫效应则相对强化;3)鱼类获得性免疫组成与结构较为简单,获得性免疫应答的发生相对滞后,应答效能较低。硬骨鱼免疫系统的组成与功能特性与其自身所处的环境和变温性质密不可分。     

鱼类DNA疫苗的研究进展

DNA疫苗是编码免疫原或与免疫原相关的真核表达质粒DNA(或RNA),它可经一定途径进入动物体内,被动物宿主细胞摄取后能转录和翻译表达出抗原蛋白,此抗原蛋白能够刺激机体产生非特异性和特异性两种免疫应答反应,从而起到免疫保护作用。1990年,Wolff等给小鼠骨骼肌肉直接注射纯化的质粒DNA,可使载体上的基因在小鼠骨骼肌中表达,这种表达可持续数月,甚至持续终生,且没有检测出注射的外源DNA与宿主染色体整合。     

栉孔扇贝Smad基因家族的表达特征和对鳗弧菌侵染的免疫应答分析

栉孔扇贝是我国海水养殖业的重要品种之一,但养殖扇贝陆续暴发大规模细菌性疾病,造成了巨大的经济损失。深入研究扇贝的免疫防御机制,是改良种质、培育抗病品系的必要措施。近年来研究发现,Smad基因可以通过调控增强子结合蛋白(CEBP/ε)来促进中性粒细胞的成熟和功能极化,在引发脊椎动物的先天免疫调节中发挥着重要的作用。然而目前对于Smad及其在免疫中的作用的研究大都集中于脊椎动物中,在海洋贝类中的研究还较为匮乏。因此,对栉孔扇贝的Smad基因家族进行了系统发生、共表达网络的构建、以及鳗弧菌侵染的免疫应答分析,以解析贝类Smad基因家族的表达调控机制和在免疫应答中的作用。结果表明,Smad3和Smad6可能在两侧对称动物的共同祖先中位于同一染色体上;栉孔扇贝Smad5与Toll样受体信号通路的关键基因协同表达;受鳗弧菌侵染后,血淋巴中的Smad5显著上调,说明Smad5基因可能通过与Toll样受体信号通路相互作用,参与了机体的免疫应答。研究结果可为深入研究贝类Smad基因在天然免疫系统中的作用提供重要参考。     

禽流感病毒抗原表位分析及H5N1亚型基因工程疫苗设计

以亚洲地区H5N1亚型禽流感病毒(Avian Influenze Virus)流行株为研究对象,利用计算机软件,对同源性较高的HA1(Hemagglutnin,HA,血凝素)和NP(Nucleocapsid protein,核衣壳蛋白)进行全基因序列分析,优选出HA1蛋白的主要T细胞表位和B细胞表位,以及NP蛋白的主要CTL(Cytotoxicity T lymphocyte,细胞毒性T淋巴细胞)表位.依据这些优选表位,设计了禽流感病毒H5N1亚型基因工程疫苗.构建了基因工程疫苗表达载体pRSET-AIV,外源基因能够在大肠杆菌表达系统中得到良好表达.表达产物免疫小鼠后,血清中IgA和IgG抗体水平明显上升,在体外培养脾细胞可产生IL-2、IL-4和IFN-γ细胞因子.验证了该H5N1亚型基因工程疫苗的抗原性,证实该基因工程疫苗在免疫小鼠体内激发体液免疫的同时调动了细胞免疫.     

大菱鲆对迟缓爱德华氏菌的免疫应答

用制备的迟缓爱德华氏菌灭活全菌和主要外膜蛋白(OMP)对大菱鲆进行腹腔注射及肛门灌注免疫,以Ig+细胞数量及血清抗体效价为指标,评价和比较大菱鲆对不同抗原的免疫应答水平.结果显示,注射2种抗原后,外周血中Ig+细胞数量及血清抗体效价均呈明显增加趋势,注射OMP大菱鲆的外周血Ig+细胞数量及血清抗体效价不显著低于注射灭活全菌大菱鲆(外周血Ig+细胞:P=0.390;抗体效价:P=0.300);肛门灌注2种抗原后,大菱鲆外周血和后肠中Ig+细胞数量及血清凝集效价亦均呈增加趋势,灌注OMP大菱鲆后肠、外周血中Ig+细胞数量和血清抗体效价均不显著高于灌注灭活全菌大菱鲆(外周血Ig+细胞:P=0.056;后肠Ig+细胞:P=0.163;抗体效价:P=0.195).结果表明,注射和肛门灌注迟缓爱德华氏菌灭活全菌和OMP均能够诱导大菱鲆产生针对迟缓爱德华氏菌的特异性免疫应答.本文结果对鱼类疫苗的研制具有参考价值.     

壳聚糖的纳米载体应用于口服蛋白类药物/疫苗递送的研究

近年来,细菌性和病毒性的传染性疾病已成为制约水产鱼类养殖业发展的瓶颈。口服免疫因其对鱼体操作方便、无损失、不受时间地点及鱼体大小的限制近年来得到了广泛的关注。然而口服免疫因疫苗在通过鱼的胃肠道时易被消化酶降解,导致免疫效率低下。因此,随着纳米技术的迅速发展,基于壳聚糖的纳米载体与水产疫苗的有效结合在鱼类口服免疫领域越来越受到重视。本文利用离子交联法和聚电解质凝聚法分别合成了壳聚糖纳米粒(CS-NPs)和壳聚糖/羧甲基壳聚糖复合纳米粒(CS/CMCS-NPs),其平均粒径分别为(178±6.27)和(255±7.54)nm,zeta电位分别为(+16.4±0.51)和(+15.9±0.37)mV。纳米粒对模式蛋白药物牛血清白蛋白(BSA)的包封率分别为(42.9±1.2)%和(59.4±3.2)%。红细胞溶血试验及MTT试验表明相较于CS-NPs,CS/CMCS-NPs具有更好的生物相容性。以荧光染料Cy5.5对纳米载体进行了荧光标记来评价Caco-2细胞对荧光纳米载体的摄取,结果表明,在一定浓度和时间范围内,Caco-2细胞对纳米粒的摄取存在一定的浓度依赖性和时间依赖性。为了研究纳米载体所包载的蛋白类药物在大菱鲆体内的分布情况,以FITC对BSA进行荧光标记,口服灌胃大菱鲆36h后,对于FITC-BSA:CS-NPs组,荧光药物主要分布在肝脏和前肠中;对于FITC-BSA:CS/CMCS-NPs组,荧光药物主要分布在后肠、肝脏和脾脏中;作为对照组的FITC-BSA组,在肝脏中的荧光分布最强,由此可见,CS/CMCS-NPs能够更有效的保护药物到达大菱鲆的后肠,有望成为一种安全有效的口服蛋白疫苗运送载体。     

创伤弧菌疫苗对青石斑鱼的免疫学效应和安全性

弧菌病是海水网箱养殖石斑鱼Ｅｐｉｎｅｐｈｅｌｕｓ主要疾病之一。本文利用致病菌－创伤弧菌Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ强毒菌株制备出安全性很高的福尔马林灭活疫苗（ＦＶ）和热灭活疫苗（ＨＶ）。这两种疫苗无论使用佐剂与否，通过肌肉注射接种青石斑鱼Ｅ．ａｗｏａｒａ都能使鱼体在较短时间内产生较强的体液免疫应答，而且抗体效价能维持较长时间。免疫学的青石斑鱼获得了良好的免疫保护力。     

基于RNA-seq数据分析长牡蛎(Crassostrea gigas)天然免疫的可变剪接事件

大部分无脊椎动物缺乏基于经典抗体和记忆细胞的适应性免疫, 因而天然免疫在无脊椎动物免疫防御中发挥不可或缺的作用。可变剪接正是产生天然免疫多样性和特异性的重要途径。牡蛎(Crassostrea)是全球范围内的大宗养殖贝类和我国产量最高的海水养殖贝类, 理解其天然免疫系统的多样性和特异性对牡蛎病害防治和养殖业健康可持续发展至关重要。通过对不同病原诱导以及诱导后不同时间的转录组进行生物信息分析, 系统地研究了长牡蛎天然免疫应激反应的可变剪接事件。发现在弧菌诱导下可变剪接事件的总数显著增加, 表明弧菌的感染会诱导长牡蛎可变剪接事件的产生。对病原诱导后可变剪接体的组成类型及表达量显著变化的基因的功能富集分析, 表明免疫系统相关功能被显著富集, 病原感染不同阶段以及不同病原感染后可变剪接体的组成类型和表达量均不一致, 表明长牡蛎免疫系统可通过可变剪接产生免疫响应的特异性和多样性。研究结果为长牡蛎等无脊椎动物天然免疫多样性和特异性提供了典型实例, 也为长牡蛎病害防御提供了理论支撑。     

甲壳动物JAK/STAT信号通路在免疫应答中的功能与调控机制

先天免疫是宿主抵抗病原感染的第一道防线,在病原的传播和疾病的发展过程中发挥重要的作用。甲壳动物属于无脊椎动物,仅具有先天免疫,而不具备适应性免疫,其主要依靠细胞免疫和体液免疫来实现免疫防御功能,抑制病原体增殖。JAK/STAT途径是调节无脊椎动物免疫反应的主要途径之一,本文主要从细胞因子受体(Dome)、JAK酪氨酸激酶(JAK)、信号传导及转录激活因子(STAT)、调节因子的结构、在宿主体内的表达及发挥的功能等来综述在养殖甲壳动物中JAK/STAT信号通路的研究现状。目前已在对虾、螯虾和蟹等近十种甲壳动物中报道了此通路的元件,而且各元件均具有保守的典型结构域,同类元件在不同种类甲壳生物中的结构有所差异,但是功能基本相似。这些元件均被证实通过调节JAK/STAT通路的信号转导来影响抗病能力。目前仅在凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）中鉴定出JAK/STAT信号通路的所有元件,对其他甲壳动物中剩余元件的鉴定仍有必要,并且甲壳动物JAK/STAT信号通路对其他信号通路的影响还有待深入研究。通过本文希望能为该通路在甲壳动物中调控机制研究提供理论基础和参考。     

富含半胱氨酸肠蛋白的研究进展

富含半胱氨酸肠蛋白是一种含双锌指结构的小分子蛋白，其在锌离子转运、个体发育、免疫防御以及肿瘤发生等多种生理过程中发挥重要作用。作者主要对富含半胱氨酸肠蛋白的结构特点及其在发育和免疫方面的研究进展进行系统概述，并指出其相关作用机制尚待深入研究。     

对虾鳗弧菌卵黄抗体(IgY)的制备及其对人工感染的保护研究

以纯培养的鳗弧菌作为抗原,探讨对虾鳗弧菌(Vibrio anguillarum)卵黄抗体(IgY)的制备技术,以及IgY在对虾体内的代谢及对人工感染和自然感染弧菌病的保护作用。结果表明:鳗弧菌对蛋鸡有较好的免疫原性,产蛋鸡经免疫后,血清与卵黄中很快出现抗体,而且卵黄中的抗体水平要高于血清中的抗体水平。IgY对鳗弧菌的感染有可靠的保护作用,IgY经口服后很快到达直肠,继而血淋巴、肝胰脏中也出现抗体,并可持续12~24 h;投喂IgY的试验组对虾在7 d内的死亡率为15%,极显著地低于对照组对虾的同期死亡率(为60%)。     

大菱鲆趋化因子CCL34基因的鉴定及其响应细菌感染的表达特征

为了研究大菱鲆(Scophthalmus maximus)中趋化因子(Chenokine)的特征及其在大菱鲆免疫过程中发挥的作用,设计了本文中的实验。本实验从大菱鲆基因组和转录组数据库中鉴定了一个硬骨鱼特有的趋化因子CC亚家族成员—CCL34,并选取大菱鲆的8个健康组织以及2种细菌感染后的肠道和皮肤组织,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对其表达特征进行研究。序列分析结果显示该趋化因子全长mRNA包含1个327 bp的5’非编码区(UTR),1个246 bp的3’非编码区,和1个编码103个氨基酸残基长度为312 bp的开放阅读框(ORF)。此CCL34基因含有4个外显子和3个内含子。通过系统发育分析、共线性分析,将该大菱鲆趋化因子命名为CCL34。实时荧光定量PCR表明CCL34在大菱鲆健康组织中普遍表达,尤其在肾脏、肝脏、皮肤中有高水平表达。鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)感染后,肠道组织CCL34基因表达量较对照组显著性上调(p<0.05),这表明CCL34可能在大菱鲆的肠道粘膜免疫中起重要作用。本研究为趋化因子家族功能的研究奠定了基础,为增强鱼类免疫力和抗病能力提供了理论依据。     

罗氏沼虾线粒体锰超氧化物歧化酶的克隆表达与功能研究

罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)是我国重要的经济虾类之一。近年来, 细菌性感染造成罗氏沼虾养殖业病害频发, 经济损失巨大。因此了解其免疫机制对于指导疾病防控至关重要。线粒体锰超氧化物歧化酶(mitochondrial manganese superoxide dismutase, mMnSOD)被认为是抵御氧化应激的第一道防线, 在先天性免疫中具有至关重要的作用。目前, 甲壳动物中mMnSOD的免疫功能尚不清楚。为此, 本研究克隆了罗氏沼虾mMnSOD基因(mMnSOD of M. rosenbergii, MrmMnSOD), 制备了多克隆抗体, 分析了嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染下, MrmMnSOD在不同组织中的表达模式。结果显示, 肝胰腺和肠组织中MrmMnSOD的基因表达水平分别在感染后3h和6h达到最大; 组织免疫荧光分析显示, 肝胰腺和肠组织中MrmMnSOD均在感染后12h达到最大荧光强度。以上结果表明, mMnSOD参与了罗氏沼虾对嗜水气单胞菌的免疫应激反应。进一步的蛋白抑菌实验表明, MrmMnSOD可显著抑制大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的生长, 推测该蛋白可能属于免疫相关分子, 可通过抑菌反应发挥免疫功能。当前的研究结果进一步丰富了甲壳动物先天性免疫基础理论, 也可为今后罗氏沼虾的病害防控和药物研发提供新的靶点参考。     

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)丝氨酸蛋白酶同源物基因(Fc-SPH)的重组表达及活性分析

以实验室前期克隆到的中国明对虾丝氨酸蛋白酶同源物基因(Fc-SPH)(GenBank登录号:DQ318859)为基础,利用原核表达系统对Fc-SPH基因成熟肽区域进行了重组表达和纯化复性分析,并对获得的重组目的蛋白开展了抑菌活性及微生物清除功能研究。结果表明:在体外成功获得了大量有活性的对虾Fc-SPH蛋白(rFc-SPH),活性研究显示rFc-SPH对大多数受试菌种都有明显的抑制效果,并可以加速中国明对虾清除体内外源微生物的速度。作者推断Fc-SPH即可以作为一线防御应答效应物直接参与虾类的先天免疫活动而发挥作用,也可以通过调理作用促进血细胞对病原微生物的吞噬和杀灭。     

Impact of polychlorinated biphenyls (PCBs) on the immune function of fish: age as a variable in determining adverse outcome

Polychlorinated biphenyls (PCBs) are a major contaminant of global extent in water resources and aquatic biota. Due to its high lipid solubility, PCBs fail to be degraded and, therefore, continue to bioaccumulate throughout the environment and food chain. To determine the impact of PCBs on the immune system of aged and juvenile Japanese medaka (Oryzias latipes), fish were injected with the coplanar PCB congener 126 and examined after 3 and 14 days. PCB 126 produced oxidative stress in both age groups of fish 14 days post-injection; however, juvenile medaka appeared more susceptible than aged fish. Humoral immunity, as determined by antibody forming cell (AFC) numbers, was significantly depressed for up to 14 days post-injection in both age groups. These results demonstrate the sensitivity of the fish immune response for predicting PCB-induced immunotoxicity and identify age as a variable in determining adverse outcome.