新月细柱藻的分离培养及形态和分子鉴定

自胶州湾分离培养2株微藻(MGB0401和MGB0402)。经形态学鉴定为新月细柱藻(Cylindrotheca closterium)。MGB0401和MGB0402的18S核糖体RNA基因(rDNA)扩增片段长度为1775 bp,存在10个碱基差异。MGB0401和MGB0402的rbcL基因扩增片段长度为1190 bp,有45个碱基差异,对应的氨基酸序列存在4个氨基酸残基差异。系统学分析表明,2株微藻与已知新月细柱藻相应序列亲缘关系最近。微藻常用系统学分析用基因的序列不仅是分类鉴定的补充指标,也是不同研究结果相互比较的重要基础。     

新月细柱藻（Cylindrotheca closterium）种复合体研究

研究并建立采自胶州湾的11株大小存在差异的新月细柱藻单克隆培养体系。对其核编码的SSU rDNA基因和叶绿体编码的rbcL基因进行了克隆和测序。序列分析表明，11株C．closterium的SSU rDNA基因和rbcL基因存在很大的序列变异。依据rhcL基因核苷酸序列推导的氨基酸残基变异则明显小于核苷酸变异。分别通过两基因核苷酸序列构建的邻接（Neighbor joining，NJ）系统发育树将11株C．closterium分成相同的6个分支（clade）。通过SSU rDNA基因构建的NJ树将所有的细柱藻聚为一支。SSU rDNA基因NJ树将细柱藻分为2个明显的支系（lineage）：支系Ⅰ由12株C．closterium组成，包括本实验分离到的全部11株C．closterium，该支系中部分节点没有得到较高的支持率（〈50％）；支系Ⅱ包括2株C．closterium和1株C．fusiformis。在rbcL基因NJ树中细柱藻也形成2个支系，11株C．closterium组成1个支系，系统树中每个节点均得到很高的支持率（〉70％）。统计分析表明，支系Ⅰ中株系间的平均遗传距离高于其它微藻种的种内变异程度，差异极显著（P〈0．01）。上述分析结果证实C．closterium实际上是1个种复合体（species complex），可以被细分为若干个种。     

高浓度小新月菱形藻保存方法的研究

对小新月菱形藻(Nitzchia closterium f.minutissima)的保存方法进行了研究,试验证明,小新月菱形藻用不同的方法保存3个月,其最高存活率分别为:(1)在20℃下,15.0%的SAM8组为76.4%,1.5%的抗生素组为54.6%,0.1%的防腐剂组为45.3%,对照组仅为35.4%.(2)在0℃下,10.0%的SAM8组为98.4%,1.5%的抗生素组为78.8%,0.1%的防腐剂组为63.1%,低于对照组(65.5%).(3)-30℃下,10.0%的DMSO组为84.6%,10.0%的甘油组为83.1%,对照组为46.0%.为微藻的浓缩保存提供了新的方法.     

高浓度NO对小新月菱形藻生长影响的初步研究

以小新月菱形藻为实验对象,从化学角度研究了加入高浓度一氧化氮(nitric oxide,NO)对其生长的影响。结果表明:(1)一次性加入不同浓度NO时,1.4μmol/L NO对微藻生长有促进作用;7,14,28和42μmol/L的NO对微藻生长起抑制作用,并且NO浓度越大,抑制作用越明显。(2)每天一次加入不同浓度NO时,1.4~42μmol/L的NO对微藻生长起不同程度的抑制作用,且微藻生长周期缩短。藻的生长曲线由S型变成峰型;加入42μmol/L NO,在100 h内完全抑制了微藻的生长。(3)通过进一步检测外加NO在藻液中的浓度变化,结果表明采用2种不同加入方式时,1.4μmol/L NO对藻生长分别起促进和抑制作用,这是由于NO的不断衰变造成的。     

NaHCO3浓度对塔胞藻、小球藻和新月菱形藻生长的影响

在温度为 ( 2 2± 1 )℃ ,盐度为 2 8的条件下 ,用不同浓度的NaHCO3( 0 ,1 0 0 ,2 0 0 ,40 0 ,80 0 ,1 2 0 0和 1 60 0mg/L)对青岛海洋大学微藻种质库保存的塔胞藻 (Pyramidomonassp.)、小球藻 (Chlorellaspp .)和新月菱形藻 (Nitzschiaclosterium )进行培养。实验结果表明 ,NaHCO3浓度对 3种海洋微藻生长的影响差异显著 ,经过 6d的培养 ,塔胞藻和小球藻的细胞浓度都在NaHCO3浓度为 1 2 0 0mg/L时达到最大值 ;新月菱形藻的细胞浓度在NaHCO3浓度为 40 0mg/L时达到最大值。     

NaHCO3浓度对塔胞藻、小球藻和新月菱形藻生长的影响

在温度为(22±1)℃,盐度为28的条件下,用不同浓度的NaHCO     

赤潮拟菱形藻形态学分类和分子生物技术鉴定研究概述

近年来,随着环境的恶化和人类对环境监测重视程度的提高,有关赤潮爆发的报道频繁出现。特别是关于有害藻赤潮(Harmful Algal Blooms)发生地域、频率、密度及其危害的报道日渐增多,人们的注意力开始集中在对有害赤潮藻的控制上。这就需要对控制有害赤潮藻的生态和环境方面的参数有更好的了解。相应的,在赤潮发生中对有潜在产毒能力的赤潮藻的监测也成为研究的热点。     

基于ITS序列分析的赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)分子鉴别

对五株赤潮异弯藻核糖体转录单元内间隔区(ITS区)进行了PCR扩增和序列测定,并结合GenBank中收录的所有赤潮异弯藻ITS序列信息,比较了它们的遗传距离和相似系数,同时结合GenBank中发布的针胞藻纲其他三个属的代表种ITS序列信息,采用邻接法(neighbour-joining,NJ)和最小进化法(minimum evolution,ME)构建系统发育树。结果表明,五株赤潮异弯藻ITS全序列总长度及碱基组成完全一致,均为538 bp,与GenBank中收录的四株赤潮异弯藻仅有一个碱基不同,遗传距离和相似系数分别为0.002和0.980,而与其他赤潮异弯藻ITS序列完全相同,遗传距离和相似系数分别为0.000和1.000。用两种方法构建的系统发育树结构完全一致,赤潮异弯藻属与海洋卡盾藻属亲缘关系较近,而与另外两属的亲缘关系较远。     

海南岛海洋绿藻新记录种未氏仙掌藻(Halimeda velasquezii)的形态学与分子系统学分析

2019年4月在海南岛冯家湾潮间带的野外调查过程中采集到一种仙掌藻, 利用传统形态分类学与分子系统分类学结合的方法, 将该种鉴定为未氏仙掌藻Halimeda velasquezii W.R. Taylor。该种的形态特征为藻体呈绿色钙化, 直立生长, 固着器单一较小, 由横卵形或肾形节片连接形成, 节片表面观形态为近圆形, 内部为管状髓丝, 节点处髓丝多发生侧面成对融合, 皮层下髓丝末端无囊状膨大。1,5-二磷酸核酮羧化酶/氧化酶大亚基基因(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit, rbcL)的序列分析结果显示, 在系统发育树上, 本研究样本与印度洋-太平洋地区产的未氏仙掌藻处于同一分支, 且自展支持值为100, 碱基基因差异为9bp (0.69%)。该种在海南岛海域首次被发现, 为新记录种。本研究同时首次提取并分析了中国种群的rbcL基因序列, 丰富了该种的中国种群的生态学知识, 扩展了其地理分布范围, 对了解海南岛海域海藻资源的生物多样性及其分布特征具有重要意义。     

篮子鱼内脏粗提液制备长心卡帕藻和细齿麒麟菜原生质体的初步研究

于2011年9月至2013年1月,在海南陵水热带海藻实验基地,利用篮子鱼(Siganus fuscessens)内脏研磨制备消化酶,开展了酶解制备大型产胶红藻长心卡帕藻(Kappaphycus alvarezii)和细齿麒麟菜(Eucheuma denticulatum)的原生质体研究,观察了不同酶解条件对两种产胶海藻原生质体产量和产率的影响。结果表明,细齿麒麟菜原生质体得率高于长心卡帕藻;在藻泥与酶浓度配比中,长心卡帕藻或细齿麒麟菜藻泥越多,所制备出的原生质体产量越高,而其制备效率却越低;在温度(20~30℃)梯度中,有最高原生质体产量和效率的酶解温度为25℃;在pH 6.0~8.0的实验酶解梯度中,酶解pH 6.0时的酶解效果最好;在12~48 h实验酶解时间梯度中,酶解时间为48 h时原生质体产量和得率最高;酶解时间越长,长心卡帕藻或细齿麒麟菜原生质体制备效率越高。为此建议在25℃和pH6.0条件下,适当增加海藻藻泥用量和延长酶解时间,以更有效获得原生质体。     

不同培养基对筒柱藻Cylindrotheca fusiformis生长及脂肪酸组成的影响

在温度为22±1℃,盐度为28的条件下,同不同培餐基对青岛海洋大学微藻种质库保存的简柱藻Cylindrotheca fusiformis造行培养,测定了细胞的生长情况及脂肪酸组成.实验结果表明,用8F培养基((F/2培养基的16倍)培养5天后,达到的细胞密度最大(376.56×104细胞/mL).用2F培养基培养,EPA含量最高(占总脂肪酸的18.1%).细胞生长较好、EPA含量最高、成本较低的培养基是2F培养基.     

基于18S和ITS-5.8S rDNA基因序列的白色霞水母(Cyanea nozakii)的分子鉴定与检测

采用通用引物PCR扩增法,测定了辽东湾海域的白色霞水母(Cyanea nozakii)螅状体、碟状体及水母体的18S以及ITS-5.8S r DNA序列,同时利用Gene Bank数据库中已有同源序列对其进行序列分析及系统分析。结果显示,白色霞水母3个个体的18S和ITS-5.8S r DNA序列完全一致。白色霞水母样品的ITS-5.8S r DNA序列与Gen Bank中未知真核生物的序列高度相似(≥99%),推测该物种可能是早期发育阶段(卵、浮浪幼虫或碟状体)的白色霞水母样品。霞水母属不同种间18S r DNA序列经比对后同源序列长度为1709bp,多态位点数33个;比对后ITS1同源序列长度为368bp,其中变异位点203个,简约信息位点数178个,单变异位点21个。基于18S r DNA基因序列的霞水母属种内和种间平均遗传距离分别为0、0.008,而基于ITS1序列的霞水母属种内和种间平均遗传距离分别为0.019、0.284。基于ITS1的种间遗传距离是种内遗传距离的15倍,适合于进行物种鉴定。NJ系统树的结果也表明同种的不同个体各自聚枝,其聚类结果大致与形态分类吻合。研究表明,ITS基因片段在霞水母不同种间变异较大,更适于大型水母种类鉴定、检测及属内种间水平的系统进化研究。     

利用18S rDNA分子方法分析浒苔绿潮过境期间长牡蛎摄食情况的变化

近年来,我国海州湾浒苔暴发呈常态化趋势发展,日益威胁到该海域生态系统的健康。浒苔每年都会由南向北漂移经过平岛海域,在平岛海洋牧场中牡蛎是其重要的经济贝类,具有数量多、分布广、生态种群稳定等特点,浒苔对海洋牧场中这种滤食性经济贝类的影响亟待了解。使用传统的显微镜检测方法并不能准确鉴定出胃含物中有机物碎片成分,而应用DNA条形码技术则可以快速有效的判断这类摄食者的食物碎片来源。在本研究中,采集了浒苔发生前后不同时间的海州湾平岛海域特定区域的牡蛎。通过高通量DNA测序技术研究了其真核食物成分。扩增18S r DNA V4区共得到53347个有效序列短片段,聚类后得到105个类别,主要属于链形植物门(包括轮藻门和有胚植物(现存的陆生植物:苔藓维管植物)两大类)、绿藻门、囊泡虫门、子囊菌门等。其中,5月(WH1)、6月(WH2)、7月(WH3)、10月(WH4)的胃含物样品中分别发现了11、12、11和14个门的生物种类。进一步对WH1—WH4样品属水平进行聚类分析发现真核生物成分表现出显著的季节性差异,但在所有组当中并未发现石莼属或浒苔属成分。WH1样品中梨属和四胞藻纲含量最多。WH2样品中的子囊菌属和稻属含量均为4个样品中的最高值。WH3中共甲藻目的含量达到最高。WH4样品中沟鞭藻属的含量达到最高值。研究表明,牡蛎并没有直接摄食浒苔或石莼属成分,因此推断浒苔并不直接影响牡蛎的摄食情况。另外本研究首次发现被子植物在牡蛎胃含物中占有很高的比重,表明牡蛎食物源除来源于海洋外还有陆源有机质。     

珠江河口铜、铅、锌、铬和镉对单细胞藻类生长的影响

通过现场采水样和实验室模拟,研究珠江河口环境在一连串变化过程中,当各种浓度的Cu,zn,Pb,Cr和Cd单独存在或共存时,对单细胞藻类——硅藻和扁藻的毒性影响。     

鱼类生长激素的分子生物学和应用研究的进展

依据１９８５－１９９５年国际有关资料对鱼类生长激素的分子生物学及其研究的最新成果与进展进行综合评述。研究表明，已完成鳗鲡等９种鱼类生长激素的氨基酸组成与全序列分析及大麻哈鱼等２０种鱼类的生长激素基因的分离与克隆，有些已在工程菌或动物细胞中的高效表达；鱼类生长激素基因的调控机制与生长激素的活性部位研究正在深入进行；将外源的生长上入鱼体或将外源的生长激素基因导入受体鱼，以期促进生长，增加抗性，是生长激     

不同引物扩增对东海陆架沉积物真核微型生物多样性的影响

采用三对通用引物(ITS1/ITS4,EF3/EF4,NS1/NS4)检测其对东海陆架DH-13站点表层沉积物真核微型生物的扩增特异性和多样性差异。对323个有效克隆子进行OTU分型和多样性分析,结果表明,NS1/NS4引物扩增所获得的文库多样性最高,EF3/EF4其次,ITS1/ITS4最后。通过NCBI比对和分类学研究,发现优势种群主要为原生生物界,包括丝足虫门(Cercozoa,占所有OTU的36.4%)、横裂甲藻纲(Dinophyceae,占14.2%)、不等鞭毛门(Stramenopiles,占7.4%)和纤毛虫门(Ciliophora,占6.3%);另含部分真菌界如子囊菌门(Ascomycota,占7.4%)和壶菌门(Chytridiomycota,占6.3%)。原生生物方面,NS1/NS4引物表现的多样性最高,适合于扩增丝足虫门、横裂甲藻纲和不等鞭毛门,并扩增到独有的眼虫门(Euglenozoa)、隐藻门(Cryptophyta)和顶复门(Apicomplexa);ITS1/ITS4适合于扩增甲藻和纤毛虫门;EF3/EF4则适合于丝足虫门。真菌方面,ITS1/ITS4适合于扩增子囊菌门;EF3/EF4适合于子囊菌门和壶菌门,而NS1/NS4适合于壶菌门。系统发育分析表明,三对引物的原生生物系统树中的相似序列多来自海洋环境样品,真菌序列则分别来自陆地土壤真菌和海洋真菌,说明三对引物更适合于海洋沉积环境微型原生生物的分子生态分析。     

赤潮叉角藻18SrDNA和ITS区序列测定与分析

采用PCR及克隆测序的方法，对1998年引发渤海赤潮的叉角藻18SrRNAadldey DNAITS区（Internal Transcribed Spacer Regions)进行了序列测定与分析。并通过因特网从国际分子生物学数据库中获取甲藻另外15个种的18rDNA序列，以Tetrahymena corlissi作为类群，分别采用Neighbor-Joining和Fitch方法构建甲藻较为一致和可靠的进化树图，探讨具有高度多样性和在分类上争议较多的甲藻各类群之间的形态与分子进化关系。结果表明，Prorocentrum(有2个简单的壳板）出现得较早，而大多数多甲藻目（覆盖着多个壳板）、裸甲藻目（大多数不具壳板）和膝沟藻目的成员较晚出现。另外，对叉角藻ITS区的分析表明，ITS区为高变区，是良好的分子标记，可用于叉角藻快速鉴定的专一性核酸分子探针的研制。     

五种/株原甲藻核糖体小亚基(18S rRNA)基因克隆及序列分析

采用分子克隆及序列比对的方法,对五种/株赤潮原甲藻18SrRNA基因全长序列进行扩增、克隆和序列测定,并从GenBank上下载13个原甲藻18SrRNA基因接近全长的序列,用NJ法和ME法构建了原甲藻属的系统树。结果表明,五种/株原甲藻18SrRNA基因扩增序列长度为1782—1783bp,其中来自南海(中国海域)和来自美国海域的两株微小原甲藻(Prorocentrumminimum)的序列完全一致;东海的赤潮原甲藻(Prorocentrumsp·)与具齿原甲藻(P·dentatum)的序列也完全一致,与微小原甲藻只有5个碱基的差异;而海洋原甲藻(P·micans)与微小原甲藻和具齿原甲藻的序列差异较大,分别为27个和28个碱基。通过NJ法和ME法构建的系统树基本一致。由系统树可以看到:原甲藻属大致分为两支,本实验的微藻全部分布在同一支上。18SrRNA基因序列还将有助于有害赤潮藻快速鉴定的特异性分子探针的研制。     

山东半岛南北两侧海域真核浮游生物群落特征及与环境因子的相关性分析

为了解山东半岛南北两侧的烟台崆峒岛(KTD)海域和日照东港(DG)海域真核浮游生物群落特征,采用高通量测序技术,以18S rDNA V4区为目标基因,对2017年10月至2018年7月两海域的真核浮游生物多样性进行了检测;同期测定两海域的环境因子(溶解氧、氨氮含量等10个理化指标),并与真核浮游生物丰富度做相关性分析。实验结果表明:通过高通量测序技术共鉴定出浮游生物455种,其中,KTD海域共检测出真核浮游生物36个门类424种;DG海域共检测出真核浮游生物34个门类365种。绿藻门(Chlorophyta)、硅藻门(Diatomea)是两海域浮游植物中整体丰度最高的门类。KTD海域,绿藻门各月丰度在3.0%—21.3%之间,其中2018年7月(K1807)最高,达到了21.3%;硅藻门各月丰度在2.0%—16.59%之间,其中2018年2月(K1802)最高,达到了16.59%。DG海域,绿藻门各月丰度在2.0%—12.3%之间,其中2017年11月份(D1711)最高,达到了12.3%;硅藻门各月丰度在2.0%—47.0%之间,其中1月(D1801)最高,达到了47.0%。占优势地位的浮游动物主要是节肢动物门类的物种,其每月丰度分别在6.0%—38.9%和7.6%—48.6%之间。环境因子相关性分析表明水温、DO、pH、硅酸盐、硝酸盐氮等环境因子为影响该海域浮游生物群落结构的主要因子。研究结果对了解双壳经济贝类养殖区饵料组成及其在时空的变化,对海岸带食物网、生态基础管理和海洋经济贝类养殖生产等方面提供数据支撑。     

军曹鱼的分子遗传特性研究

采用随机扩增多态性DNA(RAPD)和线粒体DNA(mtDNA)的限制性片段长度多态性(RFLP)分析方法对广东湛江近海军曹鱼Rachycentron canadum的分子遗传学特征进行了研究。RAPD研究结果显示17个引物共检测到119个位点,其中多态位点比例P为80．85％,遗传相似系数S为0．7400,遗传距离D为0．2600,Nei基因多样性指数H为0．3009,Shannon信息指数I为0．4498。结果表明,军曹鱼的遗传多样性比较丰富。用19种识别5、6碱基的限制性内切酶对军曹鱼的mtDNA RFLP进行了分析研究,构建其mtDNA物理图谱;用引物5’-GTG ATC TGA AAA ACC ACC GTT G-3’和5’-AAT AGG AAG TAT CAT TGC GGT TTG ATG-3’扩增线粒体细胞色素b区段,得到稳定的850bp大小的特异性条带,用18种识别4-6碱基的限制性内切酶对扩增片段的限制性长度多态性进行分析,并测定其序列。