基于形态参数和AFLP标记的文蛤(Meretrix meretrix)不同地理群体遗传变异分析

应用方差分析和Tukey多重比较对文蛤的辽宁(LN)、山东(SD)、江苏(JS)、广西(GX)4个自然地理群体的7个壳形态参数进行了研究,结果发现,SD和JS群体间差异不显著,LN和Gx群体差异不显著,Gx群体与SD和JS群体间差异显著(P<0.05).利用4对引物组合对这4个群体进行了AFLP扩增,共得到236个位点,其中特有位点14个,这些特有位点可作为群体鉴别的特征性标记.遗传多样性分析表明,4个文蛤群体的遗传多样性水平均较高,而以Gx群体最高,Nei's基因多样性指数和Shannon's多样性指数分别达到0.2636、0.3961,sD群体最低.分别为0.2308、0.3462.从群体间遗传距离和NJ法构建的亲缘关系谱系图来看,LN和SD群体的遗传距离最近(0.0394),首先聚在一起,而Gx群体与其他3个群体间都较远(0.1271-0.1586),单独分出一支,这说明Gx群体已发生了明显的遗传分化,用它与其他3个群体杂交可望较大幅度地提高遗传多样性水平.     

我国沿海不同地理原种文蛤(Meretrix meretrix)的SRAP分析

采用序列相关扩增多态SRAP(Sequence-related amplified polymorphism)标记对国家级江苏文蛤良种场(筹)保存的广西北海(GX)、江苏南通(JS)、辽宁大连(LN)三个地理种群原种文蛤进行种质资源分析。结果表明:(1)15对引物在文蛤3种群共扩增223个位点,其中多态位点数为159个,多态性位点百分率为71.30%,显示了较高的多态性;(2)GX、JS、LN3种群的多态性位点百分率分别为69.12%、57.81%、51.85%,平均杂合度分别为0.2532、0.2162、0.1836,香农信息指数分别为0.3649、0.3127、0.2714,均以GX种群最高,表明GX种群遗传多样性更为丰富;(3)3种群扩增位点显性基因频率的分布规律揭示,与LN和JS两种群相比,GX种群中低频基因位点显著增加,而隐性纯合基因位点显著减少,表明GX种群中存在大量稀有等位基因。各地理种群原种文蛤遗传多样性水平相对较高,遗传改良潜力大,GX种群作为选择育种的基础群更为适合。     

红壳色文蛤选育子代各壳色的形态分化及养殖效果的比较

以红壳色为目标性状,于2009年进行了文蛤(Meretrix meretrix)的群体选育研究,建立了红壳色选系子一代(Fl),对子一代壳色种类、分布频率及其数量性状进行了统计、测量和分析,并对各壳色的形态、生长速度做了研究.结果表明,文蛤壳色具有多态性,红色、黄色、白双、黄双、波纹的分布频率分别为75.58%、8.55%、0.53%、14.83%、0.50%.红壳色亲本的子代中出现红色∶花色=3∶1,符合孟德尔遗传模式.聚类分析与欧氏距离矩阵结果表明,文蛤波纹与黄色遗传距离最近,白双与黄双遗传距离相近,与红壳色的遗传距离最远.主成分分析显示白双文蛤与黄双文蛤在空间分布上相对重叠,波纹文蛤与黄色文蛤具有较高的重叠率,而红壳色文蛤相对分散,从而进一步说明5种壳色文蛤的遗传距离关系.经过1a同池养殖,子代壳长多数已达到10～30 mm,红壳色文蛤的日生长率为0.20%,花壳色文蛤的日生长率为0.18%,且红壳色文蛤的相对比较生长速度比花壳色文蛤快10.41%.红壳色文蛤选育子代的壳长与壳宽、壳高、粒重存在一定的回归关系.红壳色文蛤壳长对壳宽、壳高、粒重的回归方程分别为:y1=0.502 4x1-0.556 0(R2=0.992 0)、y3=0.8103x3+0.620 0(R2=0.995 6)、y5=0.000 3x25.9029(R2=0.991 9),花壳色文蛤壳长对壳宽、壳高、粒重的回归方程分别为:y2=0.495 3x2-0.419 2(R2=0.990 9)、y4=0.798 5x4+0.793 5(R2=0.995 6)、y6=0.000 4x26.845 8(R2=0.993 4).研究结果为文蛤的红壳色定向选育奠定了理论基础.     

不同花纹文蛤(Meretrix meretrix)的ITS2分析

采用分子生物学方法,进行了江苏和广西两个地区不同花纹文蛤群体的核糖体DNA转录间隔区(ITS2)的序列分析研究。结果表明,广西的文蛤群体和江苏的群体相比较,仅发现江苏群体在333—336bp处发生了缺失,江苏群体内不同花纹文蛤个体间的ITS2也发生了变化。聚类分析结果证实了序列分析结果,广西文蛤群体和江苏文蛤群体间发生了遗传变异,江苏文蛤群体内部也发生了遗传分化。     

4个文蛤群体鲜味物质比较分析

以江苏文蛤(Meretrix meretrix)为研究对象,采集红壳色文蛤原种、黄壳色文蛤原种、红壳色文蛤选育F1、红壳色文蛤选育F2 4个群体,检测其主要非挥发性鲜味物质成分单磷酸腺苷(AMP)、单磷酸鸟苷(GMP)、次黄嘌呤核苷酸(IMP)、琥珀酸、游离氨基酸、无机离子(Na~+、K~+、Cl~–、PO_4~(3–))的含量,并通过味道强度值(TAV)评价其呈味作用。鉴于核苷酸与氨基酸在呈味方面的协同效应,采用味精当量(EUC)评价不同文蛤群体的鲜味品质。结果表明,文蛤软体组织中AMP、琥珀酸、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、Na+、K~+、Cl~–的TAV值大于1,是文蛤鲜味的主要贡献者;红壳色文蛤原种的鲜味强度最大(4.92 g/100g),其子代红壳色文蛤F1(4.08 g/100g)、红壳色文蛤F2(4.09 g/100g)稍有降低,但仍显著高于黄壳色文蛤原种(3.34 g/100g)(P0.05),表明江苏红壳色文蛤在鲜味品质方面具有相对稳定的较高品质。     

文蛤(Meretrix meretrix)C-型凝集素基因的分子克隆及表达分析

C-型凝集素是一种重要的模式识别蛋白,本研究以文蛤为材料。利用PCR扩增和RACE技术首次获得了编码文蛤C-型凝集素的基因(Mm-CTL)c DNA序列,全长为1855bp,其开放阅读框为519bp,编码172个氨基酸。Smart软件预测Mm-CTL的糖识别结构域(CRD)从第34个氨基酸到第168个氨基酸。BLASTP序列相似性分析显示,Mm-CTL与大竹蛏氨基酸序列同源性最高,相似性为56.5%,与其它无脊椎动物的相似性为13.5%—23.9%。系统进化树分析与同源分析结果一致,其中Mm-CTL与双壳类C-型凝集素聚在一起,与大竹蛏亲缘性最近。环境胁迫实验显示,溶藻弧菌感染6h时Mm-CTL表达量明显上升,在12h时达到最高值,随后有所下降。盐度胁迫时Mm-CTL在盐度5时表达量相对较低,在盐度10—20中的表达量相对较高。温度胁迫时Mm-CTL在35°C时表达量相对最高,10°C时表达量明显较低。研究结果表明,文蛤应对环境因子影响可通过调节Mm-CTL的表达来应答免疫反应。本研究将为贝类先天性免疫因子研究以及病害的防控奠定基础。     

坛紫菜品系间遗传差异的RAPD分析

利用RAPD技术对六个坛紫菜品系进行了研究,从107条随机引 物中筛选10条随机引物,一共扩增出93条可重现的片段。经统计分析,六个品系间的遗传相 似系数在0.246～0.636之间。其中浙江北部沿海栽培品系间的相似系数最高为0.636.地 域间品系的遗传相似系数最低为0.246。六个品系用UPGMA方法得到的聚类关系符合传统的地 域和表型关系。通过对照品系间有稳定差异的DNA条带,表明RAPD标记是坛紫菜品系鉴定和 遗传多样性分析的有效手段。     

华贵栉孔扇贝四种壳色选育系F1遗传多样性的AFLP分析

用10 对AFLP 选择性扩增引物, 对4 种壳色华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis)选育系的F₁代群体(每种壳色30 个, 共120 个个体)进行了遗传多样性分析, 共扩增出414 个位点, 多态性位点352 个, 比例为85.02%; 紫顶枣褐、枣褐、紫白、橘黄4 种壳色群体多态性位点比例分别为72.83%、86.04%、83.47%、67.35%; Nei’s基因多样性指数(H)分别为0.3071、0.3494、0.3358、0.3077; Shannon’s 信息指数(I)分别为0.4607、0.5139、0.4987、0.4525。4 个群体间的平均遗传分化系数(G_st)为0.1739, 遗传杂合度(H_e)为0.3954, 遗传距离(D)变化范围在0.1194～0.1720 之间; 聚类分析表明, 4 种壳色选育系间的亲缘关系由近及远依次为紫白、枣褐、橘黄和紫顶枣褐壳色。研究表明, 四种壳色选育系均具有较高的遗传多样性, 各壳色群体间存在一定分化, 继续选育潜力大。     

我国沿海三个文蛤地理群的RAPD分析

利用RAPD技术分析了我国沿海辽宁、江苏、广西省3个文蛤地理群的遗传变异,总共用60个随机引物进行了RAPD扩增,其中50个随机引物得到了扩增产物,选取其中15个随机引物的扩增图谱进行相似性系数和遗传距离的计算,结果为辽宁(LW)、江苏(JW)、广西(GW)群体内的遗传距离分别为:0.169±0.034,0.117±0.032,0.108±0.031.LW,JW之间为0.222±0.036;JW,GW之间为0.209±0.043;LW,GW之间为0.316±0.047,同时发现引物s396-900bp的标记为JW和LW所特有;引物s433-250bp标记为JW和GW所特有,由此可作为这3个地理群的分子标记.     

厚壳贻贝(Mytilus coruscus)4 个群体遗传多样性的 ISSR 分析

采用ISSR分子标记对中国沿海4个厚壳贻贝群体进行遗传多样性和遗传结构分析,筛选出13条引物对4个群体120个样品共扩增出192个清晰的扩增位点,其中多态位点188个,多态位点百分率为97.92%,在物种水平上遗传多样性较为丰富。群体遗传多样性结果表明,PPL在81.77%—89.58%之间,H在0.2950—0.2818之间,I在0.4213—0.4447之间,其中福州群体多样性指数最低,温州群体最高。4个群体间GST为0.1519,Nm值范围介于3.0576—5.9714之间,AMOVA分析显示遗传变异主要来自群体内个体间。群体间遗传距离和聚类分析显示,温州群体和宁德群体首先聚为一支,再与舟山群体聚类,最后与福州群体聚在一起。表明地理位置较远的群体,遗传距离也较大,地理距离和遗传距离一致。     

不同花纹文蛤(Meretrix meretrix)的外套膜蛋白质的双向电泳研究

采用双向电泳技术,对浙江乐清无花纹和有花纹文蛤外套膜的全蛋白进行了研究,并利用质谱和软件对差异蛋白进行了分析。经PDQuest软件分析,在pH4—7,分子量14.3—200kD之间,无花纹文蛤样品中检测到682±24个蛋白质点,有花纹样品检测到600±35个蛋白质点,平均匹配率为84.5%。研究结果显示,两种文蛤共有256个点存在差异表达,这些差异点可能与贝壳的颜色和花纹形成有关。其中98个点为无花纹文蛤特有,57个点为有花纹文蛤特有,另有101个点在表达量上存在两倍以上差异。在无花纹贝壳中发现分子量为42kD左右,等电点为6.4左右,与库蚊的肌动蛋白(分子量为41.7kD,等电点为5.3)匹配率较高;分子量为29kD,等电点为5.6,与飞鱿的肌动蛋白(分子量为29kD,等电点为5.25)匹配率较高的两个蛋白质。在有花纹文蛤中发现了分子量为27kD左右,等电点为4.8,与丽文蛤属的肌浆钙结合蛋白(分子量为20.8kD,等电点为4.98)匹配率较高。     

文蛤(Meretrix meretrix)精子的超微结构及精子入卵过程的电镜观察

利用透射电镜和扫描电镜对文蛤精子的超微结构及精子入卵过程进行了详细观察。结果显示,文蛤精子为典型的原生型,由头部、中段和尾部三部分组成,全长45—50μm。头部呈狭茧形,长约3.0μm,由顶体和细胞核组成,顶体呈倒"V"字形,前端有短柱状的凸起;细胞核为稍弯曲的圆柱形,内含高度浓缩的染色质,无核前窝,有核后窝。中段较短,仅0.6—0.7μm,由线粒体围绕中心粒复合体构成,5个圆球形的线粒体呈单层梅花状排列,内部为双层膜折叠成的片层状结构;中心粒复合体由近端中心粒和远端中心粒组成,而远端中心粒延伸出尾鞭的轴丝。尾部为细丝状鞭毛,长约42—45μm,内部的轴丝呈典型的"9+2"结构,外周有波浪状质膜包被。用扫描电镜观察了文蛤精子的入卵过程,大致将其分为顶体反应期、穿卵期和卵膜修复期。受精后2min,精子发生顶体反应,顶体泡破裂释放溶解酶使卵膜变得疏松,亚顶体腔中伸出的顶体丝先穿透卵膜;受精后4—6min,在精、卵的共同作用下,精子头部和中段逐渐穿过卵膜进入卵内,在卵膜上形成一个直径约1.5μm的孔道,而精子尾部则留于卵外;受精后8—10min,精子尾部脱落,受精形成的孔道被卵膜的微绒毛修复。另外对多种双壳贝类精子超微结构和线粒体入卵等问题进行了探讨。     

文蛤(Meretrix meretrix)铁蛋白的重组表达及其组织表达特征分析

构建了文蛤铁蛋白的重组表达质粒 pGEX-4T-1-MmeFer, 在大肠杆菌 Escherichia coli 中获得了重组蛋白, 经酶解和质谱鉴定该蛋白为重组文蛤铁蛋白(rGST-MmeFer), 切除 GST 标签的重组文蛤铁蛋白(rMmeFer)具有氧化和吸收铁离子的功能。利用 rGST-MmeFer 制备了兔抗文蛤铁蛋白的多克隆抗体, 进而利用 Western blot 的方法对文蛤铁蛋白的组织表达分布进行了研究。结果表明, 铁蛋白在文蛤各组织中均有分布, 其中消化腺中表达量最高, 足中表达量最低。此外, 利用实时定量PCR 分析了文蛤消化腺、外套膜和鳃组织中铁蛋白 mRNA 的表达, 发现铁蛋白 mRNA 在外套膜中表达量最高, 消化腺次之, 鳃中表达量最低, 差异达到显著水平(P<0.05)。上述结果为进一步研究铁蛋白参与贝类贝壳形成的分子机制奠定了基础。     

红壳文蛤双列杂交及杂种优势分析

以广西(G)、江苏(S)和日本(J)3个文蛤群体中原种红壳文蛤进行双列杂交,获得了试验家系(Gg、Ss、Gs、Gj、Sg、Sj),比较其生长性能,并评估杂种优势。从生长来看,浮游期杂交组的日生长率大于自繁组;以江苏文蛤为母本的组合的壳长均显著大于以广西文蛤为母本的组合(P0.05),壳长受卵源影响极显著(P0.01)。稚贝和幼贝期,杂交组的日生长率均大于自繁组,杂交组合Gs的日生长率从13日龄至149日龄均最大;交配方式对壳长极显著影响(P0.01)。从存活率来看,杂交组的存活优势更明显,Gs的存活率几乎均最高。从杂种优势来看,杂交组从13日龄以后具明显的杂种优势,尤其是Gs在1—149日龄均呈正值。广西群体和江苏群体间建立了完全2×2双列杂交,中亲杂种优势一直大于0,且始终介于单亲杂种优势HGs和HSg之间。杂种优势潜力指数(hp)表明,1—5日龄的数值介于–1和1之间,未产生杂种衰退;13日龄后的数值均大于1,表明真正获得了杂种优势。杂种获得(hg)及13日龄后的超亲优势率均为正值,进一步说明壳长性状得到了明显改良。从壳色来看,子代的红壳个体占比为72.80%—76.49%,均得到明显提高。总之,杂交组合Gs的杂种优势最明显,为开展3个群体的杂交育种提供了参考依据。     

马氏珠母贝(Pinctada martensii)四种壳色选育系F5 的生长及遗传多样性分析

采用跟踪测量和微卫星(SSR)技术研究了马氏珠母贝四种壳色选育系F5和对照组的存活率、生长情况及遗传多样性。结果表明,四种壳色选育系和对照组的生长性状之间均存在显著差异(P<0.05)。从30对微卫星引物中扩增筛选获得8个多态位点,多态位点比例为26.67%,它们在4个壳色选育系共120个个体中产生了42个等位基因,平均每个多态位点产生5.25个。4个选育系的平均期望杂合度范围为0.6622—0.6850,平均观察杂合度范围为0.2708—0.4667,平均多态信息含量PIC值范围为0.6025—0.6190,说明4个选育系的遗传多样性处于较高水平,具有育种潜力;平均遗传偏离指数均为负值,4个选育系均存在不同程度的杂合子缺失。遗传分化和遗传距离分析表明白壳色选育系与红壳色选育系之间的亲缘关系最近,黑壳色与白壳色之间的遗传距离最大。     

中国沿海7个长蛸(Octopus variabilis)群体COI基因的遗传变异研究

采用线粒体DNA细胞色素氧化酶亚基I(COI)基因序列测定技术分析了中国沿海重要经济头足类长蛸7个野生群体的种群遗传结构及其变异。结果表明,我国长蛸资源存在相对丰富的遗传多样性,635bp长度的核苷酸片段共检测到74个多态位点,多态位点比例达11.7%,检测的108个个体中共获25个单倍型,单倍型多样性指数(H)达0.342—0.934,平均核苷酸多样性指数(Pi)达0.0008—0.0055,高于多数海洋头足类的遗传变异。对7个群体的遗传结构进行检测表明,我国的长蛸群体间存在显著的遗传分化(P0.05),遗传结构基本符合脚踏石模型。7个群体可明显聚类为3个类群,类群间分化系数Fst达0.8858(P0.01),基因流大大小于1;AMOVA检测和单倍型网络关系图也证实了上述类群的分化。遗传距离分析表明,由厦门群体组成的类群与其它2类群间的遗传距离达到0.086—0.098,可能达到了亚种的分化。     

华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis)壳色与闭壳肌颜色遗传规律的研究

华贵栉孔扇贝壳色和闭壳肌颜色具有多态性,其中贝壳的桔黄色表型和闭壳肌的黄色表型具有重要的经济价值,是选择育种中的重要目标性状,对这些性状遗传规律的研究可为选择育种提供理论依据。采用自交、正反杂交和卡方检验方法对华贵栉孔扇贝的桔黄色与枣褐色等2个壳色和黄色与白色等2个闭壳肌颜色的遗传规律进行了研究。结果表明,华贵栉孔扇贝贝壳颜色和闭壳肌颜色均属质量性状,受基因控制,可以遗传,不受环境影响;贝壳桔黄色表型对枣褐色表型为显性;闭壳肌白色表型对黄色表型为显性;壳色和闭壳肌颜色为两个互不连锁的独立性状,在后代遗传过程中可以自由组合,独立遗传,不受母性影响;枣褐色贝壳或黄色闭壳肌个体均为隐性纯合体,其后代性状均与亲代相同;由于不能确定桔黄色贝壳或白色闭壳肌个体属于显性纯合还是杂合,显性纯合家系的获得必须通过建立家系并繁育2代才能实现。