红藻分子生物学研究进展I基因、基因组织与基因工程

分子生物学研究始于20世纪50年代,首先在原核生物中取得重大进展.从原核基因克隆到利用原核基因产品的商业生产,从大肠杆菌分子遗传特性的阐明,到对其改造利用.随后分子技术从原核扩展到真核,从动物到植物,从陆地走向海洋,人们对于生命现象本质的认识也不断加深.藻类分子生物学是从80年代以后才逐渐兴起,藻类分子水平研究首先在蓝藻中取得重大突破,而真核藻类,则多是以衣藻作为模式生物的研究,红藻的分子水平研究,从其内容的深度和广度来说,相对落后.作者对近年来红藻分子生物学研究在基因方面的研究进行综述.     

淋巴囊肿病毒锌指蛋白基因lcn140的原核表达与结构分析

应用生物信息学分析方法,预测到中国牙鲆淋巴囊肿病毒分离株(LCDV-cn)的lcn140基因编码锌指蛋白.为了进一步研究lcn140基因的功能,本文对lcn140基因进行了原核表达与结构分析.首先将lcn140基因克隆到pET24a(+)原核载体,再以E.coli BL21(DE3)为宿主菌表达目的蛋白;通过生物信息学软件分析,了解其结构与序列特征.结果表明,lcn140基因在原核载体中得到成功表达,表达的his标签融合蛋白主要以包涵体形式存在;在结构和序列方面,lcn140基因编码C3H1型锌指蛋白,其含有4个C3H1锌指结构和4段简单重复序列.该结果为LCDV-cn的发生、发展提供了分子基础.     

中国科学院海洋研究所海藻分子生物学与基因工程研究进展

海藻分子生物学从生物大分子的角度研究海藻的个体发育与系统发育，从分子水平上揭示海藻起源、进化及其生命现象、生命过程的规律、本质以及机理。中心法则是其主要研究思想。以基因的复制和突变演绎遗传、变异与进化；以基因的表达与调控解释代谢、分化与发育。用操作分子的手段研究、揭示生物学规律。海藻基因工程是在分子生物学理论基础上，通过重组ＤＮＡ技术人工构建栽培海藻新品种，以及实现海藻天然产物的基因工程生产［１］曾呈奎等在１９９０年召开的国际盐田生物技术研讨会上提出了海藻生物技术的概念是有目的地利用以及定向改造…     

副溶血弧菌trh基因的克隆、表达及基因缺失株的构建

利用PCR方法从VP基因组DNA中扩增出trh溶血素基因,构建了大肠杆菌原核表达载体,对trh进行了表达和纯化,经溶血活性检测,复性蛋白具有溶血活性.同时还构建了trh基因缺失株,对trh基因进行了基因敲除研究.结果表明,单独敲除trh基因并不能够影响菌株的溶血活性,说明副溶血弧菌还存在其它溶血素基因.     

大黄鱼β2-微球蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的重组表达

主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）是一类高度多态的基因群,它广泛分布于各种脊椎动物体内,在启动特异性免疫应答中起关键作用．MHC根据结构分为Ⅰ型和Ⅱ型两种．β2-微球蛋白（β2mcroglobulin,β2m）是MHCI型分子的轻链．本文根据大黄鱼β2m的表达序列标签（expressed sequence tags,EST）序列设计合成了特异性引物,利用RT—PCR技术从大黄鱼脾脏组织中克隆了β2m基因（Pscr-β2m）;构建了合β2m因的原核表达载体（pGEX4T-2-β2m,在0．1mmol／dm^3IPTG诱导下重组β2m得到了表达;采用Sepharose 4B亲合层析纯化目的蛋白并制备了抗体;Western—blotting分析证实了该抗体具有与天然大黄鱼脾脏组织中β2m蛋白反应的特性．这些结果为进一步研究鱼类β2m构与功能的关系,以及制备MHCI类分子四聚体奠定基础．     

鲨肝刺激物质类似物基因在大肠杆菌中的表达与产物活性分析

构建了鲨肝刺激物质类似物基因片段的原核表达载体质粒 (pET-sHSS) ,转化大肠杆菌后通过IPTG诱导获得原核表达产物 ,并利用凝胶层析方法对表达产物进行了分离纯化 ;进一步利用MTT比色法研究了该重组产物对肝癌细胞株SMMC -7721的增殖影响。结果表明 ,在1mmol/L的IPTG的诱导下 ,鲨肝刺激物质类似物基因片段在大肠杆菌BL21菌株中获得表达 ,表达产物的相对分子质量大小约为17500u,占菌体可溶性蛋白总量的38%左右 ;纯化后的产物在低浓度下 (<50ng/L)具有明显刺激SMMC7721细胞株增殖的活性 ,高浓度下 (>100ng/L)则明显抑制该肿瘤细胞株的生长 ,与天然鲨肝刺激物质的生物活性类似     

条斑紫菜锰超氧化物歧化酶原核表达及多克隆抗体制备

研究紫菜抗逆的分子机制,将本实验室克隆的条斑紫菜(Porphyra yezoensisUeda)锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,Mn SOD)基因全长cDNA克隆到质粒pET-30c(+)中,构建原核表达载体pET-S,转化大肠杆菌BL21(DE3)表达Mn SOD,表达产物的分子量约为30 KDa。利用不同浓度的Mn2+诱导重组Mn SOD的表达,可以检测到比活力随Mn2+浓度增高而上升的趋势。用重组Mn SOD免疫新西兰大白兔,制备了多克隆抗体,多克隆抗体的效价为1∶8 000。免疫印迹实验(Western Blot)表明该多克隆抗体具有很好的特异性。     

海水促熟太平洋牡蛎卵子受精的细胞学观察

利用铁－苏木精染色、整体封片的方法,观察了太平洋牡蛎卵子经海水浸泡促熟后的受精过程。生发泡尚未破裂的卵子,经海水浸泡后可以发育到第一次成熟分裂中期。受精后１０～１５ｍｉｎ,放出第一极体;受精后２０～２５ｍｉｎ,放出第二极体;之后,形成雌、雄原核,两性原核以染色体联合的方式结合于纺锤体的赤道面上,准备第一次卵裂。有多精入卵现象并能形成多个原核,但不能正常卵裂。那些经浸泡后生发泡仍未破裂的卵子,将不能     

牙鲆多聚免疫球蛋白受体基因的克隆、表达及鉴定

采用PCR扩增、构建重组高效表达载体的方法,进行了牙鲆多聚免疫球蛋白受体(pIgR)基因的克隆、原核表达研究,并利用SDS-PAGE、western-blot及ELISA方法对纯化的重组蛋白特性进行了分析。结果表明,PCR扩增出pIgR开放阅读框(ORF)基因全长为1005 bp,所构建的pET-32(a)-pIgR重组质粒经PCR和双酶切鉴定含有ORF全长基因。SDS-PAGE结果表明,表达的目的蛋白相对分子质量为58 kDa,与理论预期值一致,IPTG诱导6h后表达量趋于稳定,经亲和层析纯化得到高纯度的重组蛋白。Western-blot结果表明,重组pIgR能够与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性反应;ELISA结果表明重组pIgR能够与牙鲆IgM发生特异性结合。本研究获得了纯化的重组pIgR,证明其具有IgM结合活性,为下一步研究牙鲆pIgR的转运机制及在黏膜免疫防御中的作用机理提供了分子基础。     

古海洋与古气候演化的生物标志化合物记录

海洋沉积中的生物标志化合物记录了不同时空尺度下海洋与气候变迁的历史。从这些地质档案中，运用分子有机地球化学的理论与方法提取古环境参数，辅以各种方法的定年技术建立时间标尺，可以反映从区域到全球，不同时间分辨率下的环境演变。本文以古海水表现温度的分子地层记录以以及有要分子碳同位素组成作为古大气ＣＯ２分压的指标为例，阐述分子有机地球化学在古全球变化研究中的最新进展。     

裂殖壶菌pks2基因启动子序列扩增及其活性分析

针对目前裂殖壶菌(Aurantiochytrium limacinum)基因工程相关研究中,对内源启动子的了解和利用仍处在初步阶段的现状,本研究从裂殖壶菌中产多不饱和脂肪酸的主要途径聚酮合酶(PKS)途径出发,利用热不对称交错PCR技术(TAIL-PCR),针对pks2基因扩增出了未知的5’端侧翼序列,初步分析得到pks2基因启动子序列,并分别在原核宿主大肠杆菌(Escherichia coli)与真核宿主酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中对启动子活性做进一步研究,发现了pks2基因启动子可以在大肠杆菌和酿酒酵母中有效启动绿色荧光蛋白的表达,而且pks2基因启动子相较于pks1、pks3基因启动子具有更高的启动活性,显现出了其作为启动子用于基因工程研究的可操作性。     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)蛋白质二硫键异构酶SmPDIA3的表达分析和功能验证

本研究利用SMART-RACE技术克隆了大菱鲆SmPDIA3基因。SmPDIA3基因cDNA序列全长2083bp,包括1479bp的开放阅读框,编码492个氨基酸,GenBank登录号：MG765516。组织表达分析发现：SmPDIA3基因在肠、鳃、肝脏等组织中均有表达,其中在肝脏中表达量最高,脑中最低。进一步研究了温度胁迫后SmPDIA3基因在肠和肝脏组织中的表达变化规律,发现随着胁迫温度的升高,SmPDIA3基因的相对表达量总体上升,并在28℃时达到最大。利用原核表达技术,构建了pET-28a-PDIA3原核表达载体,IPTG诱导后融合蛋白主要在上清中表达。将上清中的蛋白分离纯化后,利用Western blot技术验证了目的蛋白的准确性。将纯化后的目的蛋白浓缩后,利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测得蛋白浓度为243.18μg/mL。最后设计变性溶菌酶的复性实验,验证了SmPDIA3蛋白具有分子伴侣功能,能够辅助变性蛋白的正确折叠。     

基因突变与抗突变

从“孟德尔定律”（Ｍｅｎｄｅｌｌａｗ）重新发现（１９００年）到今日，遗传学（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）的发展已经走过了近１个世纪的历程。从早期的以孟德尔学说为代表的经典遗传学，到以摩尔根学派（Ｔ．Ｈ．Ｍｏｒｇａｎｓｃｈｏｏｌ）为核心的细胞遗传学，再到今日以Ｊ．Ｄ．Ｗａｔｓｏｎ和Ｆ．Ｈ．Ｃ．ＣｒｉｃｋＤＮＡ双螺旋结构为基础的分子遗传学（基因工程），整个遗传学经历着从个体水平、细胞水平到分子水平的转变和突飞猛进的发展，成为当代生物科学中最活跃、最富有生命力和最激励人心的领域。然而就整个遗传学的核心而言，还是…     

中国对虾细胞色素P450基因CYP4原核表达条件优化

根据克隆得到的中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）CYP4基因开放阅读框设计引物,构建了中国对虾CYP4基因原核表达载体p28a-CYP4,并对重组菌株Rosetta／28a-CYP4的原核表达条件进行了优化。结果表明：p28a—CYP4转化Rosetta后可实现CYP4基因的原核表达,SDS—PAGE分析显示其在56．0kDa处有显著诱导条带;通过对诱导温度、IPTG浓度、诱导时机（OD600）及诱导时间的优化表明,重组菌株Rosetta／p28a-CYP4的最佳诱导温度为37℃,最佳IPTG浓度为1．2mmol／L,最佳诱导时机及诱导时间分别为0．59和6h。     

罗非鱼源无乳链球菌（Streptococcusagalactiae）Sip基因的克隆、鉴定及分子特性分析

利用设计的特异性引物,扩增出了分离自患病罗非鱼无乳链球菌强毒株Sip基因,并将其克隆到pMD19-T载体上,之后对重组质粒进行了PCR和双酶切（BamHⅠ＋HindⅢ）鉴定,并利用多种生物信息学软件对Sip基因进行分子特性分析。结果显示,罗非鱼源无乳链球菌Sip编码氨基酸序列具有极高保守性,与人源、哺乳动物源无乳链球菌...     

铁质宇宙尘中的有机分子的发现

于1983年5－7月，利用向阳红16号考察船在太平洋7—11°N，167－178°W海域进行锰结核调查，从深海沉积物中分离出大量字苗尘（或称宇宙球粒）。此后对宇宙尘进行了全面研究，取得一定进展。最近，又利用激光拉曼分子探针测定了铁质宇宙尘中的分子组成。结果表明，铁质字宙尘中除了含有Fe－Fe，Fe3＋O，Fe－Ni，Al－O，Fe－Obr－Si和Si-Onb分子外，还含有较丰富的C－H－O和C－H－S－O有机分子，无定形碳C=C和C=C，CH2，CH3和挥发分子CO2，H2O，OH－，H2S，SO2等。这些成份与刍星尘埃的分子成分相一致。这一结果对于深入研究行星际尘埃微粒的起源以及探索生命物质的起源都具有重要意义。     

中国对虾素在大肠杆菌(Escherichia coli)中的重组表达

中国对虾素是从中国对虾血细胞中克隆得到的一种抗菌肽。为了进一步研究中国对虾素(CHP)的功能并为制备特异性抗体作准备，采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法，进行了对虾素原核表达的研究。根据从中国对虾血细胞中克隆得到的对虾素基因设计特异性引物扩增中国对虾素成熟肽基因(CHP)，插入原核表达载体pGEX-4T-1中，在E．coli BL21表达融合蛋白GST-CHP．结果表明，不同表达菌株的融合蛋白表达量为30％—34％，同一菌株在诱导5h后能达到最高表达量。利用GST亲和层析纯化融合蛋白，将融合蛋白用凝血酶裂解以得到CHP，其分子量约为5．6kDa，N-端测序结果与期望的成熟对虾肽序列一致。用液体生长抑制方法检测活性，表明重组GST-CHP蛋白及CHP均表现出对大肠杆菌的抑菌活性。     

鱼用基因工程疫苗研究与应用

免疫预防是通过刺激鱼类免疫系统 ,使其产生特异的免疫反应来增强鱼体的抗病能力 ,从而降低由疾病引起的损失。10年前 ,人们预测建立在基因工程技术基础之上的鱼用重组疫苗将会弥补传统疫苗的不足 ,能够有效的预防水生动物疾病的发生 ,基因工程疫苗能够预防从病毒、细菌到寄生虫所引起的疾病 ,与传统疫苗相比 ,基因工程疫苗更为安全可靠。鱼类基因工程疫苗的研究已有10多年 ,有必要对其作一全面的了解。1基因工程疫苗的特点基因工程疫苗是用基因工程方法或分子克隆技术分离出病原的保护性抗原基因 ,将其转入原核或真核系统并表达出该病原的…     

稀杯盔形珊瑚钙网蛋白基因的克隆及功能分析

钙网蛋白（calreticulin,CRT）是高度保守的内质网钙结合蛋白和分子伴侣,主要参与调节钙离子水平和指导蛋白质正确折叠。在这里,我们克隆稀杯盔形珊瑚（Galaxea astreata）的CRT基因,命名为Gacrt,并分析其促进细菌凝集的能力。Gacrt全长1792bp,其中5’端非翻译区(5''UTR)为77 bp,3’端非翻译区(3''UTR)为380bp,开放阅读框(ORF)1335bp,编码444个氨基酸残基,包含信号肽结构域、内质网检索信号序列（KDEL）、两条保守的钙网蛋白家族结构和一组三重复序列。通过构建原核表达系统得到CRT重组蛋白,纯化后的重组蛋白可以促进革兰氏阳性菌藤黄微球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌凝集,具有细菌凝集活性,支持GaCRT作为免疫相关分子参与机体对细菌防御的观点。     

深海的化能自养生物

地球初期缺氧,最早的光能自养生物是原核生物,以H_(2)S为电子源。以后从原核蓝绿藻进化到真核植物,以H_(2)O为电子源,合成副产物不再是硫,而是氧。所以化能自养生物在进